The effect of ionising radiation upon the cellular DNA

Promieniowanie jonizujące, stosowane w radioterapii, może oddziaływać bezpośrednio z cząsteczką DNA, wywołując jonizację zasad – jest to tzw. efekt bezpośredni lub poprzez radiolizę cząsteczek wody obecnych w komórce – jest to tzw. efekt pośredni [1]. Niniejsza praca koncentruje się na omówieniu skutków efektu pośredniego.
Pod wpływem promieniowania jonizującego cząsteczka wody ulega radiolizie, której produktami są: uwodniony elektron (e-aq) i kationorodnik cząsteczki wody (ang. water radical cation) H₂O^•+. Ulegają one szybkiemu rozpadowi tworząc rodnik hydroksylowy:

H₂O + hv -> H₂O^•+ + e^-_aq
H₂O^•+ + H₂O -> H₃O⁺ + ^•OH
e^-_aq
->H^• + OH-

Drugą możliwością jest homolityczny rozkład wody i powstanie H^• oraz rodnika hydroksylowego:

H₂O + hv -> H₂O^• -> H^• + ^•OH

Zakończeniem tego procesu jest powstanie cząsteczki wodoru oraz nadtlenku wodoru [2].

Liczne dane eksperymentalne wskazują, że rodnik hydroksylowy jest uważany za główną, aktywną formę tlenu, odpowiedzialną za powstawanie większości oksydacyjnych uszkodzeń w DNA [3, 4]. Rodnik hydroksylowy ze względu na wysoką reaktywność oddziałuje z biomolekułami w miejscu swego powstania. Reaguje zarówno z cząsteczką deoksyrybozy, jak i z zasadami azotowymi, wchodzącymi w skład DNA. Reakcja z cząsteczką deoksyrybozy prowadzi do powstania pojedynczych i podwójnych pęknięć nici DNA [5]. Pojedyncze pęknięcia są stosunkowo szybko naprawiane, natomiast podwójne pęknięcie nici DNA naprawialne są rzadziej [5] i często mogą prowadzić do śmierci komórki [6, 7]. Generowanie wolnych rodników w bezpośrednim sąsiedztwie chromatyny może prowadzić także do tworzenia wiązań poprzecznych DNA-białko [8, 9].
W reakcji rodnika hydroksylowego z DNA najczęściej uszkadzane są zasady azotowe, czego konsekwencją jest powstanie wielu pochodnych, różniących się właściwościami tworzenia par zasad od wyjściowych substratów, a skutkiem tego mogą być mutacje [10]. Poszczególne zasady azotowe ulegają różnym modyfikacjom: guanina do 8-oksyguaniny i FapyGuaniny (2,6-diamino, -4-hydroksy-5-formamidopirymidyny); adenina do 8-hydroksyadeniny, 2-hydroksyadeniny i FapyAdeniny (5-formamido-4,6-diaminopirymidyny); cytozyna do 5-hydroksycytozyny, 5-hydroksyuracylu i 5,6-dihydroksyuracylu; tymina do glikolu tyminy, 5-hydroksymetylouracylu i 5-hydroksymetylohydantoiny [11,12]. Konsekwencją tych zmian są transwersje zasad azotowych, głównie GCŢTA, za które odpowiedzialna jest 8-oksyguanina [13–15]. Inny rodzaj uszkodzeń to transwersje GC->CG, spowodowane obecnością jeszcze niezdefiniowanej pochodnej guaniny (być może Fapyguaniny) [16]. Glikol tyminy powoduje blok replikacyjny [17]. Zdolność reagowania z zasadami azotowymi wykazują także inne wolnorodnikowe formy tlenu, np. tlen singletowy indukuje wybiórczo powstawanie 8-oksyguaniny [18]. Z danych literaturowych wynika, że w tkankach nowotworowych występuje zwiększona koncentracja H₂O₂ [19]. Łatwe dyfundowanie przez błony biologiczne pozwala na migrację H₂O₂ do jądra komórkowego i generowanie rodnika hydroksylowego (^•OH), powodując tym samym wyższy poziom oksydacyjnych uszkodzeń DNA [19]. Występowanie tego rodzaju uszkodzeń prowadzi do zaburzeń struktury chromatyny, co może wpływać na procesy naprawy, replikacji i transkrypcji DNA [3] zarówno w komórkach normalnych, jak i nowotworowych [20, 21]. Każdy ludzki genom haploidalny zawiera ok. 3 x 10⁹ par zasad. Sądzi się, że u człowieka jest ok. 10⁵ genów, a tylko 10 proc. DNA koduje białka. Funkcja pozostałych 90 proc. ludzkiego genomu nie jest jeszcze dokładnie określona [22, 23]. Za krytyczną objętość DNA przyjmuje się średnicę ok. 10 nm (nanometrów), co stanowi odległość dyfuzji wolnych rodników [24].
Przypuszcza się, że tylko uszkodzenie miejsc kodujących w DNA może doprowadzić do letalnego uszkodzenia komórki [15, 25]. Ponadto uważa się, że najbardziej wrażliwa na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem jonizującym, jest część DNA w miejscach odsłoniętych, pozbawionych białek histonowych. Promienioochronny wpływ białek histonowych i innych białek jądrowych związanych z DNA w czasie napromieniania, może polegać na usuwaniu wolnych rodników bądź może stanowić przeszkodę ze względu na krótki zasięg rodników [26, 27].

Liczba i rodzaje uszkodzeń w DNA jednej komórki pod wpływem promieniowania fotonowego dawką 1 Gy wynoszą odpowiednio [28, 29]:
^• uszkodzenie zasad >1 000,
^• pojedyncze pęknięcie ~1 000,
^• podwójne pęknięcie ~40.

Do czynników wewnątrzkomórkowych wpływających na liczbę uszkodzeń popromiennych można zaliczyć: konformację DNA, stężenie tlenu, obecność naturalnych radioprotektorów, takich jak tokoferol, glutation, kwas askorbinowy, bilirubina, kwas moczowy, melatonina. Do czynników zewnętrznych, od których zależy liczba uszkodzeń należy m.in. rodzaj promieniowania, wysokość dawki frakcyjnej i dawki całkowitej, schemat frakcjonowania dawki i moc dawki [24, 30, 31]. Stwierdzono, że liczba początkowych uszkodzeń popromiennych jest taka sama w komórkach proliferujących, jak i spoczynkowych, niezależnie od fazy cyklu komórkowego [32]. Natomiast liczba resztkowych uszkodzeń DNA jest różna w zależności od czasu pozostawionego na naprawę uszkodzeń i promieniowrażliwości komórek [33].
Niewątpliwie istnieje potrzeba prowadzenia badań doświadczalnych, obejmujących również badania kliniczne, które mogłyby przybliżyć odpowiedzi na wiele pytań związanych z odpornością komórek nowotworowych na radioterapię, jak również wrażliwością komórek zdrowych.
Piśmiennictwo
1. von Sonntag C. The Chemical Basis of Radiation Biology. New York: Taylor & Francis 1987.
2. Breen AP, Murphy JA. Reactions of oxyl radicals with DNA. Free Radic Biol Med 1995; 18: 1033-77.
3. Cooke MS, Evans MD, Dizdaroglu M, Lunec J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J 2003; 17: 1195-214.
4. Dizdaroglu M. Oxidative damage to DNA in mammalian chromatin. Mutat Res 1992; 275: 331-42.
5. Zdzieniecka MZ. Mechanizmy naprawy podwójnych pęknięć DNA (DSB) w komórkach ssaków: podstawy molekularne i konsekwencje biologiczne. Kosmos 1999; 48 359-65.
6. Igoucheva O, Alexeev V, Yoon K. Mechanism of gene repair open for discussion. Oligonucleotides 2004; 14: 311-21.
7. Wallace SS. Biological consequences of free radical-damaged DNA bases. Free Radic Biol Med 2002; 33: 1-14.
8. Oliński R, Nackerdien Z, Dizdaroglu M. DNA-protein cross-linking between thymine and tyrosine in chromatin of gamma-irradiated or H₂O2 – treated cultured human cells. Arch Biochem Biophys 1992; 297: 139-43.
9. Speit G, Hartmann A. The comet assay: a sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage. Methods Mol Biol 2004; 291: 85-96.
10. Tudek B. Mechanizmy naprawy utlenionych zasad DNA. Kosmos 1999; 245: 339-52.
11. Dizdaroglu M, Jaruga P, Birincioglu M, Rodriguez H. Free radical-induced damage to DNA: mechanisms and measurement. Free Radic Biol Med 2002; 32: 1102-15.
12. Oliński R. Dna damage induced by active oxygen species and its role in the carcinogenesis process. Postępy Hig Med Dośw 1993; 47: 463-74.
13. Cheng KC, Cahill DS, Kasai H, Nishimura S, Loeb LA. 8-Hydroxyguanine, an abundant form of oxidative DNA damage, causes G---T and A---C substitutions. J Biol Chem 1992; 267: 166-72.
14. Klein JC, Bleeker MJ, Saris CP, Roelen HC, Brugghe HF, van den Elst H, et al. Repair and replication of plasmids with site-specific 8-oxodG and 8-AAFdG residues in normal and repair-deficient human cells. Nucleic Acids Res 1992; 20: 4437-43.
15. Wallace SS. Enzymatic processing of radiation-induced free radical damage in DNA. Radiat Res 1998; 150 (5 Suppl): S60-79.
16. Ono T, Negishi K, Hayatsu H. Spectra of superoxide-induced mutations in the lacI gene of a wild-type and a mutM strain of Escherichia coli K-12. Mutat Res 1995; 326: 175-83.
17. Demple B, Harrison L. Repair of oxidative damage to DNA: enzymology and biology. Annu Rev Biochem 1994; 63 915-48.
18. Loft S, Poulsen HE. Cancer risk and oxidative DNA damage in man [published erratum appears in J Mol Med 1997; 75 (1): 67-8]. J Mol Med 1996; 74: 297-312.
19. Szatrowski TP, Nathan CF. Production of large amounts of hydrogen peroxide by human tumor cells. Cancer Res 1991; 51: 794-8.
20. Collins A, Harrington V. Repair of oxidative DNA damage: assessing its contribution to cancer prevention. Mutagenesis 2002; 17: 489-93.
21. Jaloszynski P, Jaruga P, Olinski R, Biczysko W, Szyfter W, Nagy E, et al. Oxidative DNA base modifications and polycyclic aromatic hydrocarbon DNA adducts in squamous cell carcinoma of the larynx. Free Radic Res 2003; 37: 231-40.
22. Bohr VA, Evans MK, Fornace AJ. DNA repair and its pathogenetic implications. Lab Invest 1989; 61: 143-61.
23. Mitelman F, Kaneko Y, Berger R. Report of the committee on chromosome changes in neoplasia. In: Cuticchia AJ, Pearson PL [eds]. Human gene mapping. Baltimore: Johns Hopkins University Press 1993; 773.
24. Oliński R, Jurgowiak M. The role of reactive oxygen species in mutagenesis and carcinogenesis processes. Postępy Biochem 1999; 45: 50-8.
25. Curtis SB. Lethal and potentially lethal lesions induced by radiation – a unified repair model. Radiat Res 1986; 106: 252-70.
26. Bedford JS. Sublethal damage, potentially lethal damage, and chromosomal aberrations in mammalian cells exposed to ionizing radiations. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1991; 21: 1457-69.
27. Olive PL, Banath JP. Detection of DNA double-strand breaks produced in histone – depleted tumor cell nuclei measured using the neurtal comet assay. Radiat Res 1993; 142: 144-52.
28. Elkind MM. DNA repair and cell repair: are they related? Int J Radiat Oncol Biol Phys 1979; 5: 1089-94.
29. Mc Millan TJ, Peacock JH. Molecular determinants of radiosensitivity in mammalian cells. Int J Radiat Biol 1994; 65: 49-55.
30. Murata-Kamiya N, Kamiya N, Muraoka M, Kaji H, Kasai H. Comparison of oxidation products from DNA components by gamma-irradiation and Fenton-type reactions. J Radiat Res 1997; 38: 121-31.
31. Olinski R, Gackowski D, Foksinski M, Rozalski R, Roszkowski K, Jaruga P. Oxidative DNA damage: assessment of the role in carcinogenesis, atherosclerosis, and acquired immunodeficiency syndrome. Free Radic Biol Med 2002; 33: 192-200.
32. Pawlik TM, Keyomarsi K. Role of cell cycle in mediating sensitivity to radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2004; 59: 928-42.
33. Dizdaroglu M. Measurement of radiation-induced damage in DNA at the molecular level. Int J Radiat Biol 1992; 61: 175-83.

Adres do korespondencji
dr n. med. Krzysztof Roszkowski
Centrum Onkologii
ul. Romanowskiej 2
85-796 Bydgoszcz
tel. +48 52 374 374, 374 37 33
e-mail: roszkowskik@co.bydgoszcz.pl