Wartość prognostyczna marginesu operacyjnego w nowotworach głowy i szyi

Wprowadzenie
W przypadku nowotworów złośliwych w obrębie głowy i szyi głównymi czynnikami mającymi wpływ na prognozę są możliwość radykalnego chirurgicznego usunięcia zmiany oraz brak lub obecność przerzutów do okolicznych węzłów chłonnych. W pierwszym przypadku o radykalności mówi się, jeśli zachowano margines niezmienionej histologicznie błony śluzowej. Wielkość tego marginesu podlega różnym wpływom (np. topografia zmiany i jej rozległość, zajęcie tkanek bardzo istotnych dla funkcji życiowych chorego, współistnienie zmian przednowotworowych o innym umiejscowieniu) i jest – obok zmian w układzie chłonnym – ważnym parametrem determinującym podejście do radioterapii następowej. Należy wspomnieć również, że istnieją różnice prognostyczne związane z pierwotnym umiejscowieniem zmiany. Wiadomo, że guzy T1 krtani rokują lepiej niż raki dna jamy ustnej i gardła. Obok rutynowego badania barwienia hematoksyliną i eozyną (HE), na podstawie którego można ocenić obrzeże zmiany, tzw. czysty margines, bardzo przydatne są badania ultrastrukturalne pod mikroskopem elektronowym, pozwalające na ocenę frontu naciekania nowotworowego, rodzaju komórek, ich dojrzałości i indeksu mitotycznego. Na podstawie piśmiennictwa wydaje się, że ocena ta może być niewystarczająca jako główne kryterium diagnostyczne i prognostyczne. Jest to o tyle istotne, że dla niektórych lokalizacji nowotworu przeżywalność 5-letnia nie przekracza 27% [1, 2]. Z tego powodu ciągle poszukuje się nowych metod diagnostycznych.
Ostatnio w piśmiennictwie pojawia się coraz więcej prac dotyczących wpływu zmian w obrębie marginesu tkanki nowotworowej na powstawanie wznów nowotworowych zarówno o charakterze miejscowym, jak i regionalnym, rozwoju drugich pierwotnych nowotworów oraz ognisk satelitarnych [3–5]. Mówiąc o czystym marginesie, najczęściej ma się na myśli ocenę histologiczną preparatów barwionych HE, a w niektórych przypadkach poszerzoną o barwienia immunohistochemiczne oceniające ekspresję białka TP53 czy innych białek regulujących cykl komórkowy, np. cykliny D1. Kolejnym niezwykle cennym badaniem jest ocena ultrastrukturalna guza w transmisyjnym mikroskopie elektronowym. Dotyczy to frontu naciekania nowotworowego, liczby podziałów (indeks mitotyczny), rodzaju komórek i ich dojrzałości. Ocena ta wnosi kolejne istotne informacje oraz umożliwia precyzyjną diagnostykę marginesu resekcyjnego. Materiał poddany ocenie ultrastrukturalnej jest następnie oceniany technikami biologii molekularnej. Ważna jest informacja od patologa, że wybrano właściwy fragment resekcyjny, zawierający liczbę komórek nowotworowych w przedziale 70–80%. Materiał ten i tzw. margines resekcyjny może być dalej poddany ocenie cytogenetycznej i molekularnej.
Mimo postępu metod diagnostycznych, wyleczalność nowotworów krtani pozostaje na względnie niewysokim poziomie, nie zmieniając się w większym stopniu w ostatnich dekadach. Wśród przyczyn takiego stanu rzeczy wymienia się: częstą tendencję do wznowy procesu nowotworowego, formowanie drugich pierwotnych nowotworów oraz powstawanie przerzutów do okolicznych węzłów chłonnych. Jednocześnie obserwuje się równoległy postęp badań podstawowych, a zwłaszcza biologii molekularnej, która wyjaśniła wiele aspektów podatności na nowotwory głowy i szyi, mechanizmy choroby nowotworowej i przyczyniła się znacząco do powstania terapii celowanej [6–9]. W tej sytuacji zwrócono uwagę na wykorzystanie ustaleń komórkowych i molekularnych do opracowania markerów przebiegu choroby nowotworowej, w tym prognozowania tendencji do wznowy i powstawania drugich nowotworów pierwotnych. Zasadniczo badania idą w dwóch kierunkach. W pierwszym usiłuje się rozpoznać, czy charakterystyka samego guza zawiera w sobie informację o dalszym przebiegu choroby. Drugie podejście skupia się na analizie molekularnej otoczenia guza, uznanego histologicznie za tkankę prawidłową.
Celem artykułu jest przedstawienie i ocena obecnego stanu badań nad przydatnością analizy marginesu guza, usuwanego w trakcie zabiegu chirurgicznego i tym samym dostępnego do dalszych badań. Wartość diagnostyczna samego guza zostanie omówiona tylko porównawczo, ponieważ obecnie najpewniejszym sposobem prognozowania choroby jest uwzględnienie charakterystyki guza w skali TNM wraz ze skalą zróżnicowania histologicznego (grading – parametr G) [10].
Zabiegi chirurgiczne nowotworu pierwotnego mają na celu całkowite usunięcie guza z jego umiejscowienia pierwotnego. Warunek ten jest szczególnie istotny, gdy zastosowana w pierwszym etapie radioterapia lub chemioterapia nie przyniosły oczekiwanego efektu terapeutycznego. Dla bezpieczeństwa zaleca się usuwanie guza wraz z marginesem bezpieczeństwa. Praktyka kliniczna wskazuje, że wielkość marginesu w przypadkach raka jamy ustnej powinna wynosić 1 cm, a dla raków krtani, zwłaszcza w okolicy głośni, ok. 0,5 cm [11]. Zalecenie usuwania wraz z nowotworem marginesu tkanki zdrowej budzi jednak podejrzenie, że ani praktyka kliniczna, ani analiza histologiczna nie mogą wykluczyć istnienia poza rozpoznanym guzem zmian, które mogą zdecydować o nawrocie choroby, lub powstania nowego ogniska nowotworowego.
Występowanie zmian w obrębie marginesu, określanego histologicznie jako tkanka prawidłowa, odkryto w badaniach nad uszkodzeniami DNA pod wpływem kancerogenów dymu tytoniowego. Wykazano obecność tzw. adduktów kancerogen : DNA w tkance zdrowej otaczającej guz krtani, a poziomy tych uszkodzeń nie odbiegały lub wręcz przekraczały oznaczone w materiale usuwanego chirurgicznie guza [12, 13]. Obecnie wiadomo, że addukty DNA z jednej strony dowodzą aktywnego oddziaływania kancerogenów z DNA i podnoszą ryzyko wystąpienia transformacji nowotworowej, z drugiej natomiast są usuwane przez mechanizm naprawy DNA i niekoniecznie oznaczają wstąpienie na nieodwracalną ścieżkę nowotworową [14]. Te same uwagi dotyczą oznaczeń poziomu jednoniciowych przerw w DNA indukowanych pod wpływem kancerogenów [15]. Oznaczanie uszkodzeń DNA w formie adduktów DNA, oksydacyjnych czy przerw jednoniciowych ma więc ograniczoną przydatność prognostyczną [14].
Dalsze poszukiwania prowadzone są głównie w obrębie teorii kancerogenezy płaszczyznowej sformułowanej przez Slaughtera i wsp. już w 1953 r. Według tej ciągle obowiązującej teorii przewlekła ekspozycja na dym tytoniowy i pary wysokoprocentowych napojów alkoholowych powoduje powstanie rozległych uszkodzeń w błonie śluzowej jamy ustnej i krtani, które w wyniku pewnego zbiegu okoliczności mogą przekształcić się w zmiany przednowotworowe, a te następnie rozwijają się, tworząc ognisko nowotworowe [16, 17]. Teoria ta doskonale tłumaczy powstanie drugich (mnogich) nowotworów na bazie rozległych uszkodzeń błony śluzowej, dla której utworzono termin skazana błona śluzowa (condemned mucosa) [18]. Należy zaznaczyć, że powstała znacznie później teoria zakładająca udział komórek macierzystych w kancerogenezie nie jest sprzeczna z założeniem istnienia zmian molekularnych poza nowotworem pierwotnym [19].

Mutacje genu TP53
W poszukiwaniach molekularnego markera progresji choroby najwięcej uwagi poświęcono genowi TP53 i jego produktowi genowemu o tej samej nazwie. Produkt genu TP53 umiejscowionego na krótkim ramieniu chromosomu 17 (17p13.1) jest wielofunkcyjny i ucze-stniczy w procesach regulacji cyklu komórkowego, apoptozy i naprawy DNA. Z punktu widzenia onkogenezy TP53 pełni funkcję przeciwnowotworowego genu supresorowego [20]. Zainteresowanie tym genem wynika z faktu, że w wielu chorobach nowotworowych ulega on inaktywacji i nie wypełnia funkcji supresorowej. Zmutowany gen TP53 wykrywa się w 50–60% przypadków nowotworów głowy i szyi [21], a ponadto mutacje TP53 świadczą o klonalnym rozwoju tych nowotworów [22]. Istotne było jednak wykrywanie mutacji TP53 nie tylko w miejscu pierwotnego umiejscowienia nowotworu, lecz w znacznie szerszym obszarze górnych dróg oddechowych. Franklin i wsp. [23]
wykryli mutację G > T w kodonie 245 genu TP53 w 7 na 10 wycinkach z miejsc, gdzie stwierdzono zmiany przednowotworowe.
Na podstawie tych ustaleń Gasparatto i wsp. [24] założyli, że zmienny profil mutacji (rodzaj, liczba i lokalizacja mutacji) genu TP53 w rakach głowy i szyi można wykorzystać do odróżnienia nawrotu choroby, przerzutowania i drugich pierwotnych nowotworów. Założono, że nawroty i przerzuty zachowają ten sam profil mutacji, a drugie pierwotne nowotwory mogą podjąć proces onkogenezy w wyniku wystąpienia innych mutacji genu TP53. W analizowanych pod tym kątem 12 przypadkach, dla 4 z nich potwierdzono identyczność mutacji dla nawrotów nowotworu, a w 5 przypadkach stwierdzono różnice profilu mutacji. Analiza danych klinicznych (porównywano materiał z guza pierwotnego i zmian nowotworowych stwierdzonych po 2 latach od zabiegu) pozwoliła na zdiagnozowanie nawrotów dla pierwszej grupy, przy rozpoznaniu charakteru drugich pierwotnych nowotworów dla drugiej grupy.
Wśród starszych prac warto odnotować publikację dotyczącą niepowodzeń leczenia nowotworów głowy i szyi za pomocą radioterapii lub chirurgii skojarzonej z radioterapią [25]. W materiale archiwalnym 110 guzów oznaczono mutacje genu TP53. Krzywe Kaplana-Meyera wykazały znamiennie wyższą skłonność do rozwoju przerzutów do okolicznych węzłów chłonnych w przypadkach, gdzie wykrywano mutacje genu TP53, chociaż czas całkowitego przeżycia w obu grupach się nie różnił. Zdaniem autorów, występowanie mutacji genu TP53 w samym guzie – bez potrzeby sięgania do marginesu – jest znamiennym wykładnikiem zwiększonego ryzyka wystąpienia przerzutów nieodległych i okazuje się to zgodne z obecnym rozumieniem funkcji genu TP53. W innej pracy tego samego zespołu zajęto się mutacjami TP53 w marginesie pooperacyjnym ocenionym histologicznie jako pozbawiony cech nowotworowych. W materiale pochodzącym od
25 osób operowanych z powodu raków głowy i szyi, w 13 przypadkach wykryto mutacje genu TP53.
Po 7 mies. stwierdzono nawrót choroby u 5 z 13 mających mutacje TP53 w marginesie, podczas gdy u 12 chorych bez mutacji nie wystąpił nawrót podczas 17-miesięcznej obserwacji [26].
Podobne wnioski sformułowano po analizie 54 przypadków raka krtani, której dokonali Nathan i wsp. [27]. Mutacje genu TP53 wykryto w 53% przypadków w materiale pochodzącym z guza pierwotnego i w 11% z marginesu opisanego jako histologicznie prawidłowy. Mutacje TP53 występowały wyłącznie w marginesach tych guzów, które były obarczone mutacjami w pierwotnej lokalizacji. Mimo wykazania pozytywnego związku między zwiększonym ryzykiem wystąpienia nawrotu a występowaniem mutacji TP53 w marginesie, uwaga autorów skupiła się na sytuacji, w której nie odnotowano mutacji TP53 w guzie pierwotnym. Stwierdzono, że mutacje protoonkogenu eIF4E w badanym materiale występowały we wszystkich przypadkach guza pierwotnego i 59% materiału pochodzącego z marginesu. Również i tutaj mutacje w marginesie odpowiadały mutacjom w guzie pierwotnym. Ostatecznie autorzy wnioskują, że mutacje protoonkogenu eIF4E są znacznie pewniejszym wskaźnikiem wystąpienia nawrotu. Ten typ badań kontynuowano, porównując ekspresję białek eIF4E, TP53 i MMP-9 (metaloproteinaza) w 54 sparowanych (guz pierwotny + margines) próbkach. Nadekspresję stwierdzono, odpowiednio, dla 98, 65 i 92% guzów i stosownie mniejsze wartości dla marginesu. Tym samym wskazano na MMP-9 jako kolejny marker prognostyczny bardziej wiarygodny niż TP53 [28].
Partridge i wsp. [29] poddali analizie grupę liczącą 18 chorych leczonych z powodu raków jamy ustnej przez 36 mies. We wszystkich przypadkach margines operacyjny oceniono jako histologicznie prawidłowy. U 6 chorych wykazano nawroty choroby, a u 3 przerzuty do węzłów chłonnych. We wszystkich, oprócz jednego, przypadkach dalszego rozwoju choroby wykryto mutacje TP53. Zastosowanie radioterapii w miejscu guza pierwotnego w przypadkach mutacji TP53 nie zapobiegło nawrotowi choroby. Według autorów, wykrycie mutacji TP53 wraz ze stwierdzeniem kancerogenezy płaszczyznowej tłumaczy niepowodzenia leczenia nowotworów jamy ustnej.
Częściowo inne podejście badawcze zastosowali van Houten i wsp. [30]. Oznaczano ekspresję zmutowanego białka TP53 wyłącznie w marginesach usuwanych podczas leczenia 76 chorych na nowotwory głowy i szyi. Osoby te obserwowano następnie przez 55 mies. Wśród 50 z 76 chorych, u których stwierdzono mutacje TP53, u 13 odnotowano dalszą progresję choroby, natomiast tylko u 1 z 26 z dzikim TP53 stwierdzono nowe ognisko nowotworowe. Wyniki ekspresji zmutowanego białka zinterpretowano w kierunku naciekania komórek z pierwotnego ogniska nowotworowego (80%) lub powstania nowego ogniska (20%). Wyniki uzyskane przez Homana i wsp. [31] w grupie 105 chorych na nowotwory głowy i szyi wydają się również wskazywać to, że nadekspresja białka TP53 nie wiąże się z ekspresją białka w nowotworze pierwotnym. Wskazuje to wyłącznie na rozwój drugiego nowotworu pierwotnego, a nie na nawroty i przerzutowanie. Obserwacja chorych trwała 55 mies. Innego rozróżnienia dokonali Partridge i wsp. [3]. Mając na uwadze względnie arbitralną ocenę marginesu usuwanego wraz z nowotworem, poziom mutacji TP53 oceniano w zakresie do 5 mm (margines chirurgiczny) i poniżej 5 mm (margines głęboki). Nawroty choroby nastąpiły w ciągu 60 mies. u 11 z 16 chorych, u których w całym marginesie wykryto mutacje. Proporcja ta była znacznie większa, gdy uwzględniono wyłącznie mutacje w marginesie głębokim.
Za pomocą analizy profilu mutacji genu TP53 próbowano odróżnić agresywny i nieagresywny typ nowotworu komórek płaskonabłonkowych i podstawnych. Mimo przebadania łącznie 342 próbek materiału pochodzącego z guzów, nie udało się ustalić wyraźnej linii podziału między nowotworami agresywnymi i nieagresywnymi. Nie wyklucza to bynajmniej roli mutacji TP53 w powstawaniu obu typów nowotworów [32].
Zaufanie wzbudzają wyniki przedstawione w pracy Poeta i wsp. [33], a uzyskane na materiale pochodzącym od 560 chorych na nowotwory głowy i szyi poddanych obserwacji przez 7 lat. Na podstawie nowoczes-nych technik badawczych (Affymetrix p53 chip, denaturująca wysokosprawna chromatografia cieczowa) oznaczono mutacje TP53 wyłącznie w guzie pierwotnym, znajdując je u 224 z 420 chorych. Uwzględniono typ mutacji, dzieląc je w zależności od wpływu na strukturę białka kodowanego przez gen TP53. Obecność jakiejkolwiek mutacji TP53 zmniejszała przeżywalność chorych, przy czym efekt ten był statystycznie znamienny tylko dla mutacji znacząco modulujących strukturę białka. Duża skala opisanego doświadczenia pozwala przypuszczać, że mutacje TP53 w guzie pierwotnym są wiarygodnym markerem przeżycia, ale dla oceny ryzyka wystąpienia nawrotu, przerzutowania i drugich pierwotnych nowotworów należy analizą objąć margines operacyjny.
Kwestii przydatności analizy mutacji i ekspresji genu TP53 nie można uważać za zamkniętą, ponieważ w dalszym ciągu publikowane są prace, głównie dotyczące porównania tego markera z innymi, również reprezentującymi wczesne zmiany nowotworowe [34, 35]. Można także odnotować próbę uproszczenia analizy przez przeniesienie jej na poziom chromosomowy [36]. Techniką fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ porównano aberracje chromosomów 1, 10, 17 i 18 w marginesie operacyjnym. Wnioskiem z tych badań było wskazanie na delecję chromosomu 17 jako najlepiej korelującej z występowaniem drugich nowotworów pierwotnych. Należy dodać, że gen TP53 jest kodowany właśnie przez krótkie ramię chromosomu 17.

Inne geny jako markery prognostyczne
Podstawowym kryterium warunkującym wykorzystanie danego genu do celów diagnostycznych jest silne powiązanie z procesem onkogenezy w obrębie
głowy i szyi. Gen TP53 nie jest więc jedynym kandydatem, o czym wcześniej wspomniano.
W piśmiennictwie pojawiły się prace starające się powiązać ekspresję genów kodujących rodzinę transferaz glutationowych (GST) w marginesie wolnym od zmian nowotworowych z ryzykiem wystąpienia drugich nowotworów pierwotnych u pacjentów z rakami głowy i szyi [37]. Na względnie niewielkim materiale autorzy powiązali wysoką ekspresję GST ze zwiększonym ryzykiem rozwoju SPT, ale późniejsze badania nie potwierdziły tej zależności.
Wspomniana wcześniej proteinaza MMP-9 [28] była badana wraz z MMP-2 pod kątem zastosowania jako marker prognostyczny w rakach jamy ustnej. Wykazano, że wysoka ekspresja obu genów cechuje fenotyp przerzutowy i tym samym stanowi marker złego rokowania [38]. Z podobnym celem analizowano ekspresję cytokeratyn 5, 14 i 20, stwierdzając przydatność oznaczeń dwóch pierwszych genów za pomocą reakcji PCR z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy do wykrywania mikroprzerzutów [39]. Cytowana praca miała jednak tylko modelowy charakter, ponieważ część doświadczalną wykonano na materiale pochodzącym z linii komórkowych.
Ciekawa propozycja pochodzi z bardzo doświadczonego zespołu pracującego nad biologią nowotworów głowy i szyi w Amsterdamie. Zastosowano reakcję PCR z odwrotną transkryptazą do wykrywania ludzkiego antygenu hLy-6D, ulegającego ekspresji w 80–90% komórek nabłonka transformowanych nowotworowo. Dowiedziono znamiennych różnic między obecnością tego antygenu w komórkach guza, marginesie wolnym od nowotworu i komórkach prawidłowych [40].
Morshed i wsp. [41], badając udział wirusa brodawczaka (HPV) w raku krtani, wykryli jego obecność w 35,5% guzów (n = 93), 8,2% marginesów wolnych od nowotworu i potwierdzili brak HPV w 22 kontrolnych próbkach nienowotworowych. Wykrycie HPV w marginesie wolnym od nowotworu nie może służyć jako samodzielny marker predykcyjny w rakach krtani.

Metylacja regionów promotorowych
W ostatniej dekadzie dowiedziono, że – oprócz zmian genetycznych – nowotwory charakteryzują wiele zmian epigenetycznych. Epigenetyka opisuje zjawiska prowadzące do zmian w poziomie ekspresji genów poprzez mechanizmy nieingerujące w zapis informacji genetycznej. Do zjawisk takich zalicza się metylację reszt cytozyny dinukleotydów 5’-CpG-3’ DNA, a także kowalencyjne modyfikacje histonów (acetylacja, metylacja, fosforylacja i inne). Zarówno metylacja DNA, jak i modyfikacje histonów – zmieniając strukturę chromatyny – wpływają na ekspresję genów. Zmiany epigenetyczne zachodzą na wczesnych etapach
rozwoju guza (wykrywa się je już w formach przedrakowych niektórych nowotworów) i pogłębiają się, kiedy komórki nowotworowe zmieniają fenotyp na wysoce agresywny, zdolny do przerzutów.
Podsumowując najnowsze piśmiennictwo przedmiotu, należy podkreślić, że w nowotworach w obrębie głowy i szyi obserwowano hipermetylację takich genów, jak: p14, p15, p16, DAPK, DCC, MLH1, CDH1, RASSF1A, MGMT, RARb2, SEPT9, SLC5A8, EBF3 i IRX1 [42–44]. W płaskonabłonkowych nowotworach jamy ustnej odnotowano częstą hipermetylację następujących genów: p16, CDH1, MGMT, DAPK, DBC1, p14ARF, RARb, RASSF1, MLH1, p73, FHIT oraz
SERPINB5 [45]. Hipermetylacja regionów promotorowych prowadzi do wyciszania genów, a taka epigenetyczna regulacja ekspresji genów jest często obserwowana w nowotworach. Zjawisko to odpowiada m.in. za wyciszanie wielu przeciwnowotworowych genów supresorowych (TSG). Zakłada się, że wykrycie hipermetylacji określonych TSG w wolnym od nowotworu marginesie rokuje źle. W przeciwieństwie do TP53, którego negatywna regulacja wynika z wystąpienia mutacji, aktywność genu przeciwnowotworowego p16 (inna nazwa CDKN2A) jest regulowana właśnie za pomocą metylacji.
W grupie 79 chorych leczonych z powodu raka jamy ustnej oceniono poziom metylacji sekwencji promotorowych p16, RARb (chemoprewencja), E-kadheryny (inwazyjność), cykliny A1 i cytoglobiny, którą wykrywano w 45–85% próbek pochodzących z guza i 11–71% próbek z marginesu. Największą różnicę metylacji odnotowano dla cykliny A1, a w dalszej kolejności dla p16. Można więc stwierdzić, że metylacja obu tych genów jest specyficzna dla komórek nowotworowych [4]. Do podobnych ustaleń doszli Martone i wsp. [46], którzy badali metylację MGMT (naprawa DNA), p16 (proliferacja) i DAP-K (apoptoza) w guzach i marginesach chorych na nowotwory głowy i szyi (n = 20). Z obu przytoczonych prac wynika, że wykrycie hipermetylacji badanych genów w tkankach otaczających nowotwór jest dowodem obecności uszkodzeń płaszczyznowych źle rokujących dla pacjenta. Podobne wyniki ilościowe uzyskali Tan i wsp. [47], oceniając metylację genów supresorowych p16 i DCC oraz genu CCNA1 regulującego proliferację w grupie 42 chorych na nowotwory głowy i szyi. Podczas dodatkowej obserwacji prowadzonej przez 22 mies. wykazano, że spośród 24 chorych, u których w marginesie występowała metylacja badanych genów, u 3 wystąpiły nawroty choroby, a u 2 przerzuty. Można więc postulować, że metylacja określonych genów w marginesie jest niezależnym czynnikiem wystąpienia dalszych objawów choroby. Wniosek ten potwierdzono w prospektywnej analizie hipermetylacji genu p16 w marginesie 38 operowanych nowotworów języka. Pacjenci, u których wykryto metylację genu p16, byli obarczeni ponad 6-krotnie większym ryzykiem wystąpienia nawrotu choroby niż pozostali chorzy [48].
Na uwagę zasługuje praca Goldenberga i wsp. [49] dotycząca metylacji genów p16 i MGMT w marginesie. Zastosowanie ilościowej i metylacyjno-specyficznej techniki PCR (QMSP) wykonywanej w czasie poniżej 5 godz. pozwoliło autorom na proponowanie śród-operacyjnego przeprowadzania analizy w celu precyzyjnego ustalenia pola operacyjnego.

Niestabilność mikrosatelitarna i utrata heterozygotyczności
Rozproszone w genomie małe, repetetywne sekwencje mikrosatelitarne wykazują wysoki stopień polimorficzności. Najczęstszym uszkodzeniem sekwencji mikrosatelitarnych w nowotworach jest utrata heterozygotyczności (loss of heterozygosity – LOH), prowadząca do inaktywacji genów supresorowych. Innym uszkodzeniem okazuje się zmiana liczby powtórzeń (MSI). Analizę prowadzi się w miejscach znanych z występowania genów supresorowych.
Rosin i wsp. [50] zastosowali analizę LOH do predykcji rozwoju dysplazji epitelialnej jamy ustnej do czynnego nowotworu. Analizowano 19 loci mikrosatelitarnych w ramionach chromosomów: 3p, 4q, 8p, 9p, 11q, 13q i 17p. Wskazuje się na LOH w ramionach 3p i 9p jako wiarygodny czynnik prognostyczny. Analogiczne badania zastosowane do 10 loci chromosomowych przeprowadzono w celu oceny ryzyka wystąpienia nawrotu choroby nowotworowej u pacjentów z rakami głowy i szyi. Uznano, że LOH stanowi samodzielny czynnik rokowniczy nawrotów choroby [51]. Niemal identyczne podejście zastosowali Teman i wsp. [52] w analizie marginesów 76 pacjentów leczonych chirurgicznie z powodu raków głowy i szyi. Również i w tym przypadku zwrócono uwagę na wysoką użyteczność analizy sekwencji mikrosatelitarnych.
W badaniach własnych analizowano przydatność markerów mikrosatelitarnych na ramieniu 13q (osobno), a następnie na ramionach 3p, 7q, 8p, 9p i 18q dla oceny ryzyka nawrotu leczonych chirurgicznie raków krtani. Utratę heterozygotyczności określano w nowotworze pierwotnym, marginesie otaczającym guz, dystalnych regionach krtani (górny i dolny) oraz kontrolnie we krwi. Zaobserwowano zróżnicowaną przydatność poszczególnych markerów, wskazując na pierwszoplanową przydatność markerów umiejscowionych w regionie 3p i 17p, co w znacznym stopniu odpowiada lokalizacji genów p16 i TP53. Zaskakujące wyniki przyniosło natomiast porównanie badanych lokalizacji anatomicznych. W zakresie pracy najwyższą przydatność miała analiza materiału pierwotnego guza, zmniejszoną otaczającego marginesu, podczas gdy przydatność lokalizacji dystalnych była znikoma [5, 53].

Uwagi końcowe
Na postawione w tytule pytanie dotyczące przydatności analizy molekularnej marginesu otaczającego guz do dalszej predykcji choroby nowotworowej w obrębie głowy i szyi nie podano odpowiedzi w dwóch aspektach. Po pierwsze, nie ustalono, czy wyższą przydatność ma analiza molekularna samego guza, czy też marginesu prawidłowego histologicznie. Po drugie, nie ma zgodności odnośnie do proponowanego podejścia molekularnego. W przypadku drugiego zagadnienia warto zacytować publikację Slootwega i wsp. [54], którzy przebadali przyczyny niepowodzenia leczenia chirurgicznego 394 chorych na nowotwory głowy i szyi. Stwierdzili, że niepowodzenia są w absolutnej większości spowodowane przez niecałkowite usunięcie komórek nowotworowych. Według tych autorów, jedynymi wiarygodnymi markerami genetycznymi są ekspresja eIF4E i TP53, ale staranność zabiegu chirurgicznego nie zostawia wiele miejsca dla analizy genetycznej. Podobne spostrzeżenia podają Upile i wsp. [55], którzy jednak bardziej ostrożnie wypowiadają się w kwestii poszerzania pola operacji. W tegorocznej publikacji autorstwa Califano i wsp. [56] postuluje się natomiast konieczność intensyfikacji badań genetycznych, wskazując na takie obszary, jak ekspresja receptora naskórkowego czynnika wzrostu, LOH oraz wyciszanie genów supresorowych przez hipermetylację
sekwencji promotorowej.

Praca powstała dzięki grantowi MNSzW NN 409 290 736.
Piśmiennictwo
1. Silverman S Jr. Demographics and occurrence of oral and pharyngeal cancers. The outcomes, the trends, the challenge. J Am Dent Assoc 2001; 132 (suppl. 1): 7S-11S.
2. Neville BW, Day TA. Oral cancer and precancerous lesions. CA Cancer J Clin 2002; 52: 195-215.
3. Huang X, Pateromichelakis S, Hills A, et al. p53 mutations in deep tissues are more strongly associated with recurrence than mutation-positive mucosal margins. Clin Cancer Res 2007; 13: 6099-106.
4. Shaw RJ, Liloglou T, Rogers SN, et al. Promoter methylation of P16. RARbeta, E-cadherin, cyclin A1 and cytoglobin in oral cancer: quantitative evaluation using pyrosequencing. Br J Cancer 2006; 94: 561-8.
5. Szukała K, Sowińska A, Wierzbicka M, et al. Does loss of heterozygosity in critical regions predict a local relapse in patients after laryngectomy? Mutat Res 2006; 600: 67-76.
6. Ha PK, Califano JA. The role of human papillomavirus in oral carcinogenesis. Crit Rev Oral Biol Med 2004; 15: 188-96.
7. Weinberg RA. Mechanisms of malignant progression. Carcinogenesis 2008; 29: 1092-5.
8. Basil CF, Zhao Y, Zavaglia K, et al. Common cancer biomarkers. Cancer Res 2006; 66: 2953-61.
9. Karamouzis MV, Grandis JR, Argiris A. Therapies directed against epidermal growth factor receptor in aerodigestive carcinomas.
JAMA 2007; 298: 70-82.
10. Wierzbicka M, Szyfter W, Bień S i wsp. Zalecenia diagnostyczno-terapeutyczne dla wybranych nowotworów głowy i szyi. Post Chir Głowy Szyi 2006; 5 (supl. 1): S6-39.
11. Bradley PJ, MacLennan K, Brakenhoff RH, Leemans CR. Status of primary tumour surgical margins in squamous head and neck cancer: prognostic implications. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg
2007; 15: 74-81.
12. Szyfter K, Hemminki K, Szyfter W, et al. Aromatic DNA adducts in larynx biopsies and leukocytes. Carcinogenesis 1994; 15: 2195-9.
13. Szyfter K, Hemminki K, Szyfter W, et al. Tobacco smoke-associated
N7-alkylguanine in DNA of larynx tissue and leukocytes. Carcinogenesis 1996; 17: 501-6.
14. Phillips DH. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat Res 2005; 577: 284-92.
15. Kleinsasser NH, Wallner BC, Kastenbauer ER, et al. Comparing the genotoxic sensitivities of human peripheral blood lymphocytes and mucosa cells of the upper aerodigestive tract using the Comet assay. Mutat Res 2000; 467: 21-30.
16. Lydiatt WM, Anderson PE, Bazzana T, et al. Molecular support for field cancerization in the head and neck. Cancer 1998; 82: 1376-80.
17. van Oijen MG, Slootweg PJ. Oral field cancerization: carcinogen-induced independent events or micrometastatic deposits? Cancer Epiodemiol Biomarkers Prev 2000; 9: 249-56.
18. Braakhuis BJ, Tabor MP, Leemans CR, et al. Second primary tumors
and field cancerization in oral and oropharyngeal cancer: molecular techniques provide new insights and definitions. Head Neck 2002; 24: 198-206.
19. Garcia SP, Park HS, Novell M, Wright NA. Field cancerization, clonality, and ephitelial stem cells: The spread of mutated clones in epithelial cells. J Pathol 1999; 187: 61-81.
20. Szyfter K, Kiwerska K, Rydzanicz M i wsp. Mutacje supresorowego genu przeciwnowotworowego TP53 w nowotworach tytoniozależnych. Przeg Lekar 2009; 66: 603-7.
21. Holstein M, Sidransky D, Vogelstein B, Harris CC. P53 mutations in human cancers. Science 1991; 253: 49-53.
22. Tabor MP, van Houten VMM, Kummer JA, et al. Genetic differences between primary head and neck tumors and metastases depend on mutational status of the p53 gene. Genes Chromosomes Cancer
2002; 33: 168-77.
23. Franklin WA, Gazdar AF, Haney J, et al. Widely dispersed p53 mutation in respiratory epithelium. A novel mechanism for field carcinogenesis. J Clin Invest 1997; 100: 2133-7.
24. Gasparotto D, Maestro R, Barzan L, et al. Recurrences and second primary tumors in the head and neck region: differentiation by p53 mutation analysis. Ann Oncol 1995; 6: 933-9.
25. Koch WM, Brennan JA, Zahurak M, et al. p53 mutation and locoregional treatment failure in head and neck squamous cell carcinoma. J Natl Cancer Inst 1996; 88: 1580-6.
26. Brennan JA, Mao L, Hruban RH, et al. Molecular assessment of histophological staging in squamous-cell carcinoma of the head and neck. N Engl J Med 1995; 332: 429-35.
27. Nathan CO, Sanders K, Abreo FW, et al. Correlation of p53 and the proto-oncogene eIF4E in larynx cancers: prognostic implications. Cancer Res 2000; 60: 3599-604.
28. Nathan CO, Amirghahri N, Rice F, et al. Molecular analysis of surgical margins in head and neck squamous cell carcinoma patients. Laryngoscope 2002; 112: 2129-40.
29. Partridge M, Li SR, Pateromichelakis S, et al. Detection of minimal residual cancer to investigate why oral tumors recur despite seemingly adequate treatment. Clin Cancer Res 2000; 6: 2718-25.
30. van Houten VM, Leemans CR, Kummer JA, et al. Molecular diagnosis at surgical margins and local recurrence in head and neck patients: a prospective study. Clin Cancer Res 2004; 10: 3614-20.
31. Homan N, Nees M, Conradt C, et al. Over expression of p53 in tumordistant epithelia of head and neck cancer patients is associated with an increased incidence of second primary carcinoma. Clin Cancer Res 2001; 7: 290-6.
32. Bolshakov S, Walker CM, Strom SS, et al. p53 mutations in human aggressive and nonaggressive basal and squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res 2003; 9: 228-34.
33. Poeta ML, Manola J, Goldwasser MA, et al. TP53 mutations and survival in squamous cell carcinoma of the head and neck. N Engl
J Med 2007; 357: 2552-61.
34. Jaworska M, Kołosza Z, Liszka J, et al. Ekspresja niektórych molekularnych markerów immunohistochemicznych i ocena ich znaczenia
w rakach płaskonabłonkowych jamy ustnej i wargi. Otolaryngol Pol 2008; 62: 175-81.
35. Bilde A, von Buchwald C, Dabelsteen E, et al. Molecular markers in the surgical margin off oral carcinomas. J Oral Pathol Med
2009; 38: 72-8.
36. Wolf C, Flechtenbacher C, Dietz A, et al. p53-positive tumor-distant squamous epithelia of the head and neck reveal selective loss of chromosome 17. Laryngoscope 2004; 114: 698-704.
37. Bongers V, Snow GB, de Vries N, et al. Second primary head and neck squamous cell carcinoma predicted by the glutathione S-transferase expression in healthy tissue in the direct vicinity of the first tumor. Lab Invest 1995; 73: 503-10.
38. Patel BP, Shah SV, Shukla SN, et al. Clinical significance of MMP-2 and MMP-9 in patients with oral cancer. Head Neck 2007; 29: 564-72.
39. Becker MT, Shores CG, Yu KK, Yarbrough WG. Molecular assay to detect metastatic head and neck squamous cell carcinoma. Acta Otolaryngol Head Neck Surg 2004; 130: 21-7.
40. Graveland AP, de Maaker M, Braakhuis BJ, et al. Molecular detection of minimal residual cancer in surgical margins of head and neck cancer patients. Cell Oncol 2009; 31: 317-28.
41. Morshed K, Polz-Dacewicz M, Szymański M, Polz D. Short fragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrum detection of HPV in laryngeal squamous cell carcinoma and normal mucosa: Clinico-pathological evaluation. Eur Arch Otorhinolaryngol 2008; 265 (suppl 1): S89-96.
42. Kulkarni V, Saranath D. Concurrent hypermethylation of multiple regulatory genes in chewing tobacco associated oral squamous cell carcinomas and adjacent normal tissues. Oral Oncol 2004; 40: 145-53.
43. Maruya S, Issa JP, Weber RS, et al. Differential methylation status of tumor-associated genes in head and neck squamous carcinoma: incidence and potential implications. Clin Cancer Res 2004; 10: 3825-30.
44. Bennett KL, Karpenko M, Lin MT, et al. Frequently methylated tumor suppressor genes in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res 2008; 68: 4494-9.
45. Ha PK, Califano JA. Promoter methylation and inactivation of tumoursuppressor genes in oral squamous-cell carcinoma. Lancet Oncol
2006; 7: 77-82.
46. Martone T, Gillio-Tos A, De Marco L, et al. Association between tumor and paired surgical margins in head and neck squamous cell carcinomas. Clin Cancer Res 2007; 13: 5089-94.
47. Tan HK, Saulnier P, Auperin A, et al. Quantitative methylation analyses of resection margins predict local recurrences and disease-specific deaths in patients with head and neck squamous cell carcinomas. Br
J Cancer 2008; 99: 357-68.
48. Sinha P, Bahadur S, Thakar A, et al. Significance of promoter hypermethylation of p16 gene for margin assessment in carcinoma tonque.
Head Neck 2009; 31: 1423-30.
49. Goldenberg D, Harden S, Masayesva BG, et al. Intraoperative molecular margin analysis in haed and neck cancer. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2004; 130: 39-44.
50. Rosin MP, Cheng X, Poh C, et al. Use of allelic loss to predict malignant risk for low-grade oral epithelial dysplasia. Clin Cancer Res
2000; 6: 357-62.
51. Sardi I, Franchi A, Ferriero G, et al. Prediction of recurrence by microsatellite analysis in head and neck cancer. Genes Chromosomes Cancer 2000; 29: 201-6.
52. Teman S, Casiraghi O, Lahaye JB, et al. Tetranucleotide microsatellite instability in surgical margins for prediction of local recurrence of head and neck squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res 2004; 10: 4022-8.
53. Szukała K, Brieger J, Bruch K, et al. Loss of heterozygosity on chromosome 13q in larynx cancer patients: analysis of tumor, margin and clinically unchanged mucosa. Med Sci Monit 2004; 10: CR233-40.
54. Slootweg PJ, Hordijk GJ, Schade Y, et al. Treatment failure and margin status in head and neck cancer. A critical view on the potential value of molecular pathology. Oral Oncol 2002; 38: 500-3.
55. Upile T, Fisher C, Jerjes W, et al. The uncertainty of the surgical margin in the treatment of head and neck cancer. Oral Oncol 2007; 43: 321-6.
56. Glazer CA, Chang SS, Ha PK, Califano JA. Applying the molecular biology and epigenetics of head and neck cancer in everyday clinical practice. Oral Oncol 2009; 45: 440-6.