The effect of linoleic acid on the growth and vascularity of L-1 Sarcoma in mice and on the cutaneous angiogenesis induced by tumour cells

WSTĘP


Liczne badania epidemiologiczne i doświadczalne na zwierzętach wskazują na istotną rolę tłuszczów w rozwoju procesu nowotworowego i w zjawisku przerzutów [1, 2, 3]. Znaczenie ma zarówno ilość tłuszczu, jak i jego skład [4, 5]. Szczególnie ważną rolę odgrywają wielonienasycone kwasy tłuszczowe, zwane niezbędnymi, które nie są wytwarzane w organizmie i muszą być dostarczane w pokarmie. Należy do nich kwas linolowy (LA), nienasycony kwas tłuszczowy z rodziny n-6, znajdujący się w dużych ilościach w oleju słonecznikowym, sojowym, kukurydzianym i wiesiołkowym.



W wielu doświadczeniach in vitro opisano stymulujące działanie LA na wzrost linii hodowlanych ludzkich komórek nowotworowych oraz in vivo na wzrost i przerzuty wszczepionych guzów nowotworowych. U myszy karmionych dietą bogatą w LA, po wszczepieniu im komórek nowotworowych, obserwowano przyspieszenie wzrostu guzów sutka oraz powstawania przerzutów [6]. Także potomstwo myszy karmionych dietą o wysokiej zawartości tłuszczu pochodzącego z oleju kukurydzianego w ciągu swego życia statystycznie istotnie częściej zapadało na nowotwory układu rozrodczego [7]. Istnieją doniesienia dotyczące stymulacji inwazyjności in vitro komórek nowotworowych przez metabolity LA, prostanoidy, powstające drogą cyklooksygenazy i lipoksygenazy. Wykazano, że niektóre z nich mogą indukować lub nasilać wytwarzanie metaloproteaz, czynnych w procesach inwazji nowotworów i w procesie angiogenezy [8].



Kwasy tłuszczowe modulują proces karcinogenezy, wpływając na jej różne stadia i mechanizmy [9] Jednym z ważniejszych mechanizmów warunkujących rozwój guzów nowotworowych i ich przerzutów jest proces angiogenezy, czyli powstawania nowych naczyń krwionośnych [10]. Uprzednie badania autorów wykazały pobudzające działanie oleju z wiesiołka, zawierającego ok. 70 proc. kwasu linolowego i 10 proc. kwasu gamma-linolenowego na proces angiogenezy indukowanej w skórze myszy przez komórki nowotworowe [11]. Na modelu tym czynniki uwalniane przez wszczepione komórki aktywują komórki środbłonków naczyń gospodarza, co stwarza sytuację podobną do istniejącej w procesie neowaskularyzacji ognisk pierwotnych i przerzutów.



W obecnej pracy postanowiono przebadać wpływ doustnego podawania myszom kwasu linolowego na wzrost i unaczynienie wszczepionego im mięsaka L-1. Oceniano unaczynienie guza pośrednio na podstawie zawartości w nim hemoglobiny (Hb). Przebadano także wpływ LA na angiogenezę indukowaną komórkami Sarcoma L-1 w teście skórnym u myszy.



MATERIAŁ I METODY


Używano myszy wsobnych Balb/c z hodowli własnej, 6-tygodniowych samców (doświadczenia z wszczepianiem guza) i samic (test angiogenezy skórnej), wagi ok. 20 g, pozostających na standardowej diecie (Murigran, woda filtrowana). Materiał zarodowy myszy Balb/c oraz komórki mięsaka mysiego L-1 pochodziły z Centrum Onkologii w Warszawie. Komórki L-1 były utrzymywane in vivo poprzez kolejne przeszczepianie myszom (do 6 pasaży). Używano kwasu linolowego firmy Sigma nr kat. L1751. Rozpuszczano go w 0,2 proc. alkoholu etylowym. Do preparatyki zawiesin komórek nowotworowych używano sit firmy Sigma nr kat. L. 77HO777.



BADANIA WPŁYWU KWASU

LINOLOWEGO NA WZROST MIĘSAKA L-1 U MYSZY


Komórki mięsaka mysiego w liczbie 1 miliona wszczepiano podskórnie myszom, po uprzednim ich uśpieniu 3,6-procentowym wodzianem chloralu. Grupy myszy następnie karmione były przez 14 dni kwasem linolowym w dawce dobowej 3,5 mg w 25 mikrolitrach 0,2-procentowego wodnego roztworu alkoholu etylowego. Następnie myszy zabijano przy pomocy usypiającego preparatu Morbital i ważono wyizolowane guzy.



ILOŚCIOWE OZNACZENIE ZAWARTOŚCI

HEMOGLOBINY W GUZACH


Stosowana metoda jest modyfikacją metody opisanej dla wszczepów gąbki kolagenowej i Matrigelu wg Passanti et al. [12]. W skrócie, tkanka guza poddana była homogenizacji przy użyciu sonifikatora ultradźwiękowego (Virtis, USA), a następnie wirowaniu przez 25 min przy 2000 obr/min. Uzyskany w wyniku wirowania supernatant łączony był w ilości 20 mikrolitrów z 5 ml zmodyfikowanego odczynnika Drabkina. Po upływie ok. 5 min próbka była odczytywana w czytniku spektrofotometrycznym przy długości fali 570 nm. Próbę standardową stanowiły kolejne rozcieńczenia wzorcowej hemoglobiny mysiej (Sigma).



TEST SKÓRNEJ ANGIOGENEZY

INDUKOWANEJ KOMÓRKAMI NOWOTWOROWYMI [13]


Myszom, po uprzednim uśpieniu 3,6-procentowym wodzianem chloralu (0,2 ml dootrzewnowo) i ogoleniu skóry grzbietu wstrzykiwano śródskórnie komórki nowotworowe w liczbie 200 tys., zawieszone w 0,05 ml płynu Parkera (4–6 wszczepów u jednej myszy). Miejsce wstrzyknięcia uwidaczniano przez dodanie do zawiesiny komórek 0,1-procentowego błękitu trypanu. Podawanie doustne badanego leku rozpoczynano zaraz po wstrzyknięciu komórek i przez następne 2 dni. Po 3 dniach myszy zabijano przez zastosowanie usypiającego preparatu Morbital i po uwidocznieniu wewnętrznej strony skóry odczytywano liczbę nowo powstałych nowych naczyń krwionośnych w mikroskopie operacyjnym, przy 7-krotnym powiększeniu. Nowo powstałe naczynia krwionośne identyfikowano wg metody Sidky i Auerbacha [14].



Oceny statystycznej wyników dokonywano przy użyciu testów: t Studenta i U Manna-Whitneya.



WYNIKI


Wyniki przeprowadzonych badań przedstawiono w tab. i na ryc. 1. i 2. Tab. przedstawia średnią liczbę nowo powstałych naczyń indukowanych komórkami nowotworowymi w teście skórnej angiogenezy. Stwierdzono statystycznie istotny wzrost liczby naczyń krwionośnych u myszy, którym podawano kwas linolowy (test Studenta).



Kwas linolowy podawany myszom ze wszczepionym mięsakiem L-1 przez 14 dni (ryc. 1.) statystycznie istotnie pobudzał jego wzrost w porównaniu do wzrostu guzów w grupach myszy kontrolnych (mediana – 0,6135 g versus 0,1975 g). Kwas linolowy wpływał również pobudzająco na unaczynienie guza. Zawartość hemoglobiny w guzach u myszy, którym podawano LA była statystycznie istotnie wyższa niż w guzach myszy grup kontrolnych (mediana – 22,15 versus 5,65 ryc. 2.). Analiza rang przeprowadzona testem Manna Whitneya wykazała różnice istotne statystycznie pomiędzy grupami kontrolną i doświadczalną.



OMÓWIENIE


Stymulujący wpływ LA na procesy nowotworowe obserwowano w badaniach epidemiologicznych i w licznych doświadczeniach na zwierzętach [15]. Nadmierna podaż w diecie kwasu linolowego jest związana ze zwiększeniem ryzyka powstawania raka sutka, jelit i prostaty u ludzi [1, 16]. Kwas linolowy obecny jest w dużych ilościach w olejach roślinnych – olej sojowy (53 proc.), olej słonecznikowy (67 proc.), olej kukurydziany (50 proc.), olej wiesiołkowy (70 proc.). Kwas linolowy pobudza karcinogenezę i zwiększa liczbę przerzutów wpływając na różne stadia ich powstawania. Jest on metabolicznym prekursorem kwasu arachidonowego. W procesie nowotworzenia bardzo istotną rolę odgrywają metabolity kwasu arachidonowego (prostanoidy), powstające zarówno drogą cyklooksygenazy (prostaglandyny, tromboksany, prostacyklina), jak i drogą lipoksygenazy (leukotrieny, lipoksyny). Zwiększony poziom prostaglandyn stwierdzono w wielu guzach nowotworowych [17, 18]. Wykazano, że prostaglandyny wpływają na wzrost guzów poprzez stymulację proliferacji komórek i działanie na układ immunologiczny.



Metabolit kwasu linolowego, powstający drogą lipoksygenazy – 12 HETE (kwas 12-hydroksyeicosatetraenowy) zwiększa inwazyjność komórek nowotworowych, co związane jest z indukcją kolagenazy typu IV [19].



Stwierdzono także, że kwas 12-HETE odgrywa szczególną rolę przy powstawaniu przerzutów, zwiększa adhezję komórek nowotworowych do komórek śródbłonka, stymuluje rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych w macierzy zewnątrzkomórkowej i zwiększa ich ruchliwość [20]. Wykazano także, że kwas 12 HETE jest czynnikiem proangiogennym i hamuje apoptozę [21]. Inny metabolit kwasu arachidonowego, prostaglandyna grupy 2 (PGE2) także posiada właściwości proangiogenne [22]. Wyniki naszych badań potwierdzają wyniki cytowanych autorów i wskazują na udział proangiogennego działania LA w jego aktywności pronowotworowej.


Praca finansowana z tematu 4/4 działalności statutowej Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc w Warszawie.


PIŚMIENNICTWO

1. Bartsch H, Nair J, Owen R. Dietary polyunsaturated fatty acids and cancers of the breast and colorectum: emerging evidence for their role as risk modifiers. Carcinogenesis 1999; 20: 2209-18.

2. Doll R, Peto R. The causes of cancer quantitative estimates of avoidable risks of cancer in the United States today. J Natl Cancer Inst 1981; 66: 1191-208.

3. Welsch C. Enhancement of mammary tumorigenesis by dietary fat: review of potential mechanisms. Am J Clin Nutr 1987; 45: 192-202.

4. Fay M, Freedman L, Clifford CK, Midthune P. Effect of different types and amounts of fat on the development of mammary tumours in rodents: a review. Cancer Res 1997; 57: 3979-88.

5. Tanneubaum A, Silverstone H. Nutrition in relation to cancer. Adv Cancer Res 1953; 1: 451-65.

6. Rose D, Hatala MA, Connolly J, Rayburn J. Effect of diets containing different levels of linoleic acid on human breast cancer growth and lung metastasis in nude mice. Cancer Res 1993; 53: 4686-90.

7. Hilakivi-Clarke L, Clarke R, Onojafe I, Raygada M, Cho E, Lippman M. A maternal diet high in n-6 polyunsaturated fats alters mammary gland development, puberty onset, and breast cancer risk among female rat offspring. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 9372-7.

8. Liu X, Connolly JM, Rose D. Eicosanoid as mediators of linoleic acid stimulated invasion and type-IV-collagenase production by a metastatic human breast-cancer cell line. Clin Exp Metastasis 1996; 14: 145-52.

9. Walker B, Kurth L. Multigenerational effect of dietary fat carcinogenesis in mice. Cancer Res 1997; 57: 4162-3.

10. Folkman J. What is evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl Cancer Inst 1990; 82: 4-6.

11. Sommer E, Skopińska-Różewska E, Filewska M. Wpływ nienasyconych kwasów tłuszczowych n-6 zawartych w oleju z wiesiołka na reakcję skórnej angiogenezy indukowanej u myszy komórkami nowotworowymi i limfatycznymi. Zbiór prac III Sympozjum nt. Olej z nasion wiesiołka i inne oleje zawierające kwasy n-6 lub n-3 w profilaktyce i terapii 1998; 225-229.

12. Passanti A, Taylor R, Pili R, Long P, Haney JA, Pacily R, Grant DS, Martin G. A simple quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agent using reconstituted basement membrane, heparin and fibroblast growth factor. Lab Invest 1992; 67: 519-28.

13. Skopińska-Różewska E, Krotkiewski M, Sommer E, et al. Inhibitory effect of shark liver oil on cutaneous angiogenesis induced in Balb/c mice by syngeneic sarcoma L-1, human urinary bladder and human kidney tumour cells. Oncology Reports 1999; 6: 1341-4.

14. Sidky Y, Auerbach R. Lymphocyte-induced angiogenesis: A quantitative and sensitive assay of the graft-vs. -host reaction. J Exp Med 1975; 141: 1084-1100.

15. Rose D, Boyar AP, Wynder EL. International comparisons of mortality rates for cancers of breast, ovary, prostate and colon and per capita food consumption. Cancer 1986; 58: 2363-71.

16. Hilakivi-Clarke L, Onojafe I, Raygada M, Cho E, Clarke R, Lippman M. High-fat diet during pregnancy increases breast cancer risk in rat. J Natl Cancer Inst 1996; 88: 1821-7.

17. Noguchi M, Rose D, Eavashi M, Miyazaki J. The role of fatty acids and eicosanoid synthesis inhibitors in breast carcinoma. Oncology 1995; 52: 265-71.

18. Lupulescu A. Enhancement of carcinogenesis by prostaglandins in male Swiss mice. J Natl Cancer Inst 1978; 61: 97-106.

19. Chen Y, Duniec Z, Liu B, Hagmann W, Gao X, Shimoji K, Marnett L, Johnson C, Honn K. Endogenous 12 (S) -HETE production by tumor cells and its role in metastasis. Cancer Res 1994; 54: 1574-9.

20. Connolly J, Rose D. Enhanced angiogenesis and growth of 12-lipoxygenase gene-transfected MCF-7 human breast cancer cells in athymic nude mice. Cancer Lett 1998; 132: 107-12.

21. Nie D, Tang K, Diglio C, Honn K. Eicosanoid regulation of angiogenesis: role of endothelial arachidonate lipoxygenase. Blood 2000; 95: 2304-11.

22. Form D, Auerbach R. PGE2 and angiogenesis. Proc Soc Exp Biol Med 1983; 172: 214-8.


ADRES DO KORESPONDENCJI

prof. dr hab. n. med. Ewa Skopińska-Różewska

Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii

Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc

ul. Płocka 26

01-138 Warszawa

e-mail: ewaskop@hotmail.com