Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) in blood of patients with colon and breast cancer

Wstęp

Czynniki układu fibrynolizy biorą czynny udział w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych, w tym także w rozroście nowotworowym. Za jego inwazję i tworzenie przerzutów odpowiedzialne są neoangiogeneza i migracja komórek nowotworowych. Składniki układu plazminogen–plazmina występują w wielu nowotworach, a ich zwiększona ekspresja wskazuje nie tylko na wzmożoną aktywność, ale także na dużą wartość prognostyczną. Urokinazowy aktywator plazminogenu (u-PA) i tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA) znajdują się w komórkach nowotworowych, u-PA ze swoim receptorem u-PAR bierze udział w czynności komórek, podczas gdy t-PA ze swoim receptorem anneksyną II upłynnia wewnątrznaczyniowe złogi fibryny na powierzchni komórek śródbłonka. Hamowanie procesu fibrynolizy może przyczyniać się także do powstawania powikłań zakrzepowo-zatorowych.
Wśród inhibitorów fibrynolizy kluczową rolę odgrywa PAI-1 biorący udział w wielu chorobach naczyń (np. w zawale serca), jak również w patogenezie nowotworów. Inhibitor aktywatorów plazminogenu typu 1 (plasminogen activator inhibitor type 1 – PAI-1) jest glikoproteiną syntetyzowaną przez komórki śródbłonka, megakariocyty, hepatocyty i komórki nowotworowe, hamującą t-PA i u-PA. Może on wpływać na migrację komórek nowotworowych przez blokowanie ich połączenia z wiktronektyną – składnikiem macierzy zew­nątrz­­­komórkowej. Inhibitor aktywatorów plazminogenu typu 1, inaktywując u-PA, chroni komórki nowotworowe przed proteolizą. Duże stężenie PAI-1 często łączy się z niekorzystnym rokowaniem i świadczy o wzroście i inwazyjności nowotworów, w tym także raka piersi i raka jelita grubego [1–5].
Innym działaniem w procesie hamowania fibrynolizy charakteryzuje się trombinowy inhibitor fibrynolizy (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor – TAFI) oczyszczony i scharakteryzowany przez Bajzara i wsp. [6, 7]. Trombinowy inhibitor fibrynolizy jest znany także pod nazwą prokarboksypeptydazy B, a aktywna jego forma pojawia się podczas procesu krzepnięcia i stanów zapalnych.
Trombinowy inhibitor fibrynolizy jest uważany za ogniwo łączące proces krzepnięcia i fibrynolizy. Należy go odróżnić od karboksypeptydazy N i jej podjednostek obecnych także we krwi. Trombinowy inhibitor fibrynolizy pochodzenia ludzkiego jest glikoproteiną i jako proenzym ma masę cząsteczkową ok. 65 kDa, która po aktywacji zmniejsza się do 35 kDa. Stężenia trombiny niezbędne do aktywacji pro-TAFI muszą być dużo większe niż ilości potrzebne do wykrzepiania fibryny. Za aktywację pro-TAFI do TAFI odpowiedzialna jest trombina w kompleksie z trombomoduliną (T/TM) – śródbłonkowym receptorem trombiny. Kompleks T/TM nasila ten efekt aktywacyjny ponad 1000 razy, dlatego kompleks ten uznano za fizjologiczny aktywator tego inhibitora. Należy pamiętać, że kompleks T/TM aktywuje też białko C (PCa), które ze swoim kofaktorem – białkiem S – inaktywują aktywne czynniki krzepnięcia VIIIa i Va. Prawdopodobnie dlatego PCa może również przekształcać pro-TAFI w TAFI. Trombinowy inhibitor fibrynolizy chroni zatem zakrzep przed nadmierną fibrynolizą.
Trombinowy inhibitor fibrynolizy, mając aktywność karboksypeptydazy, odszczepia z C końcowej części łańcucha -fibryny reszty aminokwasowe lizyny i argininy, które są niezbędne do wiązania w strukturze fibryny t-PA oraz plazminogenu. W sieci włóknika obniża się zatem plazminogeneza, a zdegradowana przez TAFI fibryna nie będzie ulegać dalszemu procesowi fibrynolizy. Nie będą powstawać produkty degradacji fibryny (FDP), obecnie najczęściej oznaczane jako D-dimery [9–15].
Nieliczne są publikacje o roli TAFI w patogenezie chorób nowotworowych i kontrowersyjne poglądy na temat stężenia tego inhibitora we krwi osób zdrowych. W dostępnym piśmiennictwie nie znaleziono prac na temat stężenia TAFI we krwi chorych na raka jelita grubego i raka piersi.
Celem pracy była ocena stężeń TAFI w osoczu krwi chorych na raka jelita grubego i raka piersi w porównaniu z grupą osób zdrowych.

Materiał i metody

Badaniem objęto 3 grupy:
• 27 pacjentów z rozpoznaniem raka jelita grubego o różnym umiejscowieniu, w tym 15 mężczyzn i 12 kobiet w wieku 38–83 lat (średnio 65 lat),
• 37 chorych kobiet z rozpoznaniem raka piersi w wieku 36–69 lat (średnio 53 lata),
• 20 klinicznie zdrowych osób, w tym 12 mężczyzn i 8 kobiet w wieku 19–56 lat (średnio 41 lat); osoby te miały prawidłowe wyniki podstawowych badań laboratoryjnych i zostały zakwalifikowane przez Stację Krwiodawstwa do pierwszego oddania krwi.
Pacjenci dwóch pierwszych grup byli zdiagnozowani i operowani na Oddziale Chirurgii Onkologicznej. Chorzy mieli przeprowadzoną weryfikację histologiczną guzów pobranych podczas operacji. U pacjentów określono stopień klinicznego zaawansowania, wielkość guzów wg klasyfikacji TNM i skalę złośliwości „G” (Richardsona-Blooma). U pacjentek z rakiem piersi zbadano także obecność receptorów ER, PGR i Her-2.
Dane dotyczące klasyfikacji chorych na oba rodzaje nowotworów przedstawiono w tabeli 1.
Materiał do badań stanowiło osocze krwi pobranej od pacjentów przed operacją przy okazji pobierania jej do innych rutynowych badań laboratoryjnych, a u osób zdrowych w Stacji Krwiodawstwa przed pierwszym oddaniem krwi.
Krew pobierano do 3,8-procentowego roztworu cytrynianu sodu w proporcji 9 : 1, wirowano przez 20 min celem uzyskania osocza ubogopłytkowego, które rozpipetowano po 0,2 ml do probówek typu Eppendorfa i zamrażano w temperaturze –70°C nie dłużej niż 6 miesięcy.
W rozmrożonych próbkach osocza cytrynianowego oznaczano antygen TAFI metodą immunoenzymatyczną (ELISA) przy użyciu komercyjnego zestawu Imubind TAFIa/ai Antigen ELISA firmy American Diagnostica zgodnie z informacją producenta. Test ten mierzy stężenie antygenu TAFIa i TAFIai w osoczu krwi i innych płynach ustrojowych. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej.
Obliczenia statystyczne wykonano za pomocą programu Statistica firmy StatSoft. Zgodność rozkładu badanego parametru z rozkładem normalnym sprawdzono testem Shapiro-­-Wilka. W grupie chorych na raka jelita grubego i raka piersi oraz w grupie kontrolnej stężenie TAFI miało rozkład normalny, dlatego parametr ten przedstawiono w postaci wartości średniej (x-) i średniego odchylenia standardowego (SD). Istotność między poszczególnymi grupami oceniano testem t-Studenta dla grup niezależnych. Różnice uznano za znamienne dla poziomu istotności p < 0,005.

Wyniki

W tabeli 2. przedstawiono liczbę badanych osób w poszczególnych grupach, ich średni wiek z rozrzutem wartości oraz stężenia TAFI wyrażone w ng/ml w postaci średniej arytmetycznej i odchylenia standardowego (SD) w grupie kontrolnej oraz u chorych na raka jelita grubego i raka piersi.
Jak wynika z danych przedstawionych w tabeli 2., średnie stężenia TAFI w grupie chorych na raka jelita grubego i raka piersi są podobne jak w grupie kontrolnej. Nie stwierdzono istotnych różnic w stężeniu TAFI między kobietami i męż­czyz­nami, a także między pacjentami w różnym wieku.
W tabeli 3. przedstawiono średnie stężenia TAFI w raku jelita grubego i raku piersi w trzech stadiach zaawansowania klinicznego, w trzech różnych wielkościach guzów wg klasyfikacji TNM oraz trzech stopniach złośliwości wg skali „G” (wg Blooma-Richardsona).
W skali „G” w stopniu złośliwości G1 w raku jelita grubego stwierdzono istotnie mniejsze stężenie TAFI niż w stopniu G1 w raku piersi. Natomiast w raku jelita grubego w stopniu złośliwości G2 wobec G1 stężenie TAFI istotnie się zwiększało, a w raku piersi było istotnie mniejsze. Ponadto nadmienić trzeba, że we wszystkich badanych grupach występował dosyć duży rozrzut wartości stężeń TAFI: w grupie kontrolnej 45,2–80,3 ng/ml, w raku jelita grubego 38,2–75,9 ng/ml, a w raku piersi 48,5–85,6 ng/ml.

Dyskusja

W większości publikacji dotyczących TAFI jego pomiar jest oparty na ocenie aktywności wyrażonej w procentach w porównaniu z grupami referencyjnymi ludzi zdrowych. Osoczową aktywność TAFI badano najczęściej metodą opisaną przez Mosiniera i wsp. polegającą na aktywacji TAFI przez kompleks trombina–trombomodulina (T/TM) i pomiarze aktywnego TAFI na substracie z hipurylo-argininą [15].
Tylko w pojedynczych pracach badacze posługują się pomiarem stężenia TAFI, stosując komercyjny zestaw opracowany przez American Diagnostica pod nazwą Imubind TAFIa/ai Antigen ELISA. Analizując te nieliczne publikacje, trudno ocenić prawidłowe stężenia TAFI w grupach ludzi zdrowych. W ulotce informacyjnej producenta opisującej metodę pomiaru TAFIa/ai podano jako prawidłową wartość w ludzkim osoczu stężenie 0–30 ng/ml. Uszyński i wsp. w 2003 r. podali dla kobiet grupy kontrolnej wartość 11,35 g/ml [sądzę, że zaszła pomyłka i chodzi nie o ml, lecz o l (litr)] [16], a w 2007 r. autorzy ci podali jako wartość średnią stężenia TAFI w grupach kobiet nieciężarnych 72,55 ng/ml z rozrzutem wartości 67,50–76,69 ng/ml, a u kobiet ciężarnych – 55,46 ng/ml [17]. Być może dlatego niektórzy autorzy również osoczowe stężenia TAFI wyrażają w procentach [18].
W przeprowadzonych przez autorów niniejszej pracy badaniach 20-osobowej grupy ludzi zdrowych średnie stężenie TAFIa/ai wynosiło 59,9 ±11,5 ng/ml z dosyć dużym rozrzutem wartości 45,2–80,3 ng/ml. Stężenia TAFI podane przez Uszyńskiego i wsp. w 2007 r. mogłyby się mieścić w tym zakresie. Zarówno w grupie referencyjnej, jak i u chorych na raka jelita grubego i raka piersi autorzy niniejszej pracy nie stwierdzili różnic zależnie od płci i wieku, podobnie jak w badaniach innych autorów [18–20]. Wprawdzie Santamaria i wsp. odnotowali nieco mniejsze wartości TAFI u kobiet w wieku poniżej 31. roku życia, a większe stężenie TAFI u kobiet z hipercholesterolemią [21]. W naszej grupie kontrolnej nie było kobiet w wieku poniżej 31. roku życia; natomiast nie mierzyliśmy u nich poziomu cholesterolu. Poza tym nasza grupa referencyjna była zbyt mała, aby wyciągnąć właściwe wnioski. Interesująca jest publikacja Santamaria i wsp., opisująca przeprowadzone przez autorów w Hiszpanii badania populacyjne stężenia TAFI u 303 osób, w tym 167 kobiet i 136 mężczyzn, w której stwierdzono brak zależności TAFI od płci i wieku (u kobiet powyżej 31. roku życia), nadciśnienia tętniczego, cukrzycy, otyłości, palenia tytoniu, picia alkoholu i obciążających historii rodzinnych. Jedynie kobiety z hipercholesterolemią miały istotnie wyższą aktywność TAFIa [21]. Ciekawe, ale niewyjaśnione, jest spostrzeżenie Uszyńskiego i wsp. o dużym stężeniu TAFIa/ai we krwi pępowinowej tłumaczone zmianami hormonalnymi płodu [16]. Ponieważ TAFI jest głównie syntetyzowany w wątrobie, podobnie jak witamino-K-zależne czynniki krzepnięcia, których stężenie we krwi pępowinowej jest zmniejszone, może chodzi tutaj o czynność wyrównawczą i ochronę noworodków przed krwawieniami. Rola TAFI w patogenezie nowotworów nie jest w pełni poznana. W badaniach in vivo na modelu myszy brak genu TAFI nie wpływał na wzrost guza i powstawanie przerzutów [22]. W hodowlach komórek niedrobnokomórkowego raka płuca obserwowano uwalnianie TAFI. U chorych na ten nowotwór także stwierdzano zwiększone stężenia TAFI [23, 24].
W badaniach autorów niniejszej pracy stężenia antygenu TAFIa/ai we krwi chorych na raka piersi i raka jelita grubego były bardzo podobne jak w grupie kontrolnej i nie zależały od płci i wieku badanych. Typ histopatologiczny guzów, stopień zaawansowania klinicznego, klasyfikacja wg skali TNM nie miały wpływu na badane stężenia TAFI w osoczu krwi chorych na raka piersi i raka jelita grubego. Inaczej natomiast zachowywały się oba rodzaje guzów w klasyfikacji wg stopnia złośliwości w skali „G”. W raku piersi w stadium G1 stężenie TAFI było istotnie większe niż w G2 (p < 0,01), tzn. wzrost złośliwości z G1 do G2 zmniejszał stężenie TAFI, natomiast w raku jelita grubego w stadium G1 było istotnie niższe (p < 0,025) niż w G2 i G3, tzn. wzrost złośliwości w raku jelita grubego powodował większe stężenia TAFI. Zatem stężenia TAFI w obu rodzajach nowotworów zachowywały się odmiennie. Do potwierdzenia tej obserwacji konieczne są większe grupy badanych.
W dostępnym piśmiennictwie nie znaleziono danych na ten temat. W jednej tylko publikacji badano wpływ chemioterapii na poziom osoczowego TAFI i PAI-1 w operacyjnym raku piersi [25]. Autorzy ci nie stwierdzili różnic w stężeniach TAFI, porównując okres przedoperacyjny i po chemioterapii. Nie porównywali jednak stężenia TAFI we krwi chorych na raka piersi z występującym w grupie kontrolnej czy z normą laboratoryjną. Zwiększone stężenie TAFI stwierdzono w zakrzepicy żył głębokich, rozsianym wewnątrznaczyniowym wykrzepianiu (DIC), chorobie niedokrwiennej serca i udarze mózgu [26]. Zmniejszone stężenie TAFI obserwowano natomiast w chorobach zapalnych jelit, w przewlekłych chorobach wątroby i jej marskości oraz ostrej białaczce promielocytowej [27–29]. Małe stężenie TAFI wydaje się zdeterminowane genetycznie i może zależeć od polimorfizmu genu TAFI. Polimorfizm 1040C/T genu TAFI ma być związany z ryzykiem zachorowania na raka jamy ustnej [30, 31].

Podsumowując:
1. W osoczu krwi osób zdrowych mężczyźni i kobiety niezależnie od wieku mają jednakowe stężenie TAFI.
2. We krwi chorych na raka piersi i raka jelita grubego stwierdzono podobne jak w grupie referencyjnej stężenia TAFI.
3. Rozpoznanie histologiczne, stopień klinicznego zaawansowania oraz klasyfikacja wg skali TNM nie miały wpływu na stężenia TAFI w osoczu krwi chorych na raka jelita grubego i raka piersi.
4. Wzrost stopnia złośliwości obu nowotworów w skali G1 do G2 powodował niewielkie, lecz statystycznie istotne zmiany stężenia TAFI.

Piśmiennictwo

 1. Buo/ L, Bjo/rnland K, Karlsrud TS, et al. Expression and release of plasminogen activators, their inhibitors and receptors in human tumors cell lines. Anticancer Res 1994; 14: 2445-51.  
2. Harbeck N, Thomssen C, Berger U, et al. Invasion marker PAI-1 remains a strong prognostic factor after long term follow up both for primary breast cancer and following first relapse. Breast Cancer Res Treat 1999; 54: 147-57.  
3. Pietrusińska E, Kotschy M, Ziółkowska E. Inhibitor aktywatorów plazminogenu typu 1 (PAI-1) w wyciągach tkankowych raka piersi. Wspolcz Onkol 2004; 8: 219-22.  
4. Rydzkowski M, Kotschy M, Banaszkiewicz Z i wsp. Aktywatory plaz­minogenu typu urokinazowego (u-PA) i tkankowego (t-PA) w osoczu krwi i wyciągach raka jelita grubego. Valetudinaria. Post Med Klin Wojsk 2004; 9: 64-9.  
5. Kwaan HC, McMahon B. The role of plasminogen-plasmin system in cancer. Cancer Treat Res 2009; 148: 43-66.  
6. Bajzar L, Manuel R, Neisheim ME. Purification and characterization of TAFI, a thrombin activatable fibrinolysis inhibitor. J Biol Chem 1995; 270: 14777-84.  
7. Bajzar L, Morser J, Neisheim ME. TAFI or plasma procarboxypeptidase B couples of coagulation and fibrinolytic cascades through the thrombin-thrombomodulin complex. J Biol Chem 1996; 271: 16603-8.  
8. Cambell W, Okada H. An arginin specific carboxypeptydase generated in blood during coagulation or inflammation which is unrelated to carboxypeptydase N or its subunits. Biochem Biophys Res Commune 1989; 162: 933-9.  
9. Hendriks D, Scharpe S, van Sande M, Lommart MP. Characterization of a carboxypeptidase in human serum distinct from carboxypeptidase N. J Clin Chem Biochem 1989; 27: 227-85.
10. Eaton DL, Malloy BE, Tsai SP, Hemzel W, Drayna D. Isolation, molecular cloning and partial characterization of a novel carboxypeptidase B from human plasma. J Biol Chem 1991; 266: 21833-8.
11. Redlits A, Tan AK, Eaton DL, Plow EF. Plasma carboxypeptidases as regulators of the plasminogen system. J Clin Invest 1995; 96: 2534-8.
12. Sakharov DV, Plow EF, Rijken DC. On the mechanism of the antifibrinolytic activity of plasma carboxypeptidase B. J Biol Chem 1997; 272: 14777-8.
13. Wang W, Bottu MB, Bajzar J, et al. A study of the mechanism of inhibition of fibrinolysis by activated thrombin activatable inhibitor. J Biol Chem 1998; 42: 27176-81.
14. Booth NA. TAFI meets the sticky ends. Thromb Haemost 2001; 85: 1-2.
15. Mosinier LO, Meyers JC, Bouma BW. The role of the protein S in the activation of thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) and regulation of fibrinolysis. Thromb Haemost 2001; 86: 1040-6.
16. Uszyński W, Żekanowska E, Szymański W, Uszyński M. Trombinowy inhibitor fibrynolizy (TAFI) we krwi pępowinowej płodu i krwi matki. Gin Pol 2003; 74: 1329-34.
17. Uszyński W, Uszyński M, Żekanowska E, Góralczyk K. Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor. Folia Histochem Cytobiol 2007; 45: 33-6.
18. Strömqvist M, Schatteman K, Leurs J, Verkerk R, Andersson JO, Johansson T, Scharpé S, Hendriks D. Immunological assay for the determination of procarboxypeptidase an antigen in human plasma. Thromb Haemost 2001; 35: 12-7.
19. Juhan-Vague I, Renucci JF, Grimaux M, Morange PE, Gouvernet J, Gourmelin Y, Alessi MC. Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor antigen levels and cardiovascular risk factors. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000; 20: 2156-61.
20. Chetaille P, Alessi MC, Kouassi AD, Morange PE, Juhan-Vaque I. Plasma TAFI antigen variations in healthy subjects. Thromb Haemost 2000; 83: 902-5.
21. Santamaria A, Borell M, Oliver A, et al. Association of functional thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) with conventional cardiovascular risk factors and its correlation with other hemostatic factors in a spanish population. Am J Hematol 2004; 76: 348-52.
22. Reijerkerk A, Meijers JC, Havik SR, Bouma BN, Voest EE, Gebbink MF. Tumor growth and metastasis are not affected in thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor – deficient mice. Thromb Haemost 2004; 2: 769-79.
23. Hataji O, Taguchi O, Gabazza EC, et al. Increased circulating levels of thrombin activatable fibrinolysis inhibitor in lung cancer patients. Am J Hematol 2004; 76: 214-9.
24. Koldas M, Gummus M, Seker M, et al. Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor levels in patients with non small cell lung cancer. Clin Lung Cancer 2008; 9: 112-5.
25. Demirkan B, Özcan MA, Alacacioglu IA, Yüksel F, Ündar B, Alakavuklar M. The effect of Anthracycline-Based (Epirubicin) adjuvant chemotherapy on plasma TAFI and PAI-1 levels in operable breast cancer. Thromb Haemost 2006; 12: 9-14.
26. Watanbe R, Wada H, Watanabe Y, et al. Activity and antigen levels of thrombin activatable fibrinolysis inhibitor in plasma of patients with disseminated intravascular coagulation. Thromb Res 2001; 104: 1-6.
27. Van Duel DH, George M, Fareed J. Low levels of thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor in chronic liver disease. Thromb Haemost 2001; 85: 667-70.
28. Lisman T, Leebeek FW, Mosnier LO, Bouma BN, Meijers JC, Janssen HL, Nieuwenhuis HK, De Groot PG. Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor deficiency in cirrhosis is not associated with increased plasma fibrinolysis. Gastroenterology 2001; 121: 131-9.
29. Meijers JC, Oudijk EJ, Mosnier LO, Bos R, Bouma BN, Nieuwenhuis HK, Fijnheer R. Reduced activity of TAFI thrombin activatable fibrinolysis inhibitor in acute promyelocytic leukaemia. Br J Haematol 2000; 108: 518-23.
30. Henry M, Aubert H, Morange PE, Nanni I, Alessi MC, Tiret L, Juhan-Vague I. Identification of polymorphisms in the promoter and the 3' region of the TAFI gene: evidence that plasma TAFI antigen levels are strongly genetically controlled. Blood 2001; 97: 2053-8.
31. Vairaktaris E, Yapijakis Ch, Nkenke E, et al. The 1040C/T polymorphism influencing thermal stability and activity of thrombin activatable fibrinolysis inhibitor is associated with risk for oral cancer. Am J Hematol 2007; 82: 1010-2.


Adres do korespondencji

prof. dr hab. med. Maria Kotschy
Wojewódzki Szpital Specjalistyczny
Ośrodek Badawczo-Rozwojowy
we Wrocławiu
ul. H. Kamieńskiego 73a
51-124 Wrocław
e-mail: mkotschy@tlen.pl