The prevalence and diagnostic significance of aCCP antibodies and rheumatoid factor in rheumatoid arthritis patients

Wstęp

Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) – najczęstsza przewlekła autoimmunologiczna choroba zapalna człowieka, która w swym naturalnym przebiegu doprowadza do kalectwa, jest przyczyną skrócenia długości życia i obniżenia jego jakości. Stwarza także poważny problem terapeutyczny, pomimo dynamicznego rozwoju nowych, obiecujących metod leczenia. Od lat stanowi również trudne wyzwanie diagnostyczne z uwagi na fakt, iż nie istnieje badanie laboratoryjne, wynik histologiczny lub cecha radiologiczna, które posiadałyby absolutną dla niej swoistość, zwłaszcza w początkowym jej stadium. Kryteria rozpoznawania modyfikowane ostatnio w 1987 r. (wg Amerykañskiego Towarzystwa Reumatologicznego – ARA) [1] z uwagi na niedostateczną czułość i swoistość zwykle nie spełniają zadania, zwłaszcza w pierwszych miesiącach choroby. Rosnące zainteresowanie wzbudza natomiast koncepcja, iż jedynie bardzo wczesna faza RZS reprezentuje unikalne z patologicznego punktu widzenia ”okno terapeutyczne”, które stwarza szansę, że zastosowane wówczas leczenie umożliwi nie tylko opanowanie stanu zapalnego, ale również zmodyfikuje naturalny przebieg choroby.
Czynnik reumatoidalny (rheumatoid factor – RF), który stanowi jedyne aktualnie obowiązujące kryterium serologiczne, bywa wykrywany poza RZS w wielu innych układowych chorobach tkanki łącznej, a także poza nimi, m.in. w chorobach o podłożu infekcyjnym oraz u przynajmniej 1% osób zdrowych. Występowanie klasycznego IgM-RF opisywano u 2–3% osób zdrowych [2], wg innych źródeł aż u 15% [3], w tym szczególnie u osób starszych, w przypadku których odsetek ten może nawet sięgać 25–40% [3, 4].
Godny podkreślenia jest fakt, iż najwyższe miana RF obserwuje się u pacjentów z takimi chorobami, jak zespół Sjögrena czy makroglobulinemia, których cechą charakterystyczną nie jest zapalenie stawów. Czynnik reumatoidalny jest nie tylko niedostatecznie swoisty dla RZS, ale także występuje rzadko w początkowym stadium choroby. Klasyczny RF na ogół stwierdza się w surowicy 50–90% chorych [3, 5], ale podczas pierwszych 3 mies. choroby wykrywa się go tylko u 33% pacjentów [4]. Odsetek ten zwiększa się do ok. 60% dla nieco dłuższego, 6-miesięcznego okresu od początku objawów [6]. Prawdopodobieñstwo pozytywności testu RF jest wobec tego najmniejsze w początkowym okresie jawnego klinicznie procesu zapalnego, kiedy występowanie omawianego autoprzeciwciała ma dla rozpoznawania choroby największe znaczenie. Z tych względów oczywista stała się potrzeba poszukiwania bardziej przydatnego diagnostycznie markera serologicznego RZS. Odkrycie przeciwciał przeciwkeratynowych (anti-keratin antibodies – AKA) i przeciwciał przeciwko czynnikowi okołojądrowemu (anti-perinuclear factor – APF), a następnie zidentyfikowanie ich antygenu docelowego, tj. cytruliny, zapoczątkowało trwający nieprzerwanie okres poszukiwañ metody ich oznaczania laboratoryjnego, która byłaby stosunkowo tania, łatwa w standaryzacji, dająca powtarzalne wyniki, a przy tym spełniająca wymogi testu lepszego od dostępnych do tej pory – swoistszego od RF, dodatniego u znacznej liczby RF-ujemnych chorych na RZS, wykazującego wartość rokowniczą dla ciężkości przebiegu choroby. Wydaje się, że opracowany niedawno test ELISA II generacji, wykorzystujący w roli antygenu syntetyczny cykliczny cytrulinowany peptyd (cyclic citrullinated peptide – CCP), z uwagi na wysoką swoistość i zadowalającą czułość dla RZS, może spełnić te oczekiwania. W świetle niektórych badañ przeciwciała aCCP posiadają również wartość rokowniczą dla przebiegu choroby [7]. Warto w tym miejscu zaznaczyć, iż pomimo zidentyfikowania w postaci aCCP obiecującego markera serologicznego, wyniki 3 kwestionariuszy wypełnionych przez grupę reumatologów z całego świata w latach 1997, 2000, 2003 wykazały, iż jeszcze w 2003 r. uznawanym przez 97,2% respondentów laboratoryjnym markerem służącym rozpoznawaniu RZS był nadal czynnik reumatoidalny. Przeciwciała aCCP wykorzystywało w diagnostyce choroby tylko 17,4% lekarzy specjalistów, przeciwciała przeciwjądrowe ANA – 78,3%, AKA – 8,7%, APF – 8,7%, a przeciwciała anty-RA33 – 2,2% [8].

Cel badania

Celem pracy była próba określenia częstości występowania oraz znaczenia diagnostycznego przeciwciał aCCP i czynnika reumatoidalnego w reumatoidalnym zapaleniu stawów.

Materiał i metody

Badaniem objęto 173 chorych leczonych w Katedrze i Klinice Reumatologiczno-Rehabilitacyjnej i Chorób Wewnętrznych AM w Poznaniu w latach 2003–2005. Średnia wieku wynosiła 51,5 roku (±13,3; zakres 20–80 lat), kobiety stanowiły 82,1% badanych. Wszyscy chorzy spełniali kryteria rozpoznania RZS wg ARA z 1987 r. [1]. Mediana czasu trwania objawów RZS osiągnęła 12 mies. (zakres 1,5–408). Wszyscy pacjenci zakwalifikowani do badania wyrazili pisemną zgodę na udział w nim i pobranie krwi. Uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej na przeprowadzenie badania.
W surowicy każdego z pacjentów oznaczano występowanie i miano IgM-RF metodą odczynu wiązania lateksu (Lx; norma <1/80) oraz odczynu Waalera-Rosego (W-R; norma <1/160). Za obecność IgM-RF w surowicy uznawano wynik dodatni w przynajmniej jednym z dwóch testów: odczynu W-R (miano ≥1/160) lub odczynu Lx (miano ≥1/80). Za nieobecność IgM-RF uznawano wynik ujemny w każdym z testów. Występowanie i wartość przeciwciał aCCP oznaczano z wykorzystaniem metody ELISA w teście II generacji (test firmy EUROIMMUN; norma ≤5 RU/ml). U wszystkich chorych uwzględniano również wynik badania w kierunku obecności i miano przeciwciał przeciwjądrowych (antinuclear antibodies – ANA) metodą immunofluorescencji pośredniej (norma <1/80).

Wyniki

Występowanie aCCP2 stwierdzono u 88,4% badanych chorych na RZS, natomiast występowanie IgM-RF w metodzie W-R u 30,6%, a w metodzie Lx u 45,1%. Przy uwzględnieniu wyniku oznaczenia przekraczającego normę w którejkolwiek z metod (W-R lub Lx) za IgM-RF-dodatnich uznano 46,8% pacjentów (tab. I). W grupie 92 chorych IgM-RF-ujemnych czułość testu ELISA aCCP2 osiągnęła 81,5%. Pacjenci, u których jedynym obecnym markerem serologicznym był czynnik reumatoidalny, stanowili 1% ogółu badanych. U 45% chorych wykryto w surowicy obydwa autoprzeciwciała, u 43,3% tylko aCCP2, a u 9,8% nie stwierdzono żadnego z nich (tabela II).
Przeciętna wartość (mediana) aCCP2 w podgrupie chorych aCCP2-dodatnich wyniosła 109,3 RU/ml (6,1–1300), w podgrupie aCCP2-ujemnych 1 RU/ml (0,25–3,5) (tab. III).
Stwierdzono istnienie związku między występowaniem aCCP2 i IgM-RF: p=0,003; współczynnik Fi=0,231. W podgrupie IgM-RF-dodatnich chorych obserwowano istotnie wyższe wartości aCCP2 w porównaniu z pacjentami IgM-RF-ujemnymi (p=0,022) (tab. IV).
Odnotowano występowanie słabej korelacji pomiędzy wartościami aCCP2 i mianem czynnika reumatoidalnego oznaczanego metodą Lx (p=0,002) (tab. V).

Omówienie wyników

Obecność RF jest jednym z obowiązujących kryteriów rozpoznawania RZS, ale jak wykazano na podstawie niezwykle licznych badañ przeprowadzonych od momentu odkrycia tego czynnika w 1948 r., jego poważną wadą jest jedynie umiarkowana swoistość dla choroby i mała czułość w jej wczesnym okresie. Nowe generacje testów dla RF, zwłaszcza metoda ELISA bądź nefelometryczna, zwiększyły czułość markera wobec wyników uzyskiwanych klasycznymi metodami, np. wiązania lateksu, nadal jednak słabo sprawdzają się w diagnostyce różnicowej chorób tkanki łącznej związanych z zapaleniem stawów [9]. Niezależnie zaś od wykorzystywanej metody oznaczania, czułość RF dramatycznie zmniejsza się w przypadku RZS o krótkim czasie trwania objawów [10].
W omawianym badaniu IgM-RF oznaczano dwiema klasycznymi metodami – testem Lx oraz W-R. Dla przyjętych progów odcięcia wartości dodatnich występowanie IgM-RF w teście Lx stwierdzono u 45,1% chorych, a w teście W-R u zaledwie 30,6%. Ponieważ ostatecznie za seropozytywność dla czynnika reumatoidalnego uznawano wynik dodatni w przynajmniej jednym z testów, czułość IgM-RF osiągnęła wartość 46,8%.
Porównanie uzyskanych wyników z danymi pochodzącymi z publikowanych badañ nie jest łatwe z kilku powodów – różnorodność wykorzystywanych dla oznaczania RF testów jest bardzo duża, nie istnieje standaryzacja w tym zakresie, metody Lx bądź W-R są stosowane dość rzadko, a i wówczas nie zawsze autorzy badañ podają przyjmowany próg odcięcia mian dodatnich, co w sposób zasadniczy wpływa zarówno na uzyskiwaną czułość, jak i swoistość testu. Istotny jest również czas trwania choroby w badanych grupach pacjentów, gdyż jak wiadomo, czułość markerów RZS (zarówno RF, jak i aCCP) w początkowych jego stadiach jest niższa niż w przypadkach o tzw. ustalonym charakterze. Von Essen i wsp., badając chorych z wczesnym (do 12 mies.) RZS, 43,5% osób określili jako RF-dodatnie w teście W-R, a 70,6% w teście Lx [11]. Forslind i wsp., w podobnie zdefiniowanej grupie (czas trwania RZS średnio 7 mies.), obecność RF w metodzie Lx lub W-R stwierdzili u 57% chorych [12]. Ogólnie czułość RF we wczesnym okresie RZS przy zastosowaniu metod innych niż test Lx bądź W-R (ELISA, EIA, metoda immunoturbidymetryczna, metoda nefelometryczna, ulepszony lateksowo test immunonefelometryczny) w publikowanych badaniach mieści się w szerokim zakresie wartości (23–79%), zwykle niezadowalających z punktu widzenia przydatności diagnostycznej [10, 13–17].
Dla opracowanego przez Schellekensa w 1999 r. testu aCCP ELISA I generacji w zależności od analizowanej populacji pacjentów wartości czułości nowego markera zawierały się w granicach 45–80%, natomiast swoistość osiągała wartość 96–100% [17]. W pierwszym badaniu dotyczącym ilościowej charakterystyki przeciwciał aCCP w tym teście, wobec swoistości 97,8% i czułości 41%, test ELISA dla IgM-RF okazał się mniej swoisty – 84%, ale za to bardziej czuły – 62%, choć ta ostatnia wartość również nie była satysfakcjonująca [13]. W 2002 r. Vossenaar i wsp. opracowali test aCCP ELISA II generacji, którego czułość w populacji pacjentów w większości z długotrwałym RZS osiągnęła wartość 82%, przy zachowaniu swoistości 98,5%, przewyższając tym samym 80% czułość testu dla IgM-RF [7]. W badaniu van Gaalena i wsp. z 2005 r. w grupie chorych z wczesnym zapaleniem stawów (o czasie trwania do 24 mies.) wykazano z kolei niższą czułość – 54% testu II generacji, wobec swoistości 96% [18]. Bas i wsp. w przekrojowym badaniu z 2002 r. uzyskali dla chorych na RZS czułość aCCP2 68% wobec 75% IgM-RF oznaczanego metodą immunoenzymatyczną [19]. Z kolei Pinheiro i wsp. w grupie pacjentów z RZS o długim czasie trwania (średnio 12 lat) stwierdzili występowanie aCCP2 u 80% badanych [20].
W prezentowanym badaniu własnym czułość testu aCCP2 w grupie chorych z przeciętnym trwaniem objawów – 12 mies. osiągnęła 88,4%, będąc wartością niemal 2-krotnie wyższą w porównaniu z 46,8% dla IgM-RF. Autorzy japoñscy w badaniu sprzed kilku lat wykazali, że czułość aCCP dla RZS zwiększa się wraz z czasem trwania choroby i wynosi 72,3% dla okresu do 6 mies., 85% dla 6–12 mies. oraz 87,2% dla przekraczającego 2 lata, co niemal w zupełności odpowiada rezultatom omawianego badania [21]. Należy podkreślić, iż już wcześniej obserwowano, że przeciwciała aCCP są diagnostycznymi markerami bardzo wczesnego stadium RZS, choć z mniejszą czułością niż w przypadku RZS ustalonego [13, 22, 23].
Jednym z wymienionych wstępnie warunków przydatności testu serologicznego w rozpoznawaniu RZS powinno być również uzyskiwanie wyników dodatnich w grupach chorych RF-ujemnych. W poddanej badaniu populacji chorych osiągnięto w tym względzie zadziwiająco dobre wyniki. Wśród IgM-RF-ujemnych pacjentów z RZS czułość testu aCCP2 osiągnęła bowiem wartość 81,5%, a więc niewiele niższą niż uzyskaną dla wszystkich badanych.
O zmienności wyników podobnych analiz może świadczyć poniższe porównanie danych z piśmiennictwa. W pionierskim badaniu Schellekensa dodatni wynik aCCP1 stwierdzano u 35% RF-ujemnych chorych z RZS o czasie trwania do 26 mies. [17], a Kroot i wsp., w pracy opublikowanej w tym samym roku, opisali występowanie aCCP1 u 43% RF-ujemnych pacjentów z RZS o czasie trwania do roku [22]. Nieco później Meyer i wsp. w podobnie określonej grupie stwierdzili występowanie aCCP u 57% chorych [24]. Suzuki i wsp., posługując się już testem aCCP ELISA II generacji, w grupie chorych z wczesnym i ustalonym RZS stwierdzili obecność aCCP2 u 69,3% RF-ujemnych chorych [25]. Vallbracht i wsp. potwierdzili natomiast znaczną przydatność aCCP2, wykazując ich występowanie u 34,5% pacjentów seronegatywnych pod względem trzech izotypów RF-IgG, IgA i IgM, oznaczanych testem ELISA [26]. Należy podkreślić, iż w przedstawianej grupie chorych najmniejszy odsetek (zaledwie 1,7%) stanowili pacjenci, u których jedynym obecnym markerem serologicznym był czynnik reumatoidalny. Zdecydowaną większość stanowili chorzy charakteryzujący się występowaniem aCCP2, któremu w połowie przypadków towarzyszył IgM-RF. Przeciętne wartości aCCP2 w podgrupie chorych aCCP2-dodatnich (109,3 RU/ml) okazały się znacznie wyższe zarówno od progu odcięcia wyników dodatnich w wykorzystywanym teście (5 RU/ml), jak i od przeciętnej wartości w podgrupie pacjentów uznanych za aCCP2-ujemnych (1 RU/ml), różnicując tym samym wyraźnie te dwie podgrupy. Warto zaznaczyć, iż w analizowanej populacji u jedynego chorego z zespołem Felty’ego odnotowano bardzo wysoką wartość aCCP2 w surowicy – 1000 RU/ml, co pozostaje w zgodności z obserwacjami Vossenaara i wsp., którzy w grupie 12 pacjentów z tym rozpoznaniem testem aCCP ELISA I generacji stwierdzali wartości przekraczające 1000 jednostek [27].
W niniejszym badaniu zaobserwowano istnienie wzajemnego związku między występowaniem aCCP2 i IgM-RF, a także wyższych wartości tego pierwszego markera u chorych RF-dodatnich w porównaniu z RF-ujemnymi. Tego rodzaju wyniki potwierdzają również inni badacze [14]. Stwierdzono ponadto istotną statystycznie, choć słabą korelację między wartościami aCCP2 i mianem IgM-RF w metodzie Lx. Obecności podobnej korelacji (IgM-RF oznaczany metodą nefelometryczną) nie odnotowali Agrawal i wsp., w przeciwieñstwie do potwierdzonej również w ich badaniu zgodności występowania obu markerów, osiągającej 83% [28]. Greiner i wsp. obserwowali słabą, ale znaczącą liniową korelację mian IgM-RF i wartości aCCP, podobną do uzyskanej w przedstawianym badaniu [29].
Wniosek dotyczący istnienia związku między występowaniem obu markerów wydaje się zgodny z większością danych z piśmiennictwa [14, 22]. Mimo doniesieñ na temat istotnego nakładania się wyników dodatnich RF i aCCP z oznaczeñ w surowicy krwi chorych na RZS, dowody wskazują, że markery te są dwoma oddzielnymi układami autoprzeciwciał, o czym może świadczyć chociażby odmienny dla nich obu stosunek do obecności wspólnego epitopu SE (shared epitope) [30].

Wniosek

Przeciwciała aCCP oznaczane testem ELISA II generacji charakteryzują się wyższą czułością dla RZS w porównaniu z czynnikiem reumatoidalnym i mogą stanowić marker serologiczny niezwykle przydatny w rozpoznawaniu choroby, szczególnie u tych pacjentów, u których nie stwierdza się RF w surowicy krwi.

Piśmiennictwo

1. Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988; 31: 315-324. 2. Carson DA. Reumatoid factor. In: Textbook of Rheumatology. Kelly WN, Harris ED Jr., Ruddy S, et al. (eds). Philadelphia 1981; 677-690. 3. Smolen JS. Autoantibodies in rheumatoid arthritis. In: Manual of biological markers of disease. van Venrooij WJ, Maini RN (eds). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London 1996; C1: 1-18. 4. Biernacka E, Ząbek J. Celowość oznaczania czynnika reumatoidalnego w zestawieniu z wartością wykrywania innych przeciwciał występujących w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Reumatologia 2003; 41: 55-68. 5. Gioud-Paquet M, Auvinet M, Raffin T, et al. IgM rheumatoid factor (RF), IgA RF, IgE RF and IgG RF detected by ELISA in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 1987; 46: 65-71. 6. Jacoby RK, Jayson MI, Cosh JA. Onset, early stages and prognosis of rheumatoid arthritis: a clinical study of 100 patients with 11 year follow-up. Br Med J 1973; 2: 96-100. 7. Vossenaar ER, van Venrooij WJ, Pruijn GJM. Anti-CCP antibodies in (early) rheumatoid arthritis. In: From proteomics to molecular epidemiology: relevance of autoantibodies. Conrad K, Fritzler M, Meurer M, et al. (eds). Pabst Science Publishers, Lengerich 2002; 454-462. 8. Aletaha D, Eberl G, Nell VP, et al. Attitudes to early rheumatoid arthritis: changing patterns. Results of a survey. Ann Rheum Dis 2004; 63: 1269-1275. 9. Wolfe F. A comparison of IgM rheumatoid factor by nephelometry and latex methods: clinical and laboratory significance. Arthritis Care Res 1998; 11: 89-93. 10. Dubucquoi S, Solau-Gervais E, Lefranc D et al. Evaluation of anti-citrullinated filaggrin antibodies as hallmarks for the diagnosis of rheumatic diseases. Ann Rheum Dis 2004; 63: 415-419. 11. von Essen R, Kurki P, Isomäki H, et al. Prospect for an additional laboratory criterion for rheumatoid arthritis. Scand J Rheumatol 1993; 22: 267-272. 12. Forslind K, Vincent C, Serre G, et al. Antifilaggrin autoantibodies in early rheumatoid arthritis. Scand J Rheumatol 2000; 29: 320-322. 13. Bizzaro N, Mazzanti G, Tonutti E, et al. Diagnostic accuracy of the anti–citrulline antibody assay for rheumatoid arthritis. Clin Chem 2001; 47: 1089–1093. 14. Goldbach-Mansky R, Lee J, McCoy A, et al. Rheumatoid arthritis associated autoantibodies in patients with synovitis of recent onset. Arhritis Res 2000; 2: 236-243. 15. Lindqvist E, Eberhardt K, Bendtzen K, et al. Prognostic laboratory markers of joint damage in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2005; 64: 196-201. 16. Rantapää-Dahlqvist S, de Jong BA, Berglin E, et al. Antibodies against cyclic citrullinated peptide and IgA rheumatoid factor predict the development of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2003; 48: 2741-2749. 17. Schellekens GA, Visser H, de Jong BA, et al. The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide. Arthritis Rheum 2000; 43: 155-163. 18. van Gaalen FA, Visser H, Huizinga TW. A comparison of the diagnostic accuracy and prognostic value of the first and second anti-cyclic citrullinated peptides (CCP1 and CCP2) autoantibody tests for rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2005; 64: 1510-1512. 19. Bas S, Perneger TV, Seitz M, et al. Diagnostic tests for rheumatoid arthritis: comparison of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies, anti-keratin antibodies and IgM rheumatoid factors. Rheumatology (Oxford) 2002; 41: 809-814. 20. Pinheiro GC, Scheinberg MA, Aparecida da Silva M, et al. Anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in advanced rheumatoid arthritis. Ann Intern Med 2003; 139: 234-235. 21. Matsui T, Ozawa Y, Nakayama H, et al. Comparison of the clinical utilities of serological markers for the diagnosis of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2003; 48 (suppl.): 543. 22. Kroot EJ, de Jong BA, van Leeuwen MA, et al. The prognostic value of anti-cyclic citrullinated peptide antibody in patients with recent-onset rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2000; 43: 1831-1835. 23. Visser H, le Cessie S, Vos K, et al. How to diagnose rheumatoid arthritis early: a prediction model for persistent (erosive) arthritis. Arthritis Rheum 2002; 46: 357-365. 24. Meyer O, Labarre C, Dougados M, et al. Anticitrullinated protein/peptide antibody assays in early rheumatoid arthritis for predicting five year radiographic damage. Ann Rheum Dis 2003; 62: 120-126. 25. Suzuki K, Sawada T, Murakami A, et al. High diagnostic performance of ELISA detection of antibodies to citrullinated antigens in rheumatoid arthritis. Scand J Rheumatol 2003; 32: 197-204. 26. Vallbracht I, Rieber J, Oppermann M, et al. Diagnostic and clinical value of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies compared with rheumatoid factor isotypes in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2004; 63: 1079-1084. 27. Vossenaar ER, van Venrooij WJ. Anti-CCP antibodies, a highly specific marker for (early) rheumatoid arthritis. Clin App Immunol Rev 2004; 4: 239-262. 28. Agrawal S, Misra R, Aggarwal A. Autoantibodies in rheumatoid arthritis: association with severity of disease in established RA. Clin Rheumatol 2007; 26: 201-204. 29. Greiner A, Plischke H, Kellner H et al. Association of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies, anti-citrullin antibodies, and IgM and IgA rheumatoid factors with serological parameters of disease activity in rheumatoid arthritis. Ann N Y Acad Sci 2005; 1050: 295-303. 30. De Rycke L, Peene I, Hoffman IEA et al. Rheumatoid factor and anticitrullinated protein antibodies in rheumatoid arthritis: diagnostic value, associations with radiological progression rate, and extra-articular manifestations. Ann Rheum Dis 2004; 63: 1587-1593.