Torakochirurgia
Presence of CD25 antigen on lymphocytes of patients treated for non-small cell lung cancer (NSCLC)

Wstęp
Rak płuca jest od lat jednym z najważniejszych problemów współczesnej cywilizacji. Pomimo rozwoju nauk medycznych nie udało się osiągnąć istotnych postępów w jego leczeniu. Główną przyczyną jest jego skryty przebieg, co powoduje, że większość wykrywanych przypadków stanowią pacjenci, u których choroba ta jest już w wysokich stopniach zaawansowania. Nadzieję na poprawę tego stanu rzeczy wiąże się z dynamicznym w ostatnich czasach rozwojem niektórych gałęzi wiedzy z pogranicza medycyny i biologii, takich jak immunologia i genetyka, które mogą pomóc w lepszym poznaniu i zrozumieniu procesów zachodzących w trakcie patogenezy raka płuca, a także w poszukiwaniu nowych metod diagnostycznych i terapeutycznych. Podstawą badań w dziedzinie immunologii nowotworów jest fakt, że komórki ulegające przemianie nowotworowej nabierają w jej trakcie odrębnych od komórek prawidłowych cech antygenowych, stymulujących w sposób ciągły układ immunologiczny. Wydaje się, że w początkowej fazie rozwoju nowotworu mechanizmy nadzoru immunologicznego mogą odgrywać istotną rolę w eliminacji transformowanych komórek, których liczba nie przekracza krytycznej wielkości. Najistotniejszą rolę odgrywają tutaj komórki NK, makrofagi oraz niektóre limfocyty T cytotoksyczne. Jeżeli nowotwór ominie ten wstępny układ nadzoru, to może być następnie rozpoznany przez swoisty układ odpornościowy i wzbudzać odpowiedź humoralną i komórkową. Przeciwciała przeciw nowotworom oraz efektorowe limfocyty T współdziałają z mechanizmami nieswoistymi w walce z nowotworem [1, 2]. Dowiedziono, że wykładnikiem stanu odporności organizmu może być liczba i rodzaj limfocytów o określonym immunofenotypie oraz stan ich aktywacji. Dokładne ustalenie aktualnego stanu odpowiedzi immunologicznej było niezwykle trudne do czasu, gdy odkryto determinanty CD (cluster of differentiation), a do diagnostyki wprowadzono cytometrię przepływową i przeciwciała monoklonalne. Poszczególne etapy dojrzewania i aktywacji limfocytów charakteryzują się ekspresją ściśle określonych cząsteczek CD, dzięki którym możliwe stało się śledzenie procesów zachodzących w trakcie odpowiedzi immunologicznej, porównywanie ich natężenia w poszczególnych tkankach, a także zmian, jakim podlegają w zależności od zastosowanego leczenia. CD19 jest glikoproteiną występującą na wszystkich limfocytach B, niezależnie od ich stadium dojrzewania. Antygen CD4 występuje na limfocytach T, które rozpoznają antygeny MHC klasy II i najczęściej są to limfocyty pomocnicze. Cząstka CD8 jest natomiast charakterystyczna dla limfocytów T, które rozpoznają antygeny prezentowane w kontekście MHC klasy I i najczęściej są to limfocyty supresorowe i cytotoksyczne. Antygen CD25 obecny jest zarówno na aktywowanych limfocytach B, jak i T. Uważany jest za pośredni marker aktywacji limfocytów [3–7].
Cel pracy
Celem przeprowadzonych badań była: 1) ocena ekspresji antygenu CD25 na limfocytach T (CD4⁺, CD8⁺) i B (CD19⁺) we krwi obwodowej, guzie i najbliższym guza węźle chłonnym u chorych na NDRP, 2) porównanie odsetków badanych subpopulacji pomiędzy tkankami, 3) porównanie odsetków badanych limfocytów we krwi obwodowej u ludzi zdrowych i chorych na NDRP.
Materiał i metody
Badaniami objęto 29 kolejnych chorych na NDRP, w stopniu zaawansowania IB–IIIA, poddanych radykalnej resekcji zmian nowotworowych w Klinice Chirurgii Klatki Piersiowej AM w Lublinie. Warunkiem włączenia do grupy badanej (grupa 1.) było ustalenie typu histopatologicznego NDRP w okresie kwalifikacji do leczenia. Chorzy ci w okresie poprzedzającego miesiąca nie wykazywali cech infekcji, nie przyjmowali leków mających wpływ na układ immunologiczny, nie mieli wykonywanej transfuzji krwi lub preparatów krwiopochodnych, nie chorowali na choroby alergiczne. Dodatkowo 15 zdrowych ochotników stanowiło grupę odniesienia (grupa 2.). Ocenie poddano ekspresję antygenu CD25 na limfocytach T (CD4⁺, CD8⁺) i B (CD19⁺) we krwi obwodowej, guzie nowotworowym i drenującym węźle chłonnym wszystkich badanych chorych. U zdrowych ochotników zebranych w grupie 2. ocenie poddano jedynie krew obwodową. Krew z żyły odłokciowej, w ilości 15 ml, pobierano do heparynizowanych probówek, a następnie rozcieńczano zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej – PBS w proporcji 1:1. Węzły chłonne i fragmenty guza nowotworowego pozyskiwano w trakcie zabiegu operacyjnego. Materiał tkankowy homogenizowano, a uzyskaną zawiesinę filtrowano w celu usunięcia fragmentów tkanek. Rozcieńczoną krew oraz zawiesinę komórek z guza i węzła chłonnego nawarstwiano na preparat Gradisol L (Aqua Medica, Polska), a następnie wirowano w gradiencie gęstości przez 20 min przy przyspieszeniu 700x g. Uzyskane komórki płukano 2-krotnie w roztworze PBS, po czym oceniano ich liczbę w komorze Neubauera oraz żywotność za pomocą błękitu trepanu. Za pomocą cytometru przepływowego FACSCalibur firmy Becton Dickinson, USA wyposażonego w laser argonowy o długości fali 488 nm, oceniano natężenie odpowiedniej fluorescencji i na tej podstawie określano obecność odpowiednio wyznakowanych antygenów limfocytarnych. Analizę statystyczną otrzymanych wyników przeprowadzono za pomocą programu Statistica 5.0 PL. Wyniki przedstawiono jako średnie arytmetyczne ± odchylenie standardowe (SD), medianę, wartość najmniejszą szeregu statystycznego (min), wartość największą szeregu statystycznego (max). Zgodność rozkładu poszczególnych zmiennych w obrębie grup z rozkładem normalnym sprawdzono za pomocą testu Shapiro-Wilka. Ponieważ badane zmienne nie miały rozkładu normalnego, w dalszej analizie posłużono się testami nieparametrycznymi: U Manna Whitneya i kolejności par Wilcoxona. Wyniki jako istotne statystycznie przyjmowano przy poziomie istotności p£0,05.
Wyniki
Ocena udziału poszczególnych subpopulacji limfocytów w badanych tkankach u chorych na NSCLC Najwięcej limfocytów CD4⁺/CD25⁺ stwierdzono w obrębie węzła chłonnego (2,33±3,94%, mediana=0,81%). Odsetek tych limfocytów był istotnie wyższy (p=0,03) w stosunku do komórek tego typu znajdujących się we krwi obwodowej (1,03±0,98%, mediana =0,54%). Jednocześnie ich procent był wyższy w obrębie guza nowotworowego (2,08±2,12%, mediana=1,28%) w porównaniu z krwią. Nie stwierdzono natomiast istotnych statystycznie różnic między odsetkiem limfocytów CD4⁺/CD25⁺ w guzie i węźle chłonnym. Powyższe zależności prezentuje ryc. 1a. Odsetek limfocytów CD8⁺/CD25⁺ okazał się najwyższy w obrębie komórek naciekających zmianę nowotworową (0,95±1,23%). Ich procent we krwi obwodowej (0,18±0,25%, mediana =0,06%) był istotnie niższy niż w guzie i węźle chłonnym (0,62±1,63%, mediana =0,14%), (odpowiednio p=0,00016 i p=0,024). Równocześnie liczba tych komórek w guzie była istotnie wyższa niż w obrębie węzła chłonnego (p=0,041). Wyniki zobrazowano na ryc. 1b. Najwięcej limfocytów CD19⁺ mających na swej powierzchni receptor dla IL-2 (CD25) stwierdzono wśród komórek znajdujących się we krwi (1,23±5,25%, mediana=0,13%). Ich poziom był istotnie wyższy w stosunku do komórek tego typu w obrębie węzła chłonnego (0,53±0,6%, mediana=0,22%) i guza (0,56±0,45%, mediana=1,61%), (odpowiednio p=0,02 i p=0,005). Nie stwierdzono natomiast istotnych statystycznie różnic między procentem tych limfocytów w guzie i węźle chłonnym. Wyniki zilustrowano na ryc. 1c.
Porównanie odsetka badanych limfocytów we krwi obwodowej u chorych i zdrowych
Po porównaniu odsetków limfocytów charakteryzujących się poszczególnymi immunofenotypami w porównywanych grupach okazało się, że w grupie odniesienia statystycznie istotnie większy był poziom limfocytów CD8⁺/CD25⁺, (0,36±0,31%, mediana =0,19%), p=0,035. Natomiast we krwi pacjentów grupy 1. w porównaniu z osobami zdrowymi stwierdzono istotnie wyższy odsetek limfocytów CD19⁺/CD25⁺, które wynosiły (1,23±5,25%, mediana =0,13%), p=0,011. Zależności te przedstawia ryc. 2.
Dyskusja
Z powodu ciągłych trudności w zrozumieniu patogenezy chorób nowotworowych, a co za tym idzie, braku wysoce skutecznych metod terapeutycznych, naturalne stało się duże zainteresowanie zastosowaniem nowych technik immunologicznych. Ich użycie pozwoliło na wyjaśnienie wielu zjawisk zachodzących w organizmie w trakcie rozwoju choroby nowotworowej [8–11]. Mimo że NDRP stanowi tak ważny problem medyczny i społeczny, liczba prac odnoszących się do niego, a poświęconych zmianom poziomów poszczególnych subpopulacji limfocytów w przebiegu NDRP jest wybitnie ograniczona. Dlatego też w wielu przypadkach odnoszono uzyskane dane do aktualnego stanu badań dotyczących innych nowotworów. Dotychczasowe dane w piśmiennictwie wskazują, że obrona organizmu przeciwko nowotworom odbywa się głównie na drodze odpowiedzi komórkowej, a odpowiedź humoralna raczej sprzyja rozwojowi guza [12]. Limfocyty B biorą udział w jednej i drugiej, choć ich rola w odpowiedzi imfocytom CD4⁺ badacze poświęcali znacznie mniej uwagi. Ostatnie badania dowiodły, że limfocyty CD4⁺ sprawują prawdopodobnie kluczową rolę w regulacji przeciwnowotworowych procesów obronnych [15, 16]. Hung i wsp. dowiedli, że usunięcie limfocytów CD4⁺, poprzez blokadę odpowiednimi przeciwciałami lub eliminację genetyczną, powoduje brak odpowiedzi przeciwnowotworowej zarówno poprzez mechanizmy związane z limfocytami CD4⁺, jak i komórkami CD8⁺ [15, 17].
Porównując rozkład odsetków aktywowanych limfocytów T CD8⁺, stwierdzono, że zawartość procentowa limfocytów CD8⁺/CD25⁺ była największa w obrębie guza, mniejsza w węźle chłonnym, a najmniejsza w obrębie krwi obwodowej. Spostrzeżenia te mogą świadczyć o wysokim stopniu aktywacji limfocytów T CD8⁺ w obrębie guza i węzła chłonnego, a co za tym idzie, o skutecznej odpowiedzi komórkowej zachodzącej w obrębie tych tkanek. Z analizy powyższych wyników można wysnuć przypuszczenie, że aktywowane limfocyty T – CD8⁺ i CD4⁺ gromadzą się głównie w tkankach bezpośrednio dotkniętych procesem nowotworowym, a więc w guzie i węźle chłonnym. Podobne wyniki otrzymały zespoły badawcze pod kierownictwem Riemann, Kuo i Mazzoccoli [1, 10, 18] u chorych na raka płuca oraz zespół Kowalczyka u pacjentów z rakiem nerki [13]. Porównując poszczególne subpopulacje aktywowanych limfocytów w grupie 1. w stosunku do grupy kontrolnej, istotne statystycznie różnice stwierdzono w procentowej zawartości limfocytów CD8⁺/CD25⁺ i CD4⁺/CD25⁺, których większy odsetek zanotowano we krwi zdrowych ludzi, oraz CD19⁺/CD25⁺, których procent przeważał u pacjentów z grupy 1. Przewaga odsetka limfocytów CD19⁺/CD25⁺ we krwi obwodowej u chorych na NDRP może być przejawem immunosupresyjnego wpływu nowotworu poprzez aktywację odpowiedzi, w której główną rolę sprawują limfocyty pomocnicze Th2. Produkują one cytokiny będące czynnikami wzrostu i różnicowania limfocytów B i wspomagają głównie odpowiedź humoralną, która jest uznawana za sprzyjającą rozwojowi guza [19, 20]. Wytłumaczeniem, dlaczego aktywowane limfocyty CD8⁺/CD25⁺ i CD4⁺/CD25⁺ występują w większym odsetku we krwi ludzi zdrowych, może być fakt, że u chorych na NDRP aktywowane limfocyty T gromadzą się w tkankach wciągniętych bezpośrednio w proces nowotworowy, a więc w guzie i węzłach chłonnych. U zdrowych osób aktywowane limfocyty krążą we krwi, oczekując na sygnał do działania. Ostatnio jest prowadzonych wiele badań nad zastosowaniem szczepionek przeciwnowotworowych z użyciem antygenów rakowych. Kliniczna skuteczność tej terapii jest jednak ograniczona, pomimo że większość pacjentów ma prekursory limfocytów specyficznych dla antygenów użytych w szczepieniach. Możliwe, że odsetkowa przewaga limfocytów T regulujących odpowiedzialna jest za słabą odpowiedź na to leczenie. W wielu badaniach wykazano, że zredukowanie poziomu limfocytów CD4⁺/CD25⁺ w obrębie nacieku nowotworowego powodowało zwiększenie odpowiedzi związanej z limfocytami CD8⁺, prowadzącej do odrzucenia guza [21, 22].
Wnioski
Zebrane informacje sugerują istotny udział poszczególnych subpopulacji limfocytów w przebiegu NDRP. Obniżony odsetek aktywowanych limfocytów CD8⁺ u chorych na NDRP w porównaniu z osobami zdrowymi może być związany osłabieniem odpowiedzi komórkowej, a co za tym idzie, odpowiedzi przeciwnowotworowej. Natomiast wzrost procentu limfocytów CD4⁺ oraz CD19⁺ noszących na swej powierzchni marker CD25 u osób chorych w porównaniu ze zdrowymi może świadczyć o aktywacji odpowiedzi typu Th2, która może być przejawem immunosupresyjnego wpływu nowotworu.
Praca wyróżniona przez Komitet Naukowy III Kongresu Polskiego Towarzystwa Kardio-Torakochirurgów, Wrocław, 18–20.05.2006.



Piśmiennictwo
1. Kuo SH, Chang DB, Lee YC, et al. Tumor-infiltrating lymphocytes in non-small cell lung cancer are activated T lymphocytes. Respiratology 1998; 3: 55-9. 2. Maine GN, Mule JJ. Making room for T cells. J Clin Invest 2002; 15: 157-9. 3. Hol B, Hintzen R, Van Lier R, et al. Soluble and cellular markers of t cell activation in patients with pulmonary sarcoidosis. Amer Rev Resp Dis 1993; 148: 643-9. 4. Kahn M, Sugawara H, McGowan P, et al. CD4⁺ T cell clones specific for the human p97 melanoma associated antigen can eradicate pulmonary metastases from a murine tumor expressing the p97 antigen. J Immunol 1991; 146: 3235-42. 5. Smith KA. The interleukina 2 receptor. Annu Rev Cell Biol 1989; 5: 397-425. 6. Vilella R, Mila J, Sole J, et al. Sequential appearance of the activation antigens. Leucocyte typing IV. Oxford University Press 1989: 495-8. 7. Woo Y, Yeh H, Chu CS, et al. Cutting edge: regulatory t cells from lung cancer patients directly inhibit autologous T cell proliferation. J Immunol 2002; 168: 4272-6. 8. Cottrell JJ, Freeson PF, Preoperative assessment of the thoracic surgical patient. Clin Chest Med 1992; 13: 47-56. 9. Greenberg PD. Adoptive T cell therapy of tumors: mechanisms operative in recognition and elimination of tumor cells. Adv Immunol 1991; 49: 281-355. 10. Mazzocoli G, Grilli M, Caroughi S, et al. Immune systems alterations in lung cancer patients. Int J Immunopahol Pharmacol 2003; 16: 167-74. 11. Michalek J, Buchler T, Hajek R. T Lymphocyte therapy of cancer. Physiol Res 2004; 53: 463-9. 12. Barbera-Guillem E, Nelson MB, Barr B, et al. B lymphocyte pathology in human colorectal cancer. Experimental and clinical therapeutic effects of partial B cell depletion. Cancer Immunol Immunother 2000; 48: 541-9. 13. Kowalczyk D, Skorupski W, Kwias Z. Flow cytometric analysis of TIL in patients with renal carcinoma. Br J Urol 1997; 80: 543-7. 14. Mitropoulos D, Kooi S, Rodriguez-Villanueva J, et al. Characterization of fresh (uncultured) tumor-infiltrating T lymphocytes (TIL) and TIL-derived T cell lines from patients with renal cell carcinoma. Clin Exp Immunol 1994; 97: 321-7. 15. Bennett SR, Carbone FR, Karmalis F, et al. induction of a CD8⁺ cytotoxic t lyphocyte response by cross-priming requires cognate CD4⁺ T cell help. J Exp Med 1997; 186: 65-70. 16. Manici S, Sturnilo MA, Imro J, et al. Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4⁺ cytotoxic cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11. J Exp Med 1999; 189: 1965-71. 17. Cho Y, Miyamoto M, Kato K, et al. CD4⁺ and CD8⁺ T cells cooperate to improve prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res 2003; 63: 1555-9. 18. Riemann D, Wenzel K, Schulz T, et al. Phenotypic analysis of T lymphocytes isolated from non-small-cell lung cancer. Int Arch Immunolog 1997; 114: 38-45. 19. Ito N, Nakamura H, Metsugi H, et al. Dissociation between T helper type 1 and type 2 differentiation and cytokine production in tumor-infiltrating lymphocytes in patients with lung cancer. Surg Today 2001; 31: 390-4. 20. Van den Hove LE, Van Gool SW, Van Poppel H, et al.: Phenotype, cytokine production and cytolytic capacity of fresh (uncultured) tumor-infiltrating T lymphocytes in human renal cell carcinoma. Clin Exp Immunol 1997; 109: 501-9. 21. Nagai H, Hara T, Horikawa M, et al. Elimination of CD4⁺ T cells enhances anti-tumor effect of locally secreted interleukin-12 on B16 mouse melanoma and induces vitiligo-like coat color alteration. J Inv Dermatol 2000; 115: 1059-64. 22. Onizuka S, Tawara J, Shimizu S, et al. Tumorrejection by in vivo administration of anti-CD25 (interleukin-2 receptor alpha) monoclonal antibody. Cancer Res 1999; 59: 3128-33.