Diagnostic value of the cytogenetic analysis - diffuse large B cell lymphoma case with atypical localization

WSTĘP


Chłoniak rozlany z dużych komórek B (DLBCL - Diffuse Large B-Cell Lymphoma) jest jednym z częściej występujących chłoniaków nieziarniczych (NHL - Non-Hodgkin's Lymphoma). Stanowi 25-30 proc. chłoniaków, występując w postaci węzłowej lub w lokalizacji pozawęzłowej z zajęciem, np. skóry, żołądka czy jąder. Większość przypadków DLBCL wykazuje w swoich komórkach obecność nielosowych aberracji kariotypu [1]. Zmianami pierwotnymi są najczęściej translokacje, np. t(14;18) (q32;q21) z rearanżacją genu BCL-2 (zmiana spotykana w wielu subtypach NHL) lub wariantowe translokacje obejmujące region genu BCL-6 na chromosomie 3 - t(3;V)(q27;V) [2,3]. Zmiany wtórne obejmują na ogół chromosomy 3, 5, 7, 11, 12, 18 i X.

Zarodkowe guzy jąder (TGCT - Testicular Germ Cell Tumor) charakteryzują się pod względem cytogenetycznym obecnością specyficznej aberracji kariotypowej - izochromosomu krótkiego ramienia chromosomu 12 - i(12p) [4,5]. Występuje on w 80 proc. TGCT, niezależnie od ich typu histologicznego. W przypadkach nie wykazujących obecności i(12p) występują aberracje substytutywne, prowadzące do amplifikacji materiału pochodzącego z krótkiego ramienia chromosomu 12 w innych markerach chromosomowych [6, 7]. Tak więc obecność aberracji w regionie 12p jest wysoce specyficzna dla wszystkich TGCT i może stanowić marker diagnostyczny.



MATERIAŁ I METODY


Opis przypadku


39-letni chory zgłosił się do kliniki urologii, zaniepokojony powiększeniem się lewego jądra. W wywiadzie podawał uraz okolicy krocza przed 5. tygodniami. Jądra zstąpiły o czasie, nie występował kontakt z substancjami chemicznymi. Badanie przedmiotowe wykazało nieco powiększone jądro lewe, z wyczuwalnymi zgrubieniami, guzkami, twarde. Innych odchyleń w badaniu fizykalnym nie stwierdzono. W badaniach uzupełniających stwierdzono:
w USG jamy brzusznej - podwyższona echogeniczność miąższu wątroby; w prawej pachwinie pojedyncze węzły chłonne, największy o wymiarach 10 x 6 mm; jądro lewe o wymiarach 65 x 25 mm, najądrze 12 x 5 mm; miąższ jądra lewego niejednorodny, uwidoczniono obszary nieregularne, o nierównych obrysach, hipoechogeniczne; w dolnym biegunie jądra lewego zlokalizowana zmiana ogniskowa, hipoechogeniczna o wymiarach ok. 15 x 10 mm; bez odchyleń w pozostałych narządach jamy brzusznej;

- RTG klatki piersiowej - bez odchyleń od normy;

- tomografia komputerowa jamy brzusznej nie wykazała odchyleń od normy poza cechami stłuszczenia wątroby;

- badania morfologii i biochemii krwi pozostawały bez odchyleń od normy (LDH 323 U/l, ASPAT 51 u/l, ALAT 37 u/l, INR 0,9). Markery nowotworowe przed operacją: AFP 4,4; HCG 0,9.


Wykonano orchidectomię pachwinową lewostronną. Po zagojeniu się rany, w stanie ogólnym dobrym pacjent został wypisany do domu. W badaniu histopatologicznym jądra stwierdzono: guz w największym wymiarze 3 cm bez cech martwicy. Utkanie nowotworowe charakteryzowało się wysoką aktywnością proliferacyjną. Naciek nowotworowy zajmował osłonkę białawą jądra bez jej przekraczania. Widoczna była inwazja nowotworowa naczyń. Cech ITGCN (Intra Tubular Germ Cell Neoplasia) nie znaleziono. Sieć jądra, najądrze, powrózek nasienny w tym w linii cięcia chirurgicznego wolne od nacieku nowotworowego. Wobec powyższego wstępnie rozpoznano nasieniaka lewego jądra (seminoma testis sinistri) (pT2).



Badanie cytogenetyczne


Fragmenty guza pobrane w trakcie orchidectomii zostały poddane równoczesnemu badaniu histopatologicznemu i cytogenetycznemu. Preparaty cytogenetyczne wykonane po krótkotrwałej hodowli in vitro komórek nowotworu, zostały zabarwione różnicowo dla uzyskania prążków G w chromosomach metafazowych [8], a następnie poddane analizie metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) [9], z zastosowaniem sond malujących całe chromosomy: 1, 6, 12, 18, X oraz sondy malującej krótkie ramię chromosomu 12.



Badanie histopatologiczne


W badaniu histopatologicznym zastosowano rutynowe metody barwienia hematoksylina-eozyna i oceny komórek.

W trakcie powtórnej oceny histopatologicznej wykorzystano barwienie immunohistochemiczne z użyciem przeciwciał monoklonalnych dla CD3, CD19 oraz PLAP, a także barwienie histochemiczne na obecność glikogenu.



WYNIKI


Wstępna diagnoza histopatologiczna wykonana bezpośrednio po orchidectomii wskazywała na nasieniaka (seminoma). Równolegle przeprowadzona analiza cytogenetyczna wykazała obecność hipotetraploidalnego kariotypu (ryc. 1.), w którym stwierdzono liczne, niezidentyfikowane markery oraz brak typowego dla zarodkowych guzów jąder izochromosomu i (12p). Badanie techniką fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z użyciem specyficznych sond DNA potwierdziło brak markera i(12p) oraz wykluczyło obecność innych translokacji obejmujących obszar krótkiego ramienia chromosomu 12 (ryc. 2.).

Dalsza analiza FISH pozwoliła określić pochodzenie niezidentyfikowanych markerów chromosomowych. W żadnym z nich nie stwierdzono zaangażowania materiału pochodzącego z chromosomu 12. Dwa markery były rezultatem translokacji chromosomów 1 i X, kolejny powstał w wyniku delecji dużego fragmentu długiego ramienia chromosomu 6. Użycie sondy malującej cały chromosom 18 wykazało wysoki stopień multiplikacji materiału pochodzącego z tego chromosomu (do 15 kopii na komórkę) (ryc. 3.). Obok -10 prawidłowych kopii chromosomu 18 stwierdzono, że 3 z niezidentyfikowanych markerów zawierały materiał pochodzący z chromosomu 18. Aberracje dotyczące tego chromosomu rzadko występują w przypadkach zarodkowych guzów jąder, są natomiast charakterystyczne dla chłoniaków nieziarniczych.



Wynik badania cytogenetycznego poddawał w wątpliwość pierwotną diagnozę. Dodatkowe badanie immunohistochemiczne z użyciem przeciwciał monoklonalnych CD3 i CD19 oraz PLAP, a także badanie histochemiczne na obecność glikogenu pozwoliło na ustalenie ostatecznej diagnozy jako chłoniak rozlany z dużych komórek B, wykluczając jednocześnie pierwotne rozpoznanie nasieniaka.



DYSKUSJA


Badanie cytogenetyczne pozwala na określenie odstępstw od prawidłowego kariotypu w komórkach badanego nowotworu. Wiele chłoniaków, jak i guzów litych, wykazuje obecność aberracji kariotypowych, specyficznie związanych z określonym typem nowotworu, co ma istotne znaczenie diagnostyczne [1]. Obecność markerów chromosomowych, specyficznych dla określonych typów histologicznych nowotworów może stanowić podstawę weryfikacji diagnozy histopatologicznej, szczególnie w przypadkach wątpliwych bądź o cechach nietypowych. W chłoniakach nieziarniczych niejednorodność kliniczna współwystępująca z różnorodnością obrazu histologicznego bywa niekiedy przyczyną trudności klasyfikacji. Charakteryzują się one dość często lokalizacją w miejscach nietypowych: w skórze, tarczycy, sutku, przewodzie pokarmowym, jajnikach lub jądrach. Do rozpoznania większości przypadków wystarczają konwencjonalne techniki histopatologiczne, niekiedy jednak należy rozważyć wykonanie szczegółowych badań uzupełniających, w tym cytogenetycznych [10]. Według obecnych zaleceń WHO diagnostyka NHL powinna być oparta na analizie danych morfologicznych, immunofenotypowania, badań cytogenetycznych i molekularnych w kontekście obrazu klinicznego [11].



Przedstawiony przypadek chłoniaka DLBCL stanowi przykład przydatności analizy cytogenetycznej jako badania uzupełniającego w diagnostyce onkologicznej. Specyficznym dla guzów jąder markerem jest isochromosom i(12p). W opisywanym przypadku brak i(12p) bądź substytutywnych zmian krótkiego ramienia chromosomu 12, były istotną wskazówką dla podjęcia weryfikacji pierwotnej oceny wskazującej na nasieniaka jądra. Wynik dodatkowych badań histochemicznych oraz immunohistochemicznych był podstawą do ustalenia diagnozy chłoniaka rozlanego z dużych komórek B. Obraz zmian cytogenetycznych, w tym amplifikacja materiału podchodzącego z chromosomu 18, jest zgodny z tak ustalonym rozpoznaniem.



PIŚMIENNICTWO

1. Heim S, Mitelman F. Cancer Cytogenetic. Secound ed. 1995, Wiley-Liss, Inc. 287-92.
2. Offitt K, Lo Coco F, Louie DC, et al. Rearrangement of BCL-6 gene as a prognostic marker in diffuse large-cell lymphoma. New Engl J Med 1994; 331: 74-80.
3. Chaganti SR, Chen W, Parsa NZ, et al. Involvement of BCL6in chromosomal aberrations affecting band 3q26 in B-cell non-Hodgkin's lymphoma. Genes Chromosom Cancer 1998; 23: 323-27.
4. Bosl GJ, Dmitrovsky E, Reuter VE, Samaniego F, at al. Isochromosome of the short arm of chromosome 12: clinically useful marker for maale germ cell tumors. J Natl Cancer Inst. 1989 Dec 20; 81 (24): 1874-8.
5. Rodriguez E, Mathew S, Router V, et al. Cytogenetic analysis of 124 prospectively ascertained male germ cell tumors. Cancer Res 1992; 52: 2285-91.
6. Suijkerbuijk RF, Sinke RJ, Weghuis D, et al. Amplification of chromosome subregion 12p11.2-p12,1 in metastasia of an i(12p)-negative seminoma: relationship to tumor progression? Cancer Genet Cytogenet 1994; 78: 145-52.
7. Mostert MC, Verkerk AJHM. Identification of the critical region of 12p over-representation in TGCT of adolescent and adults. Oncogene 1998, 16: 2617-27.
8. ISCN An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. Mitelman F (ed.) 1995.
9. Pinkel D, Straume T, Gray JW, et al. Cytogenetic analysis using quantative, high-sensitivity fluorescence hybridization. Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 2934-8.
10. Pieńkowska-Grela B. Badania cytogenetyczne w diagnostyce chłoniaków B-komórkowych. Postępy Biologii Komórki 2002; 49: 1-13.
11. Harris NL, Jaffe ES, Diebold J, et al. World Health Organization Classification of Neaplastic Diseasese of the Hematopoetic and Lymphoid Tissues: Report of the Clinical Advisory Committee Meeting. J Clin Oncol 1999; 84: 1361-92.



ADRES DO KORESPONDENCJI

mgr Beata Grygalewicz

Samodzielna Pracownia Cytogenetyki

Centrum Onkologii

– Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie

ul. W.K. Roentgena 5

02-781 Warszawa

tel. (022) 644 50 24 w. 2649

fax (022) 644 90 85

e-mail: bgryal@coi.waw.pl