Vascular endothelial growth factor C as a predictive factor in cervical cancer?

Wstęp
Rak szyjki macicy jest jednym z najczęściej występujących nowotworów u kobiet [1]. Do czynników prognostycznych należą: stopień zaawansowania nowotworu, stan węzłów chłonnych, stopień zróżnicowania nowotworu, wiek pacjentki, inwazja naczyń limfatycznych i/lub naczyń krwionośnych oraz stężenie hemoglobiny przed rozpoczęciem leczenia [2–8]. Dotąd niewiele wiadomo o wartości prognostycznej i/lub predykcyjnej procesów angiogenezy i limfoangiogenezy w raku szyjki macicy.
Angiogeneza to proces tworzenia naczyń na bazie już istniejących, jest ona niezbędna do wzrostu guza, postępu choroby i powstawania przerzutów [9–11]. Odgrywa ważną rolę w wielu zjawiskach zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych i przebiega wieloetapowo [12, 13]. Naczyniowo- -śródbłonkowy czynnik wzrostu (vascular endothelial growth factor – VEGF) bierze udział we wzroście przepuszczalności naczyń, obrzęku, poza- naczyniowym depozycie fibryny, w powstawaniu malformacji naczyniowych, angiogenezie, arteriogenezie, fibrogenezie i limfoangiogenezie [7, 11, 14–16]. Jedną z jego izoform jest VEGF-C, które zostało po raz pierwszy opisane w 1996 r., wzrost ekspresji VEGF-C obserwuje się w chorobach hematologicznych oraz w chorobach nowotworowych. Poprzez różne receptory może pobudzać zarówno procesy angiogenezy, jak i limfoangiogenezy [8, 17, 18].
Celem tego prospektywnego badania była ocena: stężenia VEGF-C w surowicy kobiet chorych na raka szyjki macicy i ocena korelacji z czynnikami kliniczno-patologicznymi.

Materiał i metody



Materiał


Materiał do badania stanowiła krew żylna pobrana od 27 kobiet z rakiem płaskonabłonkowym szyjki macicy w stopniu zaawansowania choroby I–IV wg FIGO (tab. 1.), z medianą wieku: 54,4 roku (35–81 lat). Badanie przeprowadzono pomiędzy grudniem 2005 r. a czerwcem 2007 r. w Katedrze i Klinice Onkologii i Brachyterapii Collegium Medicum w Bydgoszczy, UMK w Toruniu.
Pacjentki były leczone wg przyjętych standardów postępowania i w większości przypadków było to leczenie skojarzone. U wszystkich 27 chorych zastosowano brachyterapię neoadiuwantową, z czego 12 osób otrzymało brachyterapię LDR (low dose rate) w dawce 45 Gy w 2 frakcjach, pozostałe pacjentki brachyterapię HDR (high dose rate) w dawce 30 Gy w 4 frakcjach. W 5. tyg. od zakończenia brachyterapii u 12 kobiet przeprowadzono leczenie operacyjne. U 10 przeprowadzono brachyterapię w połączeniu z napromienianiem wiązką zewnętrzną w dawce 44–50,4 Gy. U 5 osób ze względu na choroby współistniejące zastosowano brachyterapię HDR jako leczenie samodzielne w dawce 45 Gy w 6 frakcjach. Leczenia uzupełniającego wymagało 13 chorych.

Metody


Przed rozpoczęciem leczenia od każdej chorej pobierano 2 ml krwi i po odwirowaniu uzyskaną surowicę przechowywano w temperaturze –70°C do czasu wykonania oznaczeń. Wizyty kontrolne odbywały się w 6. i 12. tyg. od zakończenia radioterapii, a następnie w odstępach 3-miesięcznych. Obserwacja chorych trwała minimum 12 miesięcy. Na wizyty kontrolne nie zgłosiło się 5 chorych, dalszy przebieg choroby u nich jest nieznany.
Do oznaczania VEGF-C zastosowano metodę immunoenzymatyczną ELISA z wykorzystaniem ludzkiego przeciwciała VEGF-C ELISA firmy Bender MedSystem, enzymu znakowanego immunosorbentem badającym aktywność ludzkiego VEGF-C w płynach ustrojowych.

Analiza statystyczna


Analizę statystyczną wykonano za pomocą programu komputerowego Statistica 6.0 (StatSoft, Inc. 2001). Stosując analizę statystyczną, poszukiwano korelacji pomiędzy różnymi zmiennymi a stężeniem VEGF-C w surowicy z wykorzystaniem analizy regresji liniowej. Korelacje pomiędzy zmiennymi ciągłymi badano z wykorzystaniem korelacji liniowej Pearsona. We wszystkich analizach statystycznych za wartość graniczną dla współczynnika prawdopodobieństwa przyjęto p < 0,05.

Wyniki
U każdej z pacjentek wykonano 2 oznaczenia VEGF-C w surowicy, uzyskując dla całej grupy średnią: 90,83 pg/ml w pierwszym oznaczeniu i 88,05 pg/ml w drugim, mediana wyniosła 72,65 pg/ml i 66,87 pg/ml w pierwszym i drugim oznaczeniu. Minimalne stężenie VEGF-C w surowicy wyniosło 37,00 pg/ml, największe stężenie VEGF-C 413,43 pg/ml, dane dla poszczególnych pacjentek przedstawiono w tabeli 2. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej, oceniając korelację pomiędzy stężeniem VEGF-C w surowicy a wiekiem pacjentek, stopniem zaawansowania choroby wg FIGO, stopniem zróżnicowania nowotworu G, stężeniem hemoglobiny we krwi oraz liczbą płytek krwi.
Porównując wyniki stężenia VEGF-C w surowicy ze stopniem zaawansowania choroby wg FIGO (ryc. 1.), nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic pomiędzy pacjentkami z ograniczoną chorobą w porównaniu z kobietami z zaawansowaną chorobą (p = 0,058).
Nie wykazano, aby wiek pacjentek chorych na raka szyjki macicy wpływał statystycznie znamiennie na stężenie VEGF-C w surowicy (p < 0,524) (ryc. 2.). Podobne wyniki uzyskano w korelacji pomiędzy stężeniem VEGF-C w surowicy a stopniem zróżnicowania nowotworu (p < 0,233) (ryc. 3.).
Niedotlenienie jest najsilniejszym czynnikiem indukującym procesy angiogenezy, dlatego poszukiwano zależności pomiędzy VEGF-C w surowicy a stężeniem hemoglobiny. Źródłem VEGF-C są komórki nowotworowe oraz płytki krwi. Dlatego w kolejnym etapie badania porównano stężenie VEGF-C w surowicy z parametrami laboratoryjnymi, takimi jak stężenie hemoglobiny i liczba płytek krwi, nie wykazano istotnych statystycznie różnic pomiędzy analizowanymi parametrami (p < 0,925), (p < 0,221) (ryc. 4., 5.).

Dyskusja
W etiopatogenezie nowotworów istotną rolę przypisuje się procesom angiogenezy oraz limfoangiogenezy, najczęściej do ich oznaczeń wykorzystuje się metodę ELISA, która umożliwia oznaczanie VEGF, w tym VEGF-C w surowicy, osoczu, pełnej krwi i w innych płynach ustrojowych. Sekrecja czynników z rodziny VEGF zmienia się w zależności od typu histopatologicznego nowotworu oraz jego lokalizacji [19, 20].
Problemy w interpretacji wyników wiążą się z tym, że stężenie VEGF-C stanowi równowagę w osoczu pomiędzy wolną frakcją VEGF-C a frakcją związaną z płytkami krwi, a proces ich aktywacji jest częsty zarówno w przypadku choroby nowotworowej, jak i w innych chorobach układowych. Prowadzi to do zwiększenia stężenia VEGF, w tym VEGF-C w osoczu, niezależnie od produkcji w komórkach guza [4, 12, 17, 21–23].
Analiza piśmiennictwa wykazuje duże rozbieżności w uzyskiwanych wynikach. Badanie Lebrechta i innych autorów wskazują, że stężenie VEGF-C oraz innych czynników proangiogennych jest tym wyższe, im wyższy stopień zaawansowania choroby [19, 21, 23].
Mathur i wsp. [21] badali stężenie VEGF-C u chorych z dysplazją szyjki i rakiem szyjki macicy. Stwierdzono zwiększanie się stężenia VEGF-C w surowicy wraz ze stopniem dysplazji CIN I, II, III, a w raku szyjki macicy był to wynik znamiennie wyższy niż u kobiet z dysplazją szyjki macicy. Największe zaś stężenie VEGF-C występowało w chorobie zaawansowanej miejscowo oraz u chorych z przerzutami odległymi.
Istnieją też prace, które nie potwierdzają takiej zależności [7, 20, 24–27].
W pracy Duffa i wsp. [20] analizowano stężenie VEGF-C u wolontariuszy oraz w grupie chorych na raka jelita grubego. Uzyskane wyniki znacznie różniły się od spodziewanych, autorzy wykazali największe stężenie VEGF-C u wolontariuszy, a uzyskane wyniki były istotne statystycznie.
Dane z piśmiennictwa dotyczące stopnia zróżnicowania nowotworu G, tak jak w przypadku innych parametrów kliniczno-patologicznych, są rozbieżne i nadal nie jest znana tego przyczyna. Przypuszcza się, że na uzyskiwane wyniki ma wpływ heterogenność komórek nowotworowych [26–31].
W dalszej części badania własnego porównano stężenie VEGF-C w surowicy, uwzględniając wiek pacjentów. Nie wykazano istotnych statystycznie różnic pomiędzy analizowanymi parametrami. Rezultaty są zbliżone do uzyskanych w większości prac innych autorów [4, 12, 24, 25, 27–30].
W niewielu badaniach ocenia się zależność pomiędzy stężeniem hemoglobiny a czynnikami proangiogennymi i limfoangiogennymi, co utrudnia wyciągnięcie odpowiednich wniosków. Dziwi fakt, że nie obserwuje się takich korelacji, bo małe stężenie hemoglobiny wpływa na wzrost hipoksji w guzie, która – jak wiadomo – jest najsilniejszym promotorem procesów angiogenezy i to za jej sprawą obserwuje się zwiększenie ilości VEGF wytwarzanego przez komórki guza [32].
Podobnie jak w innych pracach, w badaniu własnym autorów niniejszego opracowania nie wykazano zależności pomiędzy stężeniem VEGF-C a liczbą płytek krwi.
Źródłem VEGF jest nie tylko sam guz, ale też płytki krwi, co sprawia, że nawet u osób zdrowych obserwuje się duże stężenia VEGF, w tym VEGF-C. Tak więc stężenie czynników proangiogennych jest nie tylko związane z wielkością guza, ale też z nadpłytkowością [33, 34]. Dlatego też oczekuje się korelacji pomiędzy VEGF a liczbą płytek krwi [4, 22, 35, 36]. Do prac, w których udało się wykazać taką zależność, należy badanie Krzystek-Korpackiej i wsp. [25] dotyczące pacjentów z nowotworami głowy i szyi, w którym stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy stężeniem VEGF-C w surowicy a liczbą płytek krwi (p < 0,01).
W pracy przedstawiono wyniki badania własnego, przeprowadzonego na grupie 27 kobiet chorych na raka szyjki macicy. Być może na brak korelacji pomiędzy stężeniem VEGF-C w surowicy a analizowanymi parametrami wpływ miała liczebność grupy, jednak w pracach innych autorów, z udziałem większych grup pacjentów, również nie udało się wykazać zależności pomiędzy czynnikami proangiogennymi i limfoangiogennymi a parametrami kliniczno-patologicznymi [4, 5, 20, 26, 27]. Wskazuje to, że procesy angiogenezy oraz limfoangiogenezy są złożone i nie do końca poznane.
Podsumowując, w badaniu własnym autorzy niniejszej pracy nie odnaleźli istotnej zależności pomiędzy stężeniem VEGF-C a klinicznymi cechami chorych na raka szyjki macicy. Być może przeprowadzenie dalszych badań z udziałem większych grup chorych pozwoli na pełniejsze zrozumienie mechanizmów angiogenezy i limfoangiogenezy.


Piśmiennictwo  
1. Didkowska J. Nowotwory szyjki macicy w Polsce – epidemiologiczny bilans otwarcia i perspektywy. Ginekol Pol 2006; 8: 660-6.  
2. Mitsuhashi A, Suzuka K, Yamazawa K, Matsui H, Seki K, Sekiya S. Serum vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF-C levels as tumor markers in patients with cervical carcinoma. Cancer 2005; 103: 724-30.  
3. Ochi T, Murase K, Fujii T, Kawamura M, Ikezoe J. Survival prediction using artificial neural networks in patients with uterine cervical cancer treated by radiation therapy alone. Int J Clin Oncol 2002; 7: 294-300.  
4. Choi J, Kim H, Lim H, et al. Vascular endothelial growth factor in the serum of patients with non-small cell lung cancer: correlation with platelet and leukocyte counts. Lung Cancer 2001; 33: 171-9.  
5. Lambin P, Kramar A, Haie-Meder C, Castaigne D, Scalliet P, Bouzy J, Malaise EP, Gerbaulet A. Tumour size in cancer of the cervix. Acta Oncol 1998; 37: 729-34.  
6. Nagy J, Dvorak A, Dvorak H. VEGF164/165 – and PIGF roles in angiogenesis and arteriogenesis. Trends Cardiovasc Med 2003; 13: 164-75.  
7. Ferrara N. Molecular and biological properties of vascular endothelial growth factor. J Mol Med 1999; 77: 527-43.  
8. Veikkola T, Alitalo K. VEGFs, receptors and angiogenesis. Semin Cancer Biol 1999; 9: 211-20.  
9. Gasparini G. Clinical significance of determination of surrogate markers of angiogenesis in breast cancer. Crit Rev Oncol Hematol 2001; 37: 97-114.
10. Conway E., Collen D., Carmeliet P. Molecular mechanism of blood vessel growth. Cardiovasc Res 2001; 49: 507-21.
11. Drake C, La Rue A, Ferrara N. VEGF regulates cell behavior during vasculogenesis. Dev Biol 2000; 224: 178-188.
12. Vermeulen P, Gasparini G, Fox S, et al. Second international consensus on the methodology and criteria of evaluation of angiogenesis quantification in solid human tumors. Eur J Cancer 2002; 38: 1564-79.
13. Nor J, Polverini J. Role of endothelial cell survival and death signals in angiogenesis. Angiogenesis 1999; 3: 101-16.
14. Weich H, Bando H, Brokelmann M, et al. Quantification of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) by a novel ELISA. J Immunol Methods 2004; 285: 145-55.
15. Watanabe Y, Dvorak H. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor inhibits anchorage- disruption-induced apoptosis in microvessel endothelial cells by inducing scaffold formation. Exp Cell Res 1997; 233: 340-9.
16. Tempfer C, Obermair A, Hefler L, Haeusler G, Gitsch G, Kainz C. Vascular enothelial growth factor serum concentration in ovarian cancer. Obstet Gynecol 1998; 92: 360-3.
17. Vermeulen P, Gasparini G, Fox S, et al. Quantification of angiogenesis solid human tumours an: international consensus on the methodology and criteria of evaluation. Eur J Cancer 1996; 14: 2474-84.
18. Tille J, Wang X, Lipson K, et al. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) receptor-2 signaling mediates VEGF-CDnDc- and VEGF-A – induced angiogenesis in vitro. Exp Cell Res 2003; 285: 286-98.
19. Lebrecht A, Ludwig E, Huber A, Klein M, Schneeberger C, Tempfer C. Serum vascular endothelial growth factor and serum leptin in patients with cervical cancer. Gynecol Oncol 2002; 85: 32-5.
20. Duff S, Saundersy M, McCrediey V, Kumarz S, O’Dwyer S, Jaysonx G. Pre-operative Plasma Levels of Vascular Endothelial Growth Factor A, C and D in Patients with Colorectal Cancer. Clin Oncol 2005; 17: 367-71.
21. Mathur S, Mathur R, Elizabeth A, Gray E, Lane D, Underwood P, Kohler M, Creasman W. Serum vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) as a specific biomarker for advanced cervical cancer: Relationship to insulin-like growth factor II (IGF-II), IGF binding protein 3 (IGF-BP3) and VEGF-B. Gynecol Oncol 2005; 98: 467-83.
22. Wynendaele W, Derua R, Hoylaerts M, et al. Vascular endothelial growth factor measured in platelet poor plasma allows optimal separation between cancer patients and volunteers: A key to study an angiogenic marker in vivo? Ann Oncol 1999; 10: 965-71.
23. Bachtiary B, Selzer E, Knocke T, Pooter R, Obermair A. Serum VEGF levels in patients undergoing primary radiotherapy for cervical cancer: impact on progression-free survival. Cancer Lett 2002; 179: 197-203.
24. Gisterek I, Sedlaczek P, Kornafel J, et al. Serum vascular endothelial growth factor in patients with pharyngeal and laryngeal squamous cell carcinoma treated with radiotherapy. Am J Otolaryng 2007; 28: 73-7.
25. Krzystek-Korpacka M, Matusiewicz M, Diakowska D, et al. Up-regulation of VEGF-C secreted by cancer cells and not VEGF-A correlates with clinical evaluation of lymph node metastasis in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC). Cancer Lett 2007; 249: 171-7.
26. Broll R, Erdmann H, Duchrow M, et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) a valuable serum tumour marker in patients with colorectal cancer. Eur J Sur Oncol 2001; 27: 34-42.
27. Kaya A, Ciledaga A, Gubaya B, et al. The prognostic significance of vascular endothelial growth factor levels in sera of non-small cell lung cancer patients. Respir Med 2004; 98: 632-6.
28. Gao P, Zhoa G, Yin G, et al. Lymphatic vessel density as a prognostic indicator for patients with stage I cervical carcinoma. Hum Pathol 2006; 37: 719-25.
29. Obermair A, Tempfer C, Wasicky R, Kaider A, Hefler L, Kainz C. Prognostic significance of tumour angiogenesis in endometrial cancer. Obstet Gynecol 1999; 93: 367-71.
30. Gao Y., Zhong W, Mu D, et al. Distributions of Angiogenesis and Lymphangiogenesis in Gastrointestinal Intramucosal Tumors. Ann Surg Oncol 2008; 15: 1117-23.
31. Tjalma W, Weyler J, Weyn B. The association between vascular endothelial growth factor, microvessel density and clinicopathological features in invasive cervical cancer. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2000; 92: 251-7.
32. Dunst J, Becker A, Lautenschläger C, et al. Anemia and Elevated Systemic Levels of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). Strahlenther Onkol 2002; 178: 436-41.
33. Cox G, Walker R, Andi A, Steward W, O’ Byrne K. Prognostic significance of platelet and microvessel counts in operable non-small cell lung cancer. Lung Cancer 2000; 29: 169-77.
34. Kato Y, Kaneko M, Kuno A. Inhibition of tumor cell-induced platelet aggregation using a novel anti-podoplanin antibody reacting with its platelet-aggregation-stimulating domain. Biochem Biophys Res Commun 2006; 349: 1301-7.
35. Salgado R, Benoy I, Bogers J, et al. Platelets and vascular endothelial growth factor (VEGF): A morphological and functional study. Angiogenesis 2001; 4: 37-43.
36. Banks R, Forbes M, Kinsey S. Release of the angiogenic cytokine vascular endothelial growth factor (VEGF) from plateles: significance for VEGF measurements and cancer biology. Br J Cancer 1998; 77: 956-64.