The prevalence and dynamics of beta-lactamase-producing Neisseria gonorrhoeae strains in 2010–2020

INTRODUCTION

Gonorrhea is the second most common bacterial sexually transmitted disease after chlamydia. According to estimates of global World Health Organization data, in 2020 there were over 82 million new infections [1]. The incidence in the European Union (based on reported cases) in 2018 was 26.9 [2] per 100,000 inhabitants, and in the United States in 2020 it was 206.5 [3]. In both of these regions, an increase in morbidity has recently been observed [2, 3]. The growing resistance of gonorrhea to drugs is also a worrying phenomenon. As a result, recommendations regarding the treatment of gonorrhea are often changed. However, the use of the currently recommended treatment of cefriaxone and azitromycin also does not always guarantee effectiveness, as concomitant resistance of Neisseria gonorrhoeae to these two antibiotics has been reported. Resistance to azithromycin is more common while sensitivity to ceftriaxone is maintained. Resistance to fluoroquinolones (ciprofloxacin), tetracyclines (doxycycline) or penicillin is even more common [4].
Although penicillin is no longer recommended for the treatment of gonorrhea, beta-lactamase production by N. gonorrhoeae should be monitored because of the potential for the development of extended-spectrum beta-lactamases. Beta-lactamases currently produced by this bacterium have a narrow spectrum of activity including penicillin, but not cephalosporins. The production of beta-lactamases is usually associated with a significant increase in the minimum inhibitory concentration (MIC) for penicillin (to > 1 mg/l, which meets the EUCAST operability criteria) [5]. The beta-lactamase most commonly produced by N. gonorrhoeae is TEM-1, but this bacterium can also produce TEM-135 and, less frequently, TEM-1B, TEM-220, TEM-141 or TEM-198, and new genetic variants are still being described [6–9]. These enzymes are encoded by genes contained in penicillinase plasmids, which can be transferred between bacterial cells together with conjugation plasmids. So far, 7 types of penicillinase plasmids have been found in gonorrhea: Asia (7405–7428 bp), Africa (5597–5601 bp) [10], Johannesburg (4865 bp), Toronto/Rio (5154–5161 bp), Nimes (6798 bp), New Zealand (9309 bp), Australia (3269 bp) [10–13].
Apart from beta-lactamases, the MIC of penicillins may be affected by mutations in chromosomal genes, which determine the overproduction of MtrCDE membrane pump proteins and increased removal of antibiotics from the bacterial cell, as well as concomitant amino acid substitutions in proteins: PenA, PorB1b and PonA. The above-mentioned mutations most often determine medium sensitivity (0.06 < MIC ≤ 1 mg/l), but they can also lead to resistance to penicillin, as well as be associated with increased MIC or resistance to cephalosporins [14–16].
Epidemiological genotyping is useful in studying the spread of antibiotic-resistant N. gonorrhoeae strains. In the case of N. gonorrhoeae, the NG-MAST (N. gonorrhoeae multi-antigen sequence typing) method is most often used, based on the study of porB gene fragments encoding porin and tbpB encoding transferrin binding protein. Other methods used include MLST (multi-locus sequence typing), NG-STAR 9 (N. gonorrhoeae sequence typing for antimicrobial resistance) and, increasingly, whole genome sequencing (WGS) [17].

OBJECTIVE

The aim of the study was to investigate the production of beta-lactamase in gonorrhea bacilli isolated from patients of the Department of Dermatology and Venereology of the Medical University of Warsaw in the years 2010–2020.

MATERIAL AND METHODS

A total of 1997 isolates of N. gonorrhoeae cultured from patients of the outpatient clinic of the Department of Dermatology and Venereology of the Medical University of Warsaw in the years 2010–2020 from swabs from the urethra, cervix, throat or anus, collected as part of routine diagnostics were examined. Bacteria were cultured on chocolate agar in an atmosphere containing 5% CO₂ (Genbox, bioMérieux, France) at 37°C and were identified on the basis of colony morphology, cell morphology in Gram stained microscope slides, oxidase test results, and sugar fermentation test (API NH, bioMérieux, France).
Cefinase assay (Becton Dickinson, USA) was used to test for the presence of beta-lactamase.
Bioethics Committee approval number AKBE/ 267/2022.

RESULTS

On average, 5.66% of the tested isolates produced beta-lactamase. Large changes were observed in the percentage of penicillinase producing isolates between 2010 and 2020: from 6.9% in 2010 this value decreased to 1.15 in 2015, and increased to 18.78% in 2018. This was followed by a decrease again and in 2020 none of the isolates tested produced beta-lactamases (table 1).

DISCUSSION

A significant increase in the percentage of peniclinase-producing N. gonorrhoeae isolates was observed (average: 5.66%) compared to isolates from the same center in 2006–2009 (average: 0.8%) [18]. Differences in the production of beta-lactamase in particular years may result from the spread of various clones of N. gonorrhoeae in Europe and Poland, characterized by the predominance of different mechanisms of drug resistance. In the years 2009–2013, the dominant NG-MAST genogroup in Europe was ST 1407, which had relatively frequent mutations in chromosomal genes causing increased MIC or resistance to penicillin and second generation cephalosporins and resistance to other antibiotics such as fluoroquinolones, tetracycline macrolides. However, the presence of penicillinase plasmids has been rarely reported [19–21]. EU studies from 2018 showed the dominance of several other genogroups at the same time, such as G11461, which may be related to other properties of the tested strains and a higher percentage of beta-lactamase producing strains [22]. In 2020, other genogroups with different characteristics may probably dominate, which translates into the rare occurrence of beta-lactamase.
It is worth noting, however, that the ability to produce beta-lactamase does not preclude the coexistence of chromosomal resistance mechanisms. N. gonorrhoeae strains with increased MIC for ceftriaxone (as a result of chromosomal mutations) and resistant to penicillin (producing TEM-1) have been described, among others, in in Japan [23].
The percentage of penicillinase-producing strains varies over time and also varies geographically. Most beta-lactamase-positive strains were detected in the Far East countries such as Bhutan (88.9%), Thailand (84%), Sri Lanka (63.6%) and India (45%) [24]. In South China in 2016-20, 53.29% of the tested strains produced beta-lactamase [25].
In Europe, in 2016, the highest percentage of penicillinase-producing strains of N. gonorrhoeae was detected in Sweden (24%), Austria (23.1%), the Czech Republic (21.1%), Greece (20%) and Malta (20%) [26].
Extended-spectrum beta-lactamases in N. gonorrhoeae have not been described so far, however, in the case of beta-lactamases found in some strains, a single point mutation would suffice for the enzyme to extend its spectrum of activity. On the other hand, it is uncertain how the presence of such an enzyme would affect the viability and spreading capacity of N. gonorrhoeae.

CONCLUSIONS

The percentage of N. gonorrhoeae strains producing beta-lactamase shows a high variability over time, which is probably related to the spread of strains belonging to different genogroups and significantly different from each other.

CONFLICT OF INTEREST

The authors declare no conflict of interest.

References

WPROWADZENIE

Rzeżączka jest drugą co do częstości występowania po chlamydiozie bakteryjną chorobą przenoszoną drogą płciową. Według szacunkowych globalnych danych Światowej Organizacji Zdrowia w 2020 roku stwierdzono ponad 82 mln nowych zakażeń [1]. Zachorowalność w Unii Europejskiej (na podstawie zgłoszonych przypadków) w 2018 roku wynosiła 26,9 [2] na 100 tysięcy mieszkańców, a w Stanach Zjednoczonych w 2020 roku 206,5 [3]. W obu powyższych rejonach ostatnio obserwuje się wzrost zachorowalności [2, 3]. Niepokojącym zjawiskiem jest również narastająca oporność dwoinek rzeżączki (Neisseria gonorrhoeae) na leki. W związku z tym często zmieniane są rekomendacje dotyczące leczenia rzeżączki. Jednak stosowanie aktualnie zalecanej terapii cefriaksonem i azytromycyną również nie zawsze gwarantuje skuteczność, ponieważ opisywano jednoczesną oporność Neisseria gonorrhoeae na te dwa antybiotyki. Częstsza jest oporność na azytromycynę przy zachowanej wrażliwości na ceftriakson. Jeszcze częściej występuje oporność na fluorochinolony (cyprofloksacynę), tetracykliny (doksycyklinę) lub penicylinę [4].
Mimo że penicylina nie jest już rekomendowana w leczeniu rzeżączki, wytwarzanie beta-laktamaz przez N. gonorrhoeae powinno być monitorowane ze względu na możliwość powstania enzymów o rozszerzonym spektrum działania. Aktualnie wytwarzane przez tę bakterię beta-laktamazy charakteryzują się wąskim spektrum działania obejmującym penicylinę, ale nie cefalosporyny. Produkcja beta-laktamaz wiąże się zwykle ze znacznym wzrostem minimalnego stężenia hamującego (minimum inhibitory concentration – MIC) dla penicyliny (do > 1 mg/l, co spełnia kryteria oporności według EUCAST) [5]. Najczęściej wytwarzaną przez N. gonorrhoeae beta-laktamazą jest TEM-1, jednak bakteria ta może wytwarzać również TEM-135, rzadziej TEM-1B, TEM-220, TEM-141 lub TEM-198, i wciąż opisywane są nowe warianty genetyczne [6–9]. Powyższe enzymy są kodowane przez geny zawarte w plazmidach penicylinazowych, które mogą być przekazywane między komórkami bakteryjnymi razem z plazmidami koniugacyjnymi. Dotychczas u dwoinek rzeżączki stwierdzono występowanie 7 typów plazmidów penicylinazowych: Asia (7405–7428 bp), Africa (5597–5601 bp) [10], Johannesburg (4865 bp), Toronto/Rio (5154–5161 bp), Nimes (6798 bp), New Zealand (9309 bp), Australia (3269 bp) [10–13].
Poza beta-laktamazami wpływ na MIC penicyliny mogą mieć mutacje w genach chromosomalnych warunkujące nadprodukcję białek pompy błonowej MtrCDE, zwiększone usuwanie antybiotyków z komórki bakteryjnej oraz jednocześnie występujące substytucje aminokwasów w białkach: PenA, PorB1b i PonA. Powyższe mutacje najczęściej warunkują średnią wrażliwość (0,06 < MIC ≤ 1 mg/l), jednak mogą również prowadzić do oporności na penicylinę, a także wiązać się z podwyższonym MIC lub opornością na cefalosporyny [14–16].
W badaniu rozprzestrzeniania się szczepów N. gonorrhoeae opornych na antybiotyki przydatne jest genotypowanie epidemiologiczne. W przypadku N. gonorrhoeae najczęściej wykorzystywana jest metoda NG-MAST (N. gonorrhoeae multi-antigen sequence typing) oparta na badaniu fragmentów genu porB kodującego porynę i tbpB kodującego białko wiążące transferynę. Inne wykorzystywane metody to MLST (multi-locus sequence typing), NG-STAR 9 (N. gonorrhoeae sequence typing for antimicrobial resistance) oraz coraz częściej sekwencjonowanie całego genomu (WGS) [17].

CEL PRACY

Celem artykułu było zbadanie wytwarzania beta-laktamazy u dwoinek rzeżączki izolowanych od pacjentów Kliniki Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w latach 2010–2020.

MATERIAŁ I METODY

badano łącznie 1997 izolatów N. gonorrhoeae wyhodowanych od pacjentów poradni Kliniki Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w latach 2010–2020 z pobieranych w ramach rutynowej diagnostyki wymazów z cewki moczowej, szyjki macicy, gardła lub odbytu. Bakterie hodowano na agarze czekoladowym, w atmosferze zawierającej 5% CO₂ (Genbox, bioMérieux, Francja), w temperaturze 37°C i identyfikowano na podstawie morfologii kolonii, morfologii komórek w preparatach mikroskopowych barwionych metodą Grama, wyników testu oksydazowego oraz testu fermentacji cukrów (API NH, bioMérieux, Francja).
Do zbadania obecności beta-laktamazy wykorzystano test z cefinazą (Becton Dickinson, USA).
Numer zgody Komisji Bioetycznej AKBE/267/2022.

WYNIKI

Beta-laktamazę wytwarzało średnio 5,66% badanych izolatów. Obserwowano duże zmiany odsetka izolatów wytwarzających penicylinazę w latach 2010–2020: z 6,9% w 2010 roku wartość ta spadła do 1,15% w 2015 roku i wzrosła do 18,78% w 2018 roku. Następnie ponownie odnotowano redukcję, a w 2020 roku żaden z badanych izolatów nie wywarzał beta-laktamazy (tab. 1).

OMÓWIENIE

Zaobserwowano znaczący wzrost odsetka izolatów N. gonorrhoeae wytwarzających penicylinazę (średnio 5,66%) w stosunku do izolatów pochodzących z tego samego ośrodka z lat 2006–2009 (średnio 0,8%) [18]. Różnice w wytwarzaniu beta-laktamazy w poszczególnych latach mogą wynikać z rozprzestrzeniania się w Europie i w Polsce różnych klonów N. gonorrhoeae charakteryzujących się przewagą różnych mechanizmów lekooporności. W latach 2009–2013 dominującą genogrupą NG-MAST w Europie była ST 1407, u których stosunkowo często występowały mutacje w genach chromosomalnych warunkujących podwyższone MIC lub oporność na penicylinę i cefalosporyny II generacji, a także oporność na inne antybiotyki, takie jak fluorochinolony, makrolidy lub tetracykliny. Natomiast obecność plazmidów penicylinazowych była opisywana rzadko [19–21]. Badania dotyczące Unii Europejskiej z 2018 roku wykazały dominację jednocześnie kilku innych genogrup, np. G11461, co może się wiązać z innymi właściwościami badanych szczepów i z wyższym odsetkiem szczepów wytwarzających beta-laktamazę [22]. W 2020 roku prawdopodobnie mogą dominować kolejne genogrupy o innej charakterystyce, co przekłada się na rzadkie występowanie beta-lakamazy.
Warto jednak zauważyć, że zdolność do wytwarzania beta-laktamazy nie wyklucza współistnienia chromosomalnych mechanizmów oporności. Szczepy N. gonorrhoeae z podwyższonym MIC dla ceftriaksonu (w wyniku mutacji chromosomalnych) i jednocześnie oporne na penicylinę (wytwarzające TEM-1) opisywano m.in. w Japonii [23].
Odsetek szczepów produkujących penicylinazę jest zmienny w czasie, a ponadto różni się w zależności od rejonu geograficznego. Najwięcej szczepów beta-laktamazododatnich wykrywano w krajach Dalekiego Wschodu, takich jak Butan (88,9%), Tajlandia (84%), Sri Lanka (63,6%) i Indie (45%) [24]. W południowych Chinach w latach 2016–2020 53,29% badanych szczepów wytwarzało beta-laktamazę [25].
W Europie w 2016 roku największy odsetek szczepów produkujących penicylinazę wykryto w Szwecji (24%), Austrii (23,1%), Czechach (21,1%), Grecji (20%) i na Malcie (20%) [26].
Dotychczas nie opisano beta-laktamaz o rozszerzonym spektrum u N. gonorrhoeae, jednak w przypadku beta-laktamaz stwierdzanych u niektórych szczepów wystarczyłaby punktowa pojedyncza mutacja, aby enzym rozszerzył swoje spektrum działania. Nie jest jednak pewne, jak obecność takiego enzymu wpłynęłaby na żywotność i zdolność rozprzestrzeniania się dwoinek rzeżączki.

WNIOSKI

Odsetek szczepów N. gonorrhoeae wytwarzających beta-laktamazę wykazuje dużą zmienność w czasie, co prawdopodobnie związane jest z rozprzestrzenianiem się szczepów należących do różnych genogrup i znacznie różniących się od siebie.

KONFLIKT INTERESÓW

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Piśmiennictwo