The role of interferons in pathogenesis of lupus erythematosus

Wprowadzenie
Interferony i ich receptory
Interferony (IFN) stanowią grupę cytokin odkrytych przez Isaacsa i Lindenmanna, odgrywających wiodącą rolę w odporności przeciwwirusowej. Wyróżnia się 5 podstawowych rodzajów interferonów: α, β, κ, ω, γ. Dawniej dzielono je na 2 typy: I i II. Interferony typu I (α, β, κ, ω) wytwarzane są przez traktowane wirusem komórki, tj. leukocyty, keratynocyty lub fibroblasty. Natomiast interferon typu II (γ), zwany immunologicznym, jest wytwarzany głównie przez limfocyty T pod wpływem antygenów, cytokin (IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21) czy mitogenów. Gen dla IFNγ znajduje się na chromosomie 12., zawiera 1 gen kodujący i 3 introny, składa się z 146 aminokwasów bez grup węglowodanowych. Receptory dla interferonów są heterodimerami, składającymi się z 2 różnych podjednostek. W odróżnieniu od IFNα, β, ω, które wiążą się z tym samym receptorem, IFNγ wiąże się z innym, w skład którego wchodzą podjednostki IFNGR-1 i IFNGR-2. Receptor dla IFNγ aktywuje kinazę JAK1 oraz kinazę tyrozynową JAK2. W wyniku aktywacji fosforylują one 2 identyczne białka STAT1, łączące się następnie w czynnik transkrypcyjny. Geny odpowiadające na IFNγ zawierają sekwencją ISRE (interferon stimulated response element), a także sekwencje aktywacji przez IFNγ GAS (gamma activated sequences). Wśród kilkudziesięciu genów, których ekspresję stymulują IFN, są m.in. cząsteczki MHC I i II klasy, receptor dla fragmentu Fc IgG (Fcγ RI), chemokiny IP10, MIG, IRF-1, syntaza tlenku azotu (iNOS), kinaza białkowa R, białko Mx. IFNγ jest znacznie aktywniejszy, jeśli chodzi o działanie na układ odpornościowy. Jest najsilniejszym aktywatorem ekspresji MHC klasy I i II oraz wybitnie nasila prezentację antygenów limfocytom T. Poza tym aktywuje makrofagi, a także w kooperacji z innymi cytokinami uczestniczy w różnicowaniu komórek B w kierunku komórek uwalniających przeciwciała [1].
Interferony w toczniu rumieniowatym
Cytokiny pełnią ważną rolę w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej zarówno przeciw antygenom zewnętrznym, jak i własnym, jak ma to miejsce w chorobach autoimmunizacyjnych. Mediatory te zostały podzielone w zależności od źródła i funkcji efektorowych na 2 grupy. Cytokiny wydzielane przez subpopulację limfocytów Th1 (IL-2 stymulująca cytotoksyczność limfocytów i IFNγ aktywujący makrofagi) mają wybitny udział we wspomaganiu odpowiedzi typu komórkowego, natomiast cytokiny wydzielane przez limfocyty Th2 (IL-4, 5, 10, 13), będące czynnikami wzrostu i różnicowania limfocytów B, wspomagają głównie odpowiedź humoralną. Podobnie ze względu na mechanizmy efektorowe podzielono choroby autoimmunizacyjne na te z dominującą odpowiedzią komórkową, jak np. cukrzyca insulinozależna, oraz takie, gdzie dominuje odpowiedź humoralna z wytwarzaniem patogennych autoprzeciwciał, jak np. toczeń rumieniowaty.
Wiele cytokin wydzielanych zarówno przez limfocyty Th1, jak i Th2 bierze udział w regulowaniu aktywności choroby czy zajęciu poszczególnych organów wewnętrznych w toczniu rumieniowatym (TNFα, TGFβ, IFNa, IFNg, IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-16) [2].
Pierwszą opisywaną cytokiną w toczniu rumieniowatym był IFNα. Kilka badań wykazało podwyższony poziom tej cytokiny w surowicach pacjentów z SLE, jednakże źródło i czynniki stymulujące jej produkcję nie są jeszcze dokładnie poznane. Wzmaga on aktywację makrofagów, a także polaryzuje odpowiedź w kierunku Th1, a zatem produkcję IL-2 i IFNγ. Inne badania wykazały, że również poziom IFNγ w surowicach pacjentów z SLE jest podwyższony, a produkcja tej cytokiny przez komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMCs) koreluje z aktywnością choroby w skali (systemic lupus activity measurement – SLAM). Wiele badań przemawia za tym, że IFNγ jest jedną z ważniejszych molekuł efektorowych w toczniu rumieniowatym [3]. Może on wpływać na poliklonalną aktywację limfocytów B, a także na zjawisko przełączania klas (class switching) z IgG1 spotykanych częściej w SCLE na IgG2 i 3 charakterystyczne dla SLE z zajęciem narządów wewnętrznych. Szczególnym rodzajem badań są badania na modelach zwierzęcych. O wadze IFNγ w patogenezie tocznia jako pierwsze świadczyły doświadczenia Jacoba i wsp. na myszach New Zeland Black NZB x New Zeland White NZWF1 (BxW). Wykazały one indukcję choroby u osobników otrzymujących IFN, podczas gdy u osobników otrzymujących przeciwciała anty-IFNγ początek choroby był znacząco późniejszy. Poszerzeniem tych badań były badania Ozmena i wsp., którzy dodatkowo podawali myszom rozpuszczalny receptor sIFNγR, uzyskując dłuższe przeżycie. Definitywnie przekonujące do roli IFNg w patogenezie tocznia są badania na modelach mysich MRL-Faslpr, w których dokonano delecji genów IFNγ lub jego receptora, w których wykazano redukcję objawów histologicznych, serologicznych oraz znaczne wydłużenie przeżycia.
Opisano również polimorfizm genu dla receptora IFNγ. Okazało się, że kombinacja polimorfizmów IFNR1 (Val14Met) i IFNR2 (Gln64/Gln64) stwarza największe ryzyko rozwinięcia się SLE [4].
Interferon a zmiany skórne
IFN odgrywa także ważną rolę w patologii zmian skórnych w przebiegu tocznia. Około 1/3 pacjentów z SLE manifestuje zmiany skórne o charakterystycznym kształcie motyla i lokalizacji zależnej od ekspozycji na UV. Badaniu poddano wycinki skórne pacjentów z różnymi manifestacjami skórnymi poszczególnych odmian tocznia i wykazano w większości obecność mRNA dla IL 5 i IFNγ. W normalnej skórze również wykazano mRNA dla IFNγ, ale bez obecności funkcjonalnego białka. Na tej podstawie spekuluje się udział w patogenezie zmian skórnych cytokin Th2 wraz z lokalną produkcją IFNγ, które mogą zarówno indukować, jak i nasilać chorobę [5].
Cel pracy
Celem badań było określenie ekspresji genu dla IFNγ oraz jego receptora w PBMCs pacjentów z różnymi odmianami tocznia rumieniowatego oraz poziomu tej cytokiny w surowicy w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych.
Materiał i metody
Grupę badaną stanowili pacjenci Katedry i Kliniki Dermatologii z różnymi odmianami tocznia rumieniowatego (w tym 14 pacjentów z DLE, 7 z SCLE oraz 7 z SLE) oraz 10 osób zdrowych. Materiałem użytym do badań były PBMCs oraz surowice. Na badania uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej przy Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu (6 lutego 2003 r.). Oznaczenia poziomu ekspresji genu dla IFNγ i jego receptora dokonano za pomocą analizy jakościowej metodą RT-PCR przy użyciu LightCyclera, po wyizolowaniu PBMCs z krwi obwodowej metodą wirowania w gradiencie gęstości Ficollu oraz izolacji mRNA metodą fenolowo-chloroformową Chomczyńskiego i Sacchi. Zaprojektowane primery, których użyto, przedstawiono w tab. 1.
Pomiary stężeń IFNγ w surowicach wykonano metodą ELISA (Quantikine R&D Systems, Human IFNγ Immunoassay). Wyniki opracowano statystycznie za pomocą programu CSS Statistica V.
Wyniki
Wyniki badania przedstawiono w tab. 3.–5.
Omówienie wyników
Średnie wartości IFNγ w grupie chorych na SLE wynosiły 2,29 pg/ml, w grupie DLE 22,95 pg/ml, SCLE 72,29 pg/ml i w grupie kontrolnej osób zdrowych 2,00 pg/ml. W literaturze doszukano się różnych doniesień, zarówno tych – opisujących podwyższony poziom IFNγ w surowicy chorych z SLE, który dodatkowo korelował z aktywnością choroby SLAM [6], ale również takich, w których stwierdzano podwyższony poziom bez korelacji [7] czy brak wzrostu poziomu tej cytokiny [8]. Analiza wyników nie wykazała statystycznie istotnych różnic w stężeniu IFNγ w poszczególnych grupach (test Kruskala-Wallisa). W kolejnych pracach opisano wpływ leczenia kortykosteroidami na znaczny spadek stężenia IFNγ w surowicy [9]. Również badani pacjenci z SLE w 100% byli leczeni glikokortykosteroidami doustnymi w dawkach podtrzymujących, 14,29% było leczonych w grupie DLE i 71,43% z SCLE i stwierdzono statystycznie istotny wpływ leczenia na obniżenie poziomu IFNγ, p=0,04. Ekspresję genu dla IFN stwierdzono u wszystkich chorych na SLE, jednakże w niskim i wyrównanym poziomie średnio 3767 kopii. W grupie pacjentów z DLE u 93% dochodziło do ekspresji genu na wysokim poziomie średnio 514 749 kopii, u chorych z SCLE 71% wykazywało ekspresję genu na średnim poziomie 40 163 kopii w porównaniu z grupą kontrolną, gdzie 40% również wykazało ekspresję genu na średnim poziomie 516 kopii. W piśmiennictwie doszukano się pojedynczych prac, sugerujących znaczący wzrost ekspresji tego genu, jednakże nie ustosunkowano się co do ewentualnego wcześniejszego leczenia mogącego wpływać na ten proces [10]. Ciekawe wyniki otrzymano również dla ekspresji receptora IFNγ. W grupie osób zdrowych nie dochodzi do jego ekspresji, podczas gdy 100% chorych z SLE wykazuje ekspresję na poziomie średnio 8 311 kopii. W grupie pacjentów z DLE 64% wykazywało ekspresję na średnim poziomie 8 256 kopii, a u chorych z SCLE odpowiednio 29% i 133 kopii.
Otrzymane wyniki nie są jednoznaczne, podobnie jak doniesienia literaturowe. Badana grupa nie była jednorodna i mało liczebna. Wyniki nie zaprzeczają jednak ważnej roli IFNγ w patogenezie tocznia rumieniowatego nie tylko układowego, a także wskazują na znaczący wpływ leczenia immunosupresyjnego.
Dyskusja
Ponad 40 lat temu interferony były pierwszą odkrytą rodziną cytokin. Po początkowym entuzjazmie, jaki towarzyszył odkryciu, że odgrywają kluczową rolę w procesie autoimmunizacji i możliwości ich zastosowania w leczeniu, nastąpiły lata zapomnienia, aż do chwili obecnej. Po zsekwencjonowaniu genomu człowieka wiadomo, że locus IFN typu I mieści się na chromosomie 9p21 i zawiera 13 izoform IFN-alfa oraz pojedynczy gen IFN-beta. Zidentyfikowano również IFN-omega, kappa i tau. Przy zastosowaniu techniki mikrochip odkryto wiele genów związanych z IFN typu I i II. Przykładowo badania analizy mRNA wykazały, że we wczesnym stadium SLE dochodzi do indukcji IFN-alfa, transkrypcja genów zależnych od
IFN-alfa wzrasta wraz z aktywnością choroby, a maleje pod wpływem leczenia glikokortykosteroidami [11].
Funkcja IFN typu I nie jest jeszcze całkowicie jasna, wydaje się, że działają one za pomocą tego samego receptora, a jego blokada w modelach mysich zabezpiecza przed rozwojem SLE. Istnieje natomiast jeden rodzaj IFN typu II – IFN-gamma wraz z jego unikalnym receptorem. Ten typ również odgrywa znaczącą rolę prozapalną i charakteryzuje prozapalne limfocyty T CD4. Wydaje się, że IFN typu I uwrażliwia limfocyty T na działanie IFN typu II. Analizy mikrochipowe preparatów z krwi czy tkanek od chorych z SLE, czy modeli mysich wykazują, że najbardziej rozregulowane geny to te zależne od stymulacji IFN I czy II typu. Jednakże blokada receptorów może prowadzić do nieoczekiwanych skutków, związanych z utratą fizjologicznych funkcji (obrona przeciwwirusowa, rola w utrzymywaniu ciąży i prawdopodobnie w licznych interakcjach między komórkami) [12].
SLE jest uważany za klasyczny przykład choroby autoimmunologicznej z przewagą odpowiedzi typu 2, gdzie dochodzi do aktywacji komórek B i produkcji autoprzeciwciał. Theofilopoulos postuluje znacznie większą rolę komórek typu 1, a szczególności IFN-gamma. Następujące obserwacje są tego dowodem:
1) zwiększony poziom IFN-gamma i IL-12 na poziomie mRNA i białka stwierdzono na modelach mysich,
2) myszy z nadekspresją IFN-gamma w skórze rozwijają zespół objawów SLE skórnych i obecność anty-dsDNA,
3) poziomy IFN-gamma i IL-12 w surowicy pacjentów z SLE są podwyższone, szczególnie u tych z aktywną chorobą i zajęciem nerek,
4) analiza mikrochipowa wykazuje zwiększoną ekspresję genów regulowanych przez IFN-gamma,
5) podawanie pacjentom z chorobami autoimmunologicznymi lub limfoproliferacyjnymi IFN-gamma prowadziło do rozwinięcia się SLE,
6) podawanie IFN-gamma myszom powodowało zaostrzenia choroby,
7) podawanie antagonistów receptora lub przeciwciał anty-IFN-gamma wydłużało przeżycie,
8) delecja genu IFN-gamma lub jego receptora zapobiegała rozwojowi choroby.

Redukcja 50% ilości produkowanego IFN była wystarczająca dla zapobieżenia rozwojowi SLE u myszy. Skonstruowano cząsteczkę IFN receptora sprzężonego z regionem stałym IgG1, by nadać dłuższy okres półtrwania (ok. 40 godz.). Myszy, u których profilaktycznie podawano niewirusowy wektor o cechach inhibitora IFN-gamma, nie rozwijały choroby. Dobry efekt uzyskano też u zwierząt z już rozwiniętą chorobą. Nie jest jednak możliwe wskazanie dokładnie jednego procesu, na który wpływ ma IFN (Ag prezentacja, ekspresja MHC), a odgrywającego spustową rolę w rozwoju SLE [13–16].
Skróty używane w pracy: IFNg – interferon gamma, IFNgR – receptor interferonu gamma, PBMCs – komórki jednojądrzaste krwi obwodowej, DLE – postać ogniskowa tocznia rumieniowatego, SCLE – postać podostra skórna tocznia rumieniowatego, SLE – układowy toczeń rumieniowaty.
Piśmiennictwo
1. Gołąb J, Jakóbisiak M, Zagożdżon R i wsp.: Cytokiny. W: Immunologia. Gołąb J, Jakóbisiak M, Lasek W (eds). Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2002: 198-248.
2. Thelofilopoulos AN, Koundouris S, Kono DH, et al.: The role of IFN-g in systemic lupus erythematosus: a challenge to the Th1/Th2 paradigm in autoimmunity. Arthritis Res 2001; 3: 136-41.
3. Dean GS, Tyrrell-Price J, Crawley E, et al.: Cytokines and systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis 2000; 59: 243-51.
4. Nakashima H, Inoue H, Akahoshi M, et al.: The combination of polymorphisms within interferon-g receptor 1 and receptor 2 associated with tha risk of systemic lupus erythematosus. FEBS Letters 1999; 453: 187-90.
5. Stein LF, Saed GM, Fiveston DP: T-cell cytokine network in cutaneous lupus erythematosus. J Am Acad Dermatol 1997; 36: 191-6.
6. Robak E, Smolewski P, Woźniacka A, et al.: Relationship between peripheral blood dendritic cells and cytokines involved in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus. Eur Cytokine Netw 2004; 15: 222-30.
7. Kim T, Kanayama Y, Negoro N, et al.: Serum levels of interferons in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol 1987; 70: 562-9.
8. Lacki JK, Leszczyński P, Kelemen J, et al.: Cytokine concentration in serum of lupus erythematosus patients: the effect on acute phase response. J Med 1997; 28: 99-107.
9. Xie HF, Li J, Shi W: Effect of corticosteroids on the balance of Th cytokines in patients with systemic lupus erythematosus. Human Yi Ke Da Xue Xue Bao, 2002; 28; 27: 533-5.
10. Csiszar A, Nagy G, Gergely P, et al.: Increased interferon-gamma, IL-10 and decreased IL-4 mRNA expression in PBMC from patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol 2000; 122: 464-70.
11. Kirou KA, Lee CY, George SS, et al.: Interferon-induced target gene expression in SLE represents predominant effects of rather than gamma interferon. SLE-Human Etiology and Pathogenesis: Dendritic cells and Antigen. Program and abstracts of the American College of Reumatology 67th Annual Scientific Meeting; October 23-28, 2003; Orlando, Florida. Abstracts S557.
12. Horowitz DA, Wang H, Gray JD. Cytokine gene profile in circulating blood mononuclear calls from patients with systemic lupus erythematosus: increased interleukin-2 but not interleukin-4 mRNA. Lupus 1994; 3: 423-8.
13. Theofilopoulos A. Targeting interferon in SLE. Program and abstracts of the 90th Meeting of the American Association o Immunologists; May 6-10, 2003; Denver, Colorado.
14. Theofiopoulos AN, Kondouris S, Kono DH, et al.: The role of IFN gamma in SLE: a challenge to the Th1/Th2 paradigm in autoimmunity. Arthritis Res 2001; 3: 136-41.
15. Santiago-Raber ML, Baccala R, Haraldson KM, et al.: Type-1 interferon receptor deficiency reduces lupus-like disease in NZB mice. J Exp Med 2003; 197: 177-78.
16. Baechler EC, Batliwalla FM, Karypis G, et al.: Intereron inducible geneexpression signature in peripheral blood cells of patients with severe lupus. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100: 2610-5.