Współcz Onkol (2002), vol. 6, 4, 216-221
Chirurgia, radioterapia i chemioterapia jako podstawowe metody leczenia nowotworów osiągnęły pewne plateau możliwości. Dalszy postęp - wyrażony przede wszystkim wydłużeniem całkowitego czasu przeżycia - jest możliwy m.in. poprzez poszukiwanie nowych punktów uchwytu dla działania leków oraz rozwój biologicznych metod terapii. W ten nurt poszukiwań wpisuje się koncepcja wykorzystania genów myb i ich produktów jako celu terapii przeciwnowotworowej.
MYB JAKO ONKOGENY
Ogólna charakterystyka rodziny onkogenów myb została już przedstawiona [1]. Geny te działają jako stymulatory podziałów komórkowych i inhibitory różnicowania. Białka Myb zbudowane są wg wspólnego planu i wykazują dość dużą homologię. Podstawowa forma c-Myb zbudowana jest z 636 reszt aminokwasowych i ma masę cząsteczkową 75 kDa. Część ludzkich komórek hemopoetycznych zawiera długą formę c-Myb (masa cząsteczkowa 89 kDa, 757 reszt aminokwasowych), powstającą w wyniku alternatywnego składania transkryptu genu c-myb. Dodatkowe reszty aminokwasowe kodowane są przez tzw. ekson 9A, czyli 363 pary zasad położone między eksonem 9 i 10. Białka a-Myb i b-Myb zawierają w cząsteczce odpowiednio 751 i 704 reszty aminokwasowe [2].
Poszczególne geny myb charakteryzują się zróżnicowanymi wzorcami ekspresji. Filogenetycznie najstarszy b-myb jest aktywny w zasadzie we wszystkich komórkach dzielących się, natomiast białka c-Myb i a-Myb są obecne w ograniczonej liczbie tkanek i narządów (tab. 1.). Ponadto w przypadku istnienia koekspresji b-myb i c-myb uruchomienie i zahamowanie wytwarzania kodowanych przez nie białek występuje w różnym czasie. Ludzkie komórki prekursorowe hemopoezy izolowane z krwi obwodowej stanowią dobry model ilustrujący tę sytuację. Wyjściowo komórki te wykazują ekspresję tylko c-myb. Dodanie do hodowli czynników wzrostu (stymulacja proliferacji i różnicowania) aktywuje b-myb przy zachowaniu ekspresji c-myb. W czasie dalszego różnicowania jako pierwsza zanika ekspresja c-myb [15]. Powyższe fakty świadczą o zróżnicowanej roli poszczególnych białek Myb. Można założyć, że b-Myb bierze udział głównie w kontroli proliferacji komórek, natomiast c-Myb przede wszystkim uczestniczy w regulacji różnicowania.
Zmiany ekspresji c-myb wykryto w różnych ludzkich nowotworach (tab. 2.). Jednakże w odróżnieniu od modeli doświadczalnych (hodowle komórkowe i nowotwory in vivo u kurcząt i myszy) nie wyjaśniono dotychczas w zadowalającym stopniu mechanizmu aktywacji onkogennej c-myb u ludzi. W czasie indukcji doświadczalnych białaczek i chłoniaków przekształcenie protoonkogenu c-myb w onkogen może odbywać się na co najmniej 2 sposoby:
1) mutacje powodujące skrócenie białka c-Myb prowadzą do rozwoju ostrych postaci białaczek - Myb działa przede wszystkim jako inhibitor różnicowania,
2) nadekspresja pełnowymiarowego c-Myb generuje wolniejszą transformację ze znacznie częstszym różnicowaniem (białaczki i chłoniaki przewlekłe) - Myb stymuluje proliferację, co prowadzi do zwiększenia puli komórek niezróżnicowanych [33].
Chociaż c-myb spełnia warunki niezbędne do uznania go za onkogen, to niektóre fakty wskazują na konieczność współudziału innych czynników genetycznych w transformacji nowotworowej wywołanej aktywacją tego onkogenu [34-36]. Postulowany jest udział kinaz (np. pim-1, JAK/STAT) stymulowanych przez nadekspresję zmutowanego genu ras, a także nadekspresji onkogenów rodziny myc [37].
Podczas kryzy blastycznej T-komórkowej w przebiegu przewlekłej białaczki szpikowej wykryto mutację c-myb polegającą na utracie domeny wiążącej inhibitory ekspresji. Domena ta zlokalizowana jest przy końcu 3' eksonu 9. Wydaje się, że opisana mutacja jest nabywana w czasie progresji choroby - znaleziono ją w materiale pobieranym od pacjenta po jej wykryciu, ale nie znaleziono w preparatach uzyskanych w fazie przewlekłej [38]. Jednakże poszukiwanie mutacji w obrębie negatywnej domeny regulacyjnej u 26 pacjentów z białaczkami szpikowymi wykonane przez inny zespół dało wyniki negatywne [39].
Obserwowano sprzężenie między ekspresją receptorów estrogenowych (ER) i c-myb w komórkach raka piersi. Guzy (oraz wyprowadzone z nich linie komórkowe) ER-pozytywne wykazywały obecność c-myb mRNA, podczas gdy w rakach ER-negatywnych nie stwierdzono ekspresji c-myb [24].
Nadekspresja c-myb jest obecna w komórkach nabłonka przełyku objętego metaplazją Barretta. Dalszy statystycznie znamienny wzrost ekspresji obserwowano w rakach przełyku rozwijających się na podłożu tej nieprawidłowości. Co ciekawe, ekspresja c-myb w prawidłowej błonie śluzowej przełyku u pacjentów z rakiem tego narządu była znacznie większa od analogicznej ekspresji u osób zdrowych [27].
Dotychczas nie przedstawiono danych, które pozwoliłyby na jednoznaczne zaliczenie b-myb i a-myb do onkogenów. Jednakże wyniki kilku doświadczeń wskazują na ich ważną rolę w regulacji wzrostu komórek nowotworowych. Nadekspresja a-myb jest obecna w chłoniaku Burkitta, ostrej białaczce limfoblastycznej z komórek B oraz w ok. 25 proc. przypadków przewlekłej białaczki limfatycznej [40]. Natomiast b-myb jest wysoce aktywny w różnych ludzkich liniach białaczkowych, przy czym zahamowanie jego ekspresji znacząco obniża potencjał proliferacyjny tych komórek [41]. Ciekawe obserwacje dotyczą również zachowania się in vitro komórek linii neuroblastoma w zależności od działania b-myb - transfekcja dodatkową kopią tego genu powoduje zahamowanie różnicowania i zwiększenie proliferacji w odpowiedzi na czynniki wzrostu [42].
W liniach ER-negatywnych ludzkiego raka piersi wykrywano wysoką ekspresję a-myb mRNA. Wiadomo, że ekspresja a-myb jest niezbędna do prawidłowego rozwoju nabłonka przewodów mlekowych w czasie ciąży. Z drugiej strony - myszy knock-out płci żeńskiej pozbawione receptora progesteronowego wykazują niemal identyczne zmiany fenotypowe gruczołów mlekowych, jak zwierzęta pozbawione a-myb. Być może istotnym czynnikiem w rozwoju raka piersi u kobiet jest brak zahamowania ekspresji a-myb w nabłonku przewodów mlekowych po zakończeniu proliferacji związanej z ciążą [2].
MYB JAKO CEL TERAPII PRZECIWNOWOTWOROWEJ
Blokowanie czynności onkogenów jest jedną z eksperymentalnych strategii leczenia nowotworów złośliwych. Zahamowanie ekspresji danego genu można przeprowadzić na różnych poziomach. Do tego służą tzw. leki oligonukleotydowe. Obecnie znane są następujące klasy tych potencjalnych leków [43]:
1) tzw. antygenowe oligodezoksyrybonukleotydy, które hamują transkrypcję genów poprzez tworzenie struktur trójniciowych z komplementarnymi fragmentami dwuniciowego genomowego DNA,
2) rybozymy (oligonukleotydy katalityczne) degradujące RNA i w ten sposób hamujące translację,
3) oligodezoksyrybonukleotydy antysensowne (antysensy zbudowane z DNA), które wiążą się z komplementarnymi odcinkami mRNA i również hamują translację,
4) antysensowne oligorybonukleotydy (RNA-antysensy) tworzące z komplementarnymi fragmentami mRNA dwuniciowe hybrydy typu RNA-RNA powodujące przerwanie translacji,
5) aptamery, hamujące czynność danego genu na poziomie produktu (wiążą się z określonymi białkami),
6) tzw. pułapki oligonukleotydowe (ang. oligonucleotide decoys) zawierające sekwencje wiążące odpowiednie czynniki transkrypcyjne i na tej drodze uniemożliwiające transkrypcję genów docelowych.
Dotychczas w celu blokowania ekspresji genów myb w komórkach nowotworowych wykorzystywano w zasadzie tylko strategię antysensownych oligodezoksyrybonukleotydów (AO), opisaną w pkt 3. powyższego wykazu.
Choroby mielo- i limfoproliferacyjne
Pierwsze próby wykorzystania genów myb jako celu interwencji terapeutycznej dotyczyły białaczek. Zahamowanie ekspresji c-myb przez AO wyraźnie hamuje proliferację linii komórkowych ostrej białaczki szpikowej. Podobne zjawisko obserwowano w wielu przypadkach białaczek limfatycznych T-komórkowych [18]. Natomiast w przewlekłej białaczce szpikowej (CML) inhibicji ulegały linie komórkowe wyprowadzone z materiału uzyskanego podczas kryzy blastycznej - podobny efekt nie występował w przypadku komórek pozyskiwanych w fazie przewlekłej choroby [44]. Badania in vivo na mysim modelu ludzkiej białaczki szpikowej potwierdziły skuteczność anty-c-myb AO w hamowaniu proliferacji komórek białaczkowych [45].
Jednocześnie zaobserwowano bardzo ciekawe zjawisko. Jeżeli badane AO zostaną dodane do mieszaniny komórek białaczkowych i normalnych komórek hemopoetycznych, to w ponad 70 proc. przypadków komórki nowotworowe zostaną wyeliminowane z hodowli. Jest to skutek zahamowania ekspresji c-myb przez AO [17]. Opisany efekt został wykorzystany do opracowania protokołu oczyszczania materiału przeszczepowego ex vivo w przypadkach leczenia CML z wykorzystaniem autologicznej transplantacji szpiku [46].
Dotychczas nie opublikowano pełnych wyników badania klinicznego, dotyczącego systemowego podawania anty-c-myb AO pacjentom z CML w fazie kryzy blastycznej. Według protokołu AO podawano dożylnie w dawkach 0,3-2,0 mg/kg m.c./d we wlewie ciągłym przez 7 dni - cykle powtarzane co 28 dni. Wyniki I fazy badania wskazują na dobrą tolerancję leczenia [46].
Próbowano kojarzyć anty-c-myb AO z małymi dawkami cytostatyków w badaniach in vitro z użyciem linii komórkowej BV173 (CML). Wstępne wyniki były zachęcające - stwierdzono wyraźną supresję proliferacji komórek białaczkowych przy niewielkim wpływie na prawidłowe komórki hemopoetyczne [47]. Dotychczas nie opublikowano wyników podobnych badań in vivo.
Guzy lite
Przeprowadzono badania in vivo nad wpływem zablokowania ekspresji c-myb na wzrost ludzkiego czerniaka. Komórki 5 linii tego nowotworu wszczepiano dootrzewnowo myszom nagim immunologicznie. Następnie zwierzętom podawano podskórnie w ciągłym wlewie anty-c-myb AO. Zaobserwowano wyraźne zwolnienie wzrostu guzów w porównaniu z grupą kontrolną. Intryguje fakt, że zahamowanie ekspresji c-myb było przejściowe, natomiast spowolnienie wzrostu guzów utrzymywało się znacznie dłużej [48]. Anty-c-myb AO wykazują silne działanie supresyjne na wzrost komórek czerniaka in vitro także w skojarzeniu z cytotoksycznymi limfocytami T [47].
Anty-c-myb AO powodują zahamowanie ekspresji mRNA i białka w hodowli ludzkiego glejaka zarodkowego (glioblastoma). Efekt ten przekłada się na zahamowanie proliferacji komórek nowotworowych [49]. Dotychczas nie opublikowano danych na temat zastosowania badanych AO w leczeniu guzów mózgu u ludzi. Zahamowanie proliferacji obserwowano również w hodowli komórek ludzkiej linii neuroblastoma poddanej działaniu AO. Jako nośnika dla AO użyto w tym doświadczeniu immunoliposomów opłaszczonych przeciwciałem przeciwko cząsteczce disialogangliozydu charakterystycznego dla komórek neuroblastoma [21].
Niektóre linie komórkowe ludzkiego raka okrężnicy (LoVo, LoVo/Dx, Colo 205) wykazują nadekspresję c-myb. Dodanie do ich hodowli anty-c-myb AO powoduje wyraźne obniżenie ekspresji c-myb. Komórki hodowane w obecności AO mają wyraźnie mniejszą zdolność do proliferacji i łatwiej ulegają różnicowaniu [50].
CO MOŻNA ZROBIĆ?
Wydaje się, że geny rodziny myb są interesującym celem dla terapii przeciwnowotworowej. Wiele prac wykonanych na modelach zwierzęcych wskazuje na kluczową rolę zmian ekspresji tych genów w proliferacji komórek nowotworowych. Dotyczy to szczególnie chorób mielo- i limfoproliferacyjnych, choć w guzach litych rola genów myb wydaje się być również znacząca. Dalszy postęp na drodze do wykorzystania ingerencji w działanie genów myb podczas leczenia nowotworów u ludzi jest możliwy poprzez:
1) lepsze poznanie mechanizmów działania AO wykorzystywanych do blokowania ekspresji myb oraz wzmocnienie ich potencjału przeciwnowotworowego poprzez modyfikację budowy i sposobów dostarczania do komórek,
2) dokładne poznanie roli genów myb w biologii ludzkich nowotworów (szczególnie guzów litych),
3) wyjaśnienie związków między nadekspresją myb a opornością na leczenie,
4) precyzyjne określenie mechanizmów nabywania aktywności onkogennej przez geny myb w ludzkich nowotworach.
Istnieje kilka przesłanek pozwalających na dalsze poszukiwania w wymienionych obszarach.
Konstruowanie AO posiadających specyficzną strukturę 2-rzędową, może poprawić ich właściwości przeciwnowotworowe. Przykładem może być anty-c-myb AO zawierający podwójny motyw pętli [51].
Ostatnio wykazano, że inhibitory cyklooksygenazy-2 (COX-2) hamują wzrost ludzkich komórek białaczkowych. Badania przeprowadzono na liniach białaczki monocytowej (U-937) i białaczki mieloblastycznej (ML-1). Do hamowania czynności COX-2 używano związku NS-398 oraz nabumetonu, natomiast do blokowania ekspresji genu cox-2 na poziomie translacji - AO komplementarnego z mRNA cox-2. Proliferacja była zahamowana w większym stopniu po zastosowaniu NS-398 lub nabumetonu w porównaniu z hodowlami poddanymi działaniu AO. Taki wynik wskazuje na dwojakie działanie badanych inhibitorów COX-2. Mogą one hamować proliferację komórek białaczkowych zarówno w sposób zależny, jak i niezależny od blokowania aktywności COX-2 [52]. Skądinąd wiadomo, że w promotorze genu cox-2 znajduje się 13 miejsc wiążących c-Myb [53]. Zatem c-Myb może być kluczowym aktywatorem ekspresji cox-2. Dokładne wyjaśnienie zależności między ekspresją genów myb i cox-2 mogło by stanowić istotny element w projektowaniu nowych strategii leczenia przeciwnowotworowego.
Zahamowanie ekspresji c-myb może zmieniać podatność komórek nowotworowych na leki cytotoksyczne. Badania przeprowadzone na liniach raka okrężnicy opornych na cisplatynę (SW480DDP i SW620DDP) wykazały silniejszą ekspresję c-myb w porównaniu z ich odpowiednikami wrażliwymi na ten lek (linie SW480 i SW620). Dodanie do hodowli komórek opornych anty-c-myb AO hamowało ekspresję c-myb i zwiększało ich wrażliwość na cisplatynę. Natomiast komórki wyjściowo wrażliwe na cisplatynę, po zastosowaniu AO nie zwiększały swojej podatności na ten lek [54].
Do wykorzystania pozostaje możliwość indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko ewentualnym mutantom myb obecnym w komórkach ludzkich nowotworów. Ta nowatorska strategia zaczyna być rozpatrywana przede wszystkim w kontekście eliminacji na drodze immunologicznej komórek nowotworowych ze zmutowanym genem p53 [55]. Podstawową przeszkodą jest tu brak dostatecznej znajomości mechanizmów aktywacji onkogennej myb w ludzkich nowotworach - przede wszystkim bardzo mało wiadomo na temat ewentualnych mutacji.
PODZIĘKOWANIA
Autor dziękuje Panu prof. dr. hab. med. Cezaremu Szczylikowi za inspirację do podjęcia badań nad rolą genów myb w biologii nowotworów.
PIŚMIENNICTWO
1. Pawlak W, Szczylik C. Współczesna Onkologia 1999; 3: 239-40.
2. Oh IH, Reddy P. Oncogene 1999; 18: 3017-33.
3. Mettus RV, Litvin J, Wali A, et al. Oncogene 1994; 9: 3077-86.
4. Foos G, Grimm S, Klempnauer KH. Oncogene 1994; 9: 2481-88.
5. Golay J, Broccoli V, Lamorte G, et al. J Immunol 1998; 160: 2786-93.
6. Toscani A, Mettus RV, Coupland R, et al. Nature 1997; 386: 713-17.
7. Marhamati DJ, Bellas RE, Arsura M, et al. Mol Cell Biol 1997; 17: 2448-57.
8. Trauth K, Mutschler B, Jenkins NA, et al. EMBO J 1994; 13: 5994-6005.
9. Nomura N, Takahashi M, Matsui M, et al. Nucl Acids Res 1988, 16, 11075-89.
10. Gonda TJ, Shieness DK, Bishop JM. EMBO J 1982; 4: 1767-75.
11. Duprey SP, Boettiger D. Proc Natl Acad Sci USA 1985; 82: 6937-41.
12. Gewirtz AM, Anfossi G, Venturelli D, et al. Science 1989; 245: 180-3.
13. Queva C, Ness SA, Grasser FA, et al. Development 1992; 114: 125-33.
14. Sitzmann J, Noben-Trauth K, Klempnauer KH. Oncogene 1995; 11: 2273-79.
15. Sala A, Watson A. J Cell Physiol 1999; 179: 245-50.
16. Gopal V, Hulette B, Li YQ, et al. Leuk Res 1992; 16: 1003-11.
17. Calabretta B, Sims RB, Valtieri M, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 1991: 2351-55.
18. Venturelli D, Mariano MT, Szczylik C, et al. Cancer Res 1990; 50: 7371-5.
19. Dasgupta P, Reddy EP. Oncogene 1989; 4: 1419-23.
20. Thiele CJ, Cohen SP, Israel MA. Mol Cell Biol 1988; 8: 1677-83.
21. Pagnan G, Stuart DD, Pastorino F, et al. J Natl Cancer Inst 2000; 92: 253-61.
22. Hui AB, Lo KW, Teo PM. Int J Oncol 2002; 20: 467-73.
23. Cline MJ, Battifora H, Yokota J. J Clin Oncol 1987; 5: 999-1006.
24. Guerin M, Sheng Z, Riou G. Oncogene 1990; 5: 131-35.
25. Cline MJ, Battifora H. Cancer 1987; 60: 2669-74 – Errata In: Cancer 1988; 61: 1064.
26. Griffin CA, Baylin SB. Cancer Res 1985; 45: 272-5.
27. Brabender J, Lord RV, Danenberg KD, et al. J Surg Res 2001; 99: 301-6.
28. Wallrapp C, Müller-Pillasch F, Solinas-Toldo S, et al. Cancer Res 1997; 57: 3135-9.
29. Torelli G, Venturelli D, Colo A, et al. Cancer Res. 1987; 47: 5266-9.
30. Alitalo K, Winqvist R, Lin CC, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1984; 81: 4534-8.
31. Gurpide E. J Natl Cancer Inst 1991; 83: 405-16.
32. Janssen JWG, Vernole P, de Boer PAJ, et al. Cytogenet Cell Genet 1986; 41: 129-35.
33. Lipsick JS. Oncogene 1996; 13: 223-35.
34. Press RD, Reddy EP, Ewert DL. Moll Cell Biol 1994; 14: 2278-90.
35. Le Rouzic E, Perbal B. J Virol 1996; 70: 7414-27.
36. Badiani PA, Kioussis D, Swirsky DM, et al. Oncogene; 13: 2205-12.
37. Weston K. Curr Opin Genet Dev 1998; 8: 76-81.
38. Tomita A, Watanabe T, Kosugi H, et al. Leukemia 1998; 12: 1422-9.
39. Lutwyche JK, Keough RA, Hughes TP, et al. Br J Hematol 2001; 114: 632-4.
40. Golay J, Luppi M, Songia S, et al. Blood 1996; 87: 1900-11.
41. Arsura M, Introna M, Passerini F, et al. Blood 1992; 79: 2708-16.
42. Raschella G, Negroni A, Sala A, et al. J Biol Chem 1995; 270: 8540-5.
43. Pawlak W, Zolnierek J, Sarosiek T, et al. Cancer Treat Rev 2000; 26: 333-50.
44. Szczylik C, Skorski T, Malaguarnera L, et al. Folia Histochem Cytobiol 1996; 34: 129-34.
45. Ratajczak MZ, Kant JA, Luger SM, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 89: 11823-7.
46. Gewirtz AM. Oncogene 1999; 18: 3056-62.
47. Nieborowska -Skorska M, Nakashima M, Ratajczak M, et al. Folia Histochem Cytobiol 1994; 32: 35-40.
48. Hijiya N, Zhang J, Ratajczak MZ, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 4499-503.
49. Hall WA, Flores EP, Low WC. Neurosurgery 1996; 38: 376-83.
50. Melani C, Rivoltini L, Parmiani G, et al. Cancer Res 1991; 51: 2897-901.
51. Moon IJ, Choi K, Choi YK, et al. J Biol Chem 2000; 275: 4647-53.
52. Nakanishi Y, Kamijo R, Takizawa M, et al. Eur J Cancer 2001; 37: 1570-78.
53. Ramsay RG, Friend A, Vizantios Y, et al. Cancer Res 2000; 60: 1805-9.
54. Funato T, Satou J, Kozawa K, et al. Oncol Rep 2001; 8: 807-10.
55. Vogelstein B, Kinzler KW. Nature 2001; 412: 865-6.
ADRES DO KORESPONDENCJI
dr med. Wojciech Z. Pawlak
Klinika Onkologii CSK WAM
ul. Szaserów 128
00-909 Warszawa
e-mail: wojpaw@cskwam.mil.pl
Praca finansowana ze środków KBN - projekt nr 6 PO5B 097 21.
