The role of BRCA1 mutations and G/C polymorphism of RAD51 in breast cancer

Wstęp
Rak piersi jest najczęstszym nowotworem złośliwym u kobiet. Roczna zachorowalność wynosi ponad 10 tys. (w 1996 r.). Zagrożenie rośnie wraz z wiekiem, szczególnie po menopauzie. Bardziej narażone są kobiety, u których występował rak piersi u krewnych I stopnia (matka, siostra), szczególnie gdy zachorowanie wystąpiło w okresie przed przekwitaniem. Do innych czynników, mogących zwiększać w różnym stopniu zagrożenie wystąpienia raka piersi należy wczesny wiek pierwszej miesiączki, późny wiek menopauzy, narażenie na promieniowanie jonizujące w młodym wieku, długotrwałe stosowanie środków antykoncepcyjnych, otyłość (zwłaszcza po menopauzie), późny wiek pierwszej ciąży lub ich brak, brak lub krótki okres karmienia piersią. Wiadomo, że ok. 95% raków piersi zachodzi sporadycznie, jednakże 5% jest uwarunkowanych dziedzicznie [1].
Do czynników prognostycznych w raku piersi zalicza się typ histologiczny raka, rozmiar guza, stan węzłów chłonnych pachowych, stopień złośliwości histologicznej, stopień proliferacji komórek rakowych, ploidię DNA – czyli zawartość DNA w komórkach raka, wiek chorej, receptory steroidowe, biomarkery inwazyjności: aktywatory i inhibitory plazminogenu oraz receptory czynników wzrostu o aktywności kinazy tyrozynowej [2, 3]. Obecność wielu markerów prognostycznych w raku piersi pozwala dostrzec, jak bardzo skomplikowany jest proces progresji tego nowotworu. Obecnie wiadomo, że defekty białek zaangażowanych bezpośrednio w naprawę DNA mają wpływ na zwiększoną podatność na nowotwory. W wielu typach komórek nowotworowych stwierdza się tego typu defekty, z czym wiąże się zmniejszona zdolność do naprawy uszkodzeń DNA. W procesach naprawczych biorą udział produkty białkowe ponad 70 genów.
Mutacje w genach supresorowych BRCA1 i BRCA2, których produkty białkowe uczestniczą w procesie naprawy DNA, traktowane są obecnie jako czynniki silnie predysponujące do zachorowania na raka piersi [4–6].
Wiadomo, że w naprawie dwuniciowych pęknięć DNA razem z BRCA1 i BRCA2 oddziałuje produkt białkowy genu RAD51 [7]. Białko BRCA1 jest negatywnym regulatorem cyklu komórkowego i w odpowiedzi na działanie czynników uszkadzających DNA blokuje replikację uszkodzonego DNA, umożliwiając w ten sposób proces naprawy. Białko BRCA2 bierze bezpośredni udział w naprawie, kontrolując funkcjonowanie głównego białka rekombinacyjnego RAD51 [8]. RAD51 wiąże się z jednoniciowym DNA powstającym na końcach podwójnego pęknięcia, co prowadzi do oddziaływania na drugą homologiczną cząsteczkę DNA i w wyniku dwóch crossing-over zostają restytuowane 2 prawidłowe dupleksy DNA. BRCA2 poprzez oddziaływanie z RAD51 blokuje jego zdolność do wiązania z jednoniciowym DNA, co jest istotne dla procesów prawidłowej replikacji.
Dane literaturowe sugerują, że podstawienie guaniny do cytozyny w pozycji 135 genu RAD51 tzw. polimorfizm G/C może być związany z ryzykiem raka piersi wśród chorych z mutacjami w genie BRCA2 [9, 10].
W pracy analizowano rozkład genotypów i częstości alleli polimorfizmu G/C oraz mutacji genu BRCA1 u kobiet z rakiem piersi w populacji łódzkiej.
Materiał i metody
Pacjentki
Krew została uzyskana od 50 kobiet z rakiem piersi typu przewodowego, u których stwierdzono obecność (n=30) lub brak przerzutów (n=20) do okolicznych węzłów chłonnych. U żadnej pacjentki nie stwierdzono przerzutów odległych. Pacjentki były w wieku od 40 do 82 lat (średnia wieku 58 lat). Średni rozmiar guza wynosił 20 mm (rozmiar od 17–32 mm). Stopień zaawansowania nowotworów został oceniony był wg skali Scarf-Bloom-Richardson. Badaniu zostało poddanych 20 nowotworów I stopnia, 12 stopnia II i 18 stopnia III. Grupę kontrolną stanowiły próbki krwi pobrane od 46 dobranych wiekowo kobiet, u których nie stwierdzono występowania raka piersi.
Izolacja DNA
DNA był izolowany z krwi z zastosowaniem komercyjnie dostępnego zestawu QIAmp Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) zgodnie z zaleceniami producenta.
Analiza polimorfizmu RAD51
Polimorfizm G/C genu RAD51 był określany poprzez reakcję PCR-RFLP ze starterami o następujących sekwencjach: 5’ TGG GAA CTG CAA CTC ATC TGG 3’ i 5’ GCG CTC CTC TCT CCA GCAG 3’. Reakcja PCR przeprowadzona była w termocyklerze Perkin-
Elmer/Gene Amp, PCR System 2400 thermal cycler. Mieszanina reakcyjna (25 ml) obejmowała 5 ng genomowego DNA, 0.2 mmol każdego ze starterów (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstad, Germany), 2.5 mM MgCl2, 1 mM dNTP i 1 U polimerazy Taq (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Warunki reakcji PCR były następujące 94°C przez 60 s, 54°C przez 30 s i 72°C przez 40 s, i obejmowały 35 cykli. Po trawieniu enzymem restrykcyjnym MvaI przez 4 godz. w 37°C amplifikowane fragmenty DNA rozdzielane były w 7% żelu poliakryloamidowym i po barwieniu bromkiem etydyny obserwowane w świetle UV. Każda próbka przypisywana była do jednego z trzech genotypów: G/G, G/C lub C/C (ryc. 1.).
Analiza mutacji BRCA1
Analiza mutacji genu BRCA1 została przeprowadzona w DNA uzyskanym z limfocytów krwi obwodowej z zastosowaniem komercyjnie dostępnego zestawu, zgodnie z zaleceniami producenta (Międzynarodowe Centrum Nowotworów Dziedzicznych, Szczecin, Polska).
Analiza statystyczna
Rejestrowana liczba każdego z genotypów była porównywana z liczbą oczekiwaną na podstawie prawa Hardy’ego-Weinberga z użyciem testu χ². Istotność różnic pomiędzy częstościami alleli i genotypów dla poszczególnych grup oceniana była testem χ². P<0,05 było określane jako wynik statystycznie znaczący.
Wyniki
W wyniku reakcji PCR wszystkie pacjentki i grupę kontrolną podzielono na 3 genotypy: G/G, G/C i C/C. Tab. I ukazuje rozkład genotypów w grupie chorych na raka piersi i w grupie kontrolnej. Oba rozkłady nie różniły się znacząco (P>0,05) od rozkładu przewidywanego przez prawo Hardy’ego-Weinberga. Nie stwierdzono różnic w częstościach alleli G i C pomiędzy pacjentami i kontrolą.
Rozkład genotypów polimorfizmu G/C RAD51 u chorych z przerzutami i bez przerzutów do węzłów chłonnych jest przedstawiony w tab. II. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w rozkładzie genotypów pomiędzy badanymi grupami (P>0,05).
Zależność rozkładu genotypów i częstości alleli od stopnia zaawansowania nowotworu wg skali Scarf-
-Bloom-Richardson została przedstawiona w tab. III. Nie było statystycznie istotnych różnic pomiędzy rozkładami genotypów w grupach o różnym stopniu zaawansowania nowotworu a rozkładem przewidywanym przez prawo Hardy’ego-Weinberga (P>0,05). Nie stwierdzono różnic w częstościach alleli G i C pomiędzy badanymi grupami (P>0,05).
Analiza mutacji genu BRCA1 została przeprowadzona w grupie chorych na raka piersi i w kontroli. W grupie 50 przebadanych kobiet stwierdzono mutację Ex20insC tylko w jednym przypadku.
Dyskusja
Uszkodzenia DNA mogą wynikać z narażenia na różnorodne substancje występujące w środowisku zewnętrznym lub wewnątrz komórki. Najwięcej uszkodzeń powstaje w procesach endogennych, przede wszystkim jako konsekwencje błędów w replikacji DNA. Źródłem uszkodzeń może być także wiele innych procesów endogennych, jak i czynników fizycznych, chemicznych i biologicznych w środowisku zewnętrznym. Wysoka częstość zmian DNA mogłaby mieć śmiertelne konsekwencje dla organizmu, gdyby nie była kontrolowana przez systemy naprawy DNA. W przypadku dziedzicznego raka piersi i jajnika w przypadku genów BRCA1 i BRCA2 stwierdzono związek pomiędzy transformacją nowotworową i wadliwą naprawą przez rekombinację homologiczną [11, 12]. Mechanizm ryzyka powstawania raka piersi w wyniku działania RAD51 nie jest jeszcze do końca poznany. Wiadomo, że RAD51 razem z BRCA1/BRCA2 uczestniczy w naprawie podwójnych pęknięć DNA [13, 14].
Formowanie kompleksu BRCA1/BARD1/RAD51 na uszkodzeniach replikującego DNA sugeruje, że białka te umożliwiają zachowanie integralności genomu [15]. Białko BARD1 (BRCA1-associated RING domain protein 1) zostało zidentyfikowane jako białko oddziałujące z domeną RING BRCA1 [16, 17].
Za jądrową lokalizację RAD51 wydaje się odpowiadać białko BRCA2. W komórkach pozbawionych białka BRCA2 obserwuje się akumulację aberracji chromosomowych, co sugeruje kluczową rolę tego białka dla procesu naprawy podwójnych pęknięć [18, 19].
W wielu typach nowotworów wykazano polimorfizmy genów białek naprawy DNA. Stwierdzono, że polimorfizm G/C genu RAD51 w regionie nieulegającym translacji (5’UTR) związany jest ze zwiększoną zapadalnością na raka piersi wśród osób z mutacjami w genie BRCA2 [20].
Biologiczne znaczenie polimorfizmu G/C RAD51 nie zostało jeszcze wyjaśnione i podlega dalszym badaniom. Lokalizacja polimorfizmu w regionie 5’UTR genu wskazuje, że może on wpływać na stabilność mRNA i proces translacji, powodując zmianę poziomu białka, które działa w multikompleksie BRCA1/BRCA2/RAD51 w naprawie DNA. Mutacje w genach BRCA1 i BRCA2 są bezpośrednio związane z rakiem piersi, zmienność genetyczna RAD51 może odgrywać rolę w rozwoju tej choroby. W raku piersi utrata heterozygotyczności RAD51 zachodzi w 32% przypadków [11], a redukcja poziomu białka RAD51 u 30% pacjentów [21].
W prezentowanej pracy skoncentrowano się na analizie polimorfizmu G/C RAD51 u chorych na raka piersi oraz u osób, u których nie stwierdzono choroby nowotworowej. Populacja chorych na nowotwór oraz grupa kontrolna były jednorodne pod względem płci oraz dobrane wiekowo. Nie wykazano związku pomiędzy polimorfizmem G/C a występowaniem raka piersi. Nie stwierdzono znaczących różnic w rozkładzie genotypów pomiędzy pacjentkami z przerzutami i bez przerzutów do okolicznych węzłów chłonnych. Sugeruje to brak związku pomiędzy polimorfizmem genu RAD51 a rozwojem raka piersi. W prezentowanej pracy przeprowadzonej w grupie 50 chorych na raka piersi mutację w genie BRCA1 typu Ex20insC stwierdzono tylko u jednej osoby o genotypie G/G.
W przedstawionej pracy nie stwierdzono związku pomiędzy mutacjami w genie BRCA1 a polimorfizmem RAD51. Wyniki sugerują, że polimorfizm G/C genu RAD51 może nie być bezpośrednio związany z występowaniem i rozwojem raka piersi, jednakże konieczne są badania większej populacji dla potwierdzenia tego przypuszczenia.

Praca powstała w oparciu o grant nr 3P05E07124 uzyskany z Komitetu Badań Naukowych (KBN).
Piśmiennictwo
1. Garber JE, Offit K. Hereditary cancer predisposition syndromes. J Clin Oncol 2005; 23: 276-92.
2. Ravaioli A, Bagli L, Zucchini A, Monti F. Prognosis and prediction of response in breast cancer: The current role of the main biological markers. Cell Proliferation 1998; 31; 113-26.
3. Hayes DF. Prognostic and predictive factors for breast cancer: translating technology to oncology. J Clin Oncol 2005; 23: 1596-97.
4. McInerney-Leo A, Biesecker BB, Hadley DW, et al. BRCA1/2 testing in hereditary breast and ovarian cancer families II: Impact on relationships. Am J Med Genet A 2005; 133: 165-69.
5. Scully R, Xie A. BRCA1 and BRCA2 in breast cancer predisposition and recombination control. J Mammary Gland Biol Neoplasia 2004; 9: 237-46.
6. Welcsh PL, Owens KN, King MC. Insights into the functions of BRCA1 and BRCA2. Trends Genet 2000; 16; 69-74.
7. Chen JJ, Silver D, Cantor S, et al. BRCA1, BRCA2, and Rad51 operate in a common DNA damage response pathway. Cancer Res 1999; 59: 1752-6.
8. Lo T, Pellegrini L, Venkitaraman AR, Blundell TL. Sequence fingerprints in BRCA2 and RAD51: implications for DNA repair and cancer. DNA Repair (Amst) 2003; 18: 1015-28.
9. Wang WW, Spurdle AB, Kolachana P, et al. A single nucleotide polymorphism in the 5’ untranslated region of RAD51 and risk of cancer among BRCA1/2 mutation carriers. Cancer Epidemiol Biomark Prev 2001; 10: 955-60.
10. Levy-Lahad E, Lahad A, Eisenberg S, et al. A single nucleotide polymorphism in the RAD51 gene modifies cancer risk in BRCA2 but not BRCA1 carriers. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 3232-6.
11. Scully R, Livingston DM. In search of the tumour-suppressor functions of BRCA1 and BRCA2. Nature. 2000; 408: 429-32.
12. Welcsh PL, Owens KN, King MC. Insights into the functions of BRCA1 and BRCA2. Trends Genet 2000; 16: 69-74.
13. Gonzalez R, Silvia JM, Dominguez G, Garcia JM. Detection of loss of heterozygosity at RAD51, RAD52, RAD54 and BRCA1 and BRCA2 loci in breast cancer: pathological correlations. Br J Cancer 1999; 81: 503-9.
14. Wick W. Evidence for a novel tumor suppressor gene on chromosome 15 associated with progression to a metastatic stage in breast cancer. Oncogene 1996; 12: 973-8.
15. Scully R, Chen J, Ochis RL, et al. Dynamic changes of BRCA1 subnuclear location and phosphorylation state are initiated by DNA damage. Cell 1997; 90: 425-35.
16. Wu LC, Wang ZW, Tsan JT, Spillman MA. Identification of a RING protein that can interact in vivo with the BRCA1 gene product. Nat Genet 1996; 14: 430-40.
17. Irminger-Finger I, Soriano JV, Vaudan G, et al. In vitro repression of BRCA1-associated RING domain gene, Bard1, induces phenotypic changes in mammary epithelial cells. J Cell Biol 1998; 143: 1329-39.
18. Van Gent DC, Hoeijmakers JH, Kanaar R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet 2001; 2: 196-206.
19. Takata M, Sasaki MS, Tachiiri S, et al. Chromosome instability and defective recombinational repair in knockout mutants of the five Rad51 paralogs. Mol Cell Biol 2001; 21: 2858-66.
20. Pierce AJ, Stark JM, Araujo FD, et al. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends Cell Biol 2001; 11: 52-9.
21. Yoshikawa K, Ogawa T, Baer R, et al. Abnormal expression of BRCA1 and BRCA1-interactive DNA-repair proteins in breast carcinomas. Int
J Cancer 2000; 88: 28-36.
Adres do korespondencji
dr n. med. Hanna Romanowicz-Makowska
Pracownia Biologii Molekularnej,
Zakład Patomorfologii Klinicznej
Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi
ul. Rzgowska 281/289
93-338 Łódź
tel. +48 42 271 2071
e-mail: smolbea@wp.pl