The pleiotropic effects of micronized fenofibrate in obese menopausal women with atherogenic dyslipidemia

Wstęp
Fibraty są lekami hipolipemicznymi, których początki sięgają lat 60. ubiegłego stulecia. Mechanizm działania polega na aktywacji receptorów aktywowanych proliferatorami peroksysomów (PPARs), głównie PPAR-a. Skutkiem aktywacji PPARs w hepatocytach jest nasilenie ekspresji genów dla syntezy enzymów b-oksydacji kwasów tłuszczowych, jak również zmniejszenie ekspresji genu kierującego syntezą apolipoproteiny (apo) CIII, w adipocytach zaś pobudzenie ekspresji genu odpowiedzialnego za wytwarzanie lipazy lipoproteinowej (LPL). Wszystko to powoduje zmniejszenie wytwarzania lipoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL) w wątrobie oraz normalizację ich kształtu i wielkości. Fibraty są również jedną z najbardziej efektywnych grup leków hipolipemizujących, zwiększających stężenie frakcji HDL cholesterolu (HDL-C) o 10–20%, co wiąże się głównie ze zwiększoną transkrypcją genów apoAI i apoAII [1, 2]. Coraz więcej badań sugeruje istnienie korzystnych pozalipidowych działań tej grupy leków. Badania in vitro dowiodły, że receptory PPAR-a modulują ekspresję genów dla syntezy białek, odgrywających kluczową rolę w reakcji zapalnej, tworzeniu się zakrzepu, regulacji apoptozy i gospodarki glukozy [3]. O ile istnieją doniesienia na temat błonowego działania statyn, ich silnych właściwości antyoksydacyjnych, a działanie przeciwzapalne w postaci zmniejszenia stężenia białka C-reaktywnego (hs-CRP) udowodniono w dużych badaniach klinicznych, o tyle fibraty nadal stanowią grupę leków znacznie słabiej pod tym względem przebadaną.
Zespół metaboliczny (ZM) jest uznawany za epidemię XXI wieku. Wiąże się z dwukrotnie częstszym występowaniem zawału serca oraz pięciokrotnie większym ryzykiem zachorowania na cukrzycę [4]. W 2005 r. International Diabetes Federation ogłosiła kryteria rozpoznania ZM, uznając za najważniejsze otyłość brzuszną, z którą wiążą się ściśle insulinooporność oraz konsekwencje metaboliczne i neurohormonalne [5]. W okresie menopauzy częstość występowania ZM wzrasta. Wiek menopauzalny uważa się również za niezależny czynnik ryzyka wystąpienia zarówno ZM, jak i każdego z jego poszczególnych elementów. Ryzyko zachorowania na ZM wzrasta do 14 lat po menopauzie, a następnie spada [6]. Typowym zaburzeniem gospodarki lipidowej w ZM jest aterogenna dyslipidemia obejmująca: zwiększone stężenie triglicerydów (TG), zmniejszone stężenie HDL-C oraz zwiększone stężenie małych, gęstych LDL. Towarzyszą jej często zaburzenia w metabolizmie lipoprotein LDL oraz nasilona lipemia popokarmowa wyrażająca się retencją w osoczu remnantów lipoprotein bogatych w TG. Badania epidemiologiczne udowodniły, że zwiększone stężenie TG w surowicy, zwłaszcza u kobiet, jest silnym czynnikiem predykcyjnym choroby niedokrwiennej serca (ChNS) niezależnym od HDL-C. Z metaanalizy 17 prospektywnych badań populacyjnych wynika, że zwiększeniu stężenia TG o każde 1 mmol/l towarzyszy wzrost ryzyka wieńcowego o 32% u mężczyzn i o 76% u kobiet [7]. Z kolei zwiększenie stężenia HDL-C o 1 mg/dl wiąże się z 3-procentową redukcją incydentów wieńcowych u kobiet i 2-procentową u mężczyzn [8]. W dyslipidemii aterogennej obserwuje się również wzrost lepkości krwi oraz zmiany w błonach plazmatycznych komórek endotelialnych, płytek krwi i erytrocytów. Wykazano, że stężenie cholesterolu, głównie frakcji LDL, w surowicy bezpośrednio przekłada się na zawartość cholesterolu w błonie erytrocytarnej. Nagromadzenie cholesterolu oraz zaburzenie proporcji cholesterolu do fosfolipidów w błonie powoduje zmniejszenie płynności błony komórkowej, a co za tym idzie, zostaje upośledzony transport jonów przez błonę. Wyniki dotyczące wpływu hipertriglicerydemii na struktury białkowo-lipidowe błon są rozbieżne [9].

Cel pracy
Celem badania była ocena wpływu terapii mikronizowanym fenofibratem na lipidy osocza, fibrynogen, kwas moczowy, glukozę, hs-CRP oraz na strukturę błony erytrocytów (cholesterol błonowy i aktywność ATP-azy-Na+/K+) u kobiet w okresie menopauzalnym z otyłością brzuszną i aterogenną dyslipidemią.

Materiał i metody
Badaniami objęto 20 kobiet w okresie menopauzalnym (średnia wieku wynosiła 56 ±4,29 roku), które spełniały następujące kryteria: obwód talii ł 80 cm, stężenie TG > 150 mg/dl, stężenie HDL-C < 50 mg/dl. Kryteriami wykluczającymi z badania były: stężenie LDL-C > 130 mg/dl, cukrzyca, umiarkowane i ciężkie nadciśnienie tętnicze, ostre i przewlekłe choroby zapalne, niewydolność krążenia, niewydolność nerek i wątroby, stosowanie leków hipolipemicznych, terapii hormonalnej oraz okres rozrodczy. Grupę porównawczą stanowiło 18 zdrowych kobiet w okresie menopauzy w wieku 55 ±3,88 roku.
Badania prowadzono przez 20 tyg. Przez pierwsze 8 tyg. pacjentkom z ZM zalecono systematyczny wysiłek fizyczny i dietę niskotłuszczową. Następnie, u pacjentek spełniających kryteria kwalifikacji, zastosowano leczenie hipolipemiczne – mikronizowany fenofibrat podawany doustnie w dawce 267 mg/dobę. Wizyty kontrolne zlecono przed terapią oraz 4 i 12 tyg. po upływie aktywnego leczenia. Podczas wizyt przeprowadzano badanie kliniczne i oznaczano następujące parametry: masę ciała, obwód pasa, wskaźnik masy ciała (body mass index – BMI), lipidogram osocza, glukozę na czczo, stężenie kwasu moczowego, fibrynogenu, hs-CRP oraz stężenie cholesterolu w błonach erytrocytarnych i aktywność ATP-azy-Na+/K+.
Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę nr RNN/58/06/KB z 21.02.2006 r. Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi.

Lipidogram osocza
Stężenia TC, LDL-C, HDL-C i TG oznaczano metodą enzymatyczną za pomocą zestawów firmy bioMerieux. Wyniki oznaczeń wyrażono w mg/dl.

Preparatyka erytrocytów
Krew żylną pobierano do probówek, używając ACD jako antykoagulanta (o składzie 23 mM kwasu cytrynowego, 45,1 mM cytrynianu sodu, 45 mM glukozy). Następnie krew wirowano przez 10 min w temperaturze 4°C (3000 obr./min) w celu usunięcia osocza i warstwy leukocytów. Uzyskane w ten sposób erytrocyty przemywano trzykrotnie 0,9-procentowym roztworem NaCl. Zawieszano je w buforze i doprowadzano do uzyskania końcowego hematokrytu o wartości 50%.

Preparatyka błon erytrocytarnych Błony plazmatyczne erytrocytów otrzymywano w wyniku hemolizy hipotonicznej wg metody Dod-ge’a i wsp. [10]. Hemoliza komórek odbywała się w 20-milimolowym buforze fosforanowym EDTA (sól dwusodowa kwasu etylenodiaminoczterooctowego) i PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu) w stosunku molowym 1 : 5, pH – 7,4. Błony przemywano 10-milimolowym buforem fosforanowym, a następnie 5-milimolowym buforem fosforanowym. Preparatykę przeprowadzono w temperaturze +40°C.

Oznaczanie cholesterolu w błonach erytrocytarnych
Ekstrakcję lipidów z błon erytrocytarnych wykonano z użyciem rozpuszczalników o małej toksyczności, wg metody Rodrigueza i Martineza [11]. Cholesterol błonowy oznaczano z użyciem odczynnika Liebermana- Burcharda metodą Ilcy [12].

Oznaczanie aktywności ATP-azy-Na+/K+ i białka C-reaktywnego
Aktywność ATP-azy-Na+/K+ badano metodą opartą na pomiarze poziomu uwolnionego ortofosforanu wg Bartosza i wsp. [13].

Oznaczanie czynników zapalnych
Białko C-reaktywne oznaczono metodą immunoenzymatyczną o wysokiej czułości (ELISA) za pomocą testów firmy DRG.
Stężenie fibrynogenu określono w osoczu cytrynianowym metodą Claussa [14].
Pozostałe badania laboratoryjne wykonano metodą kolorymetryczną z heksokinazą – stężenie glukozy, metodą enzymatyczno-kolorymetryczną z urykazą i peroksykazą – stężenie kwasu moczowego.

Metody statystyczne
Do analizy statystycznej zastosowano test różnic. W każdym przypadku rozkład badanych cech był zgodny z rozkładem normalnym. Normalność sprawdzono testem W Shapiro-Wilka. Obliczenia wykonano z użyciem programu StatisticaÒ 6.1 (StatSoft inc., Tulsa, USA).

Wyniki
W grupie pacjentek menopauzalnych z ZM w porównaniu z grupą porównawczą stwierdzono istotnie większe wartości cholesterolu całkowitego (TC), LDL-C, TG, glukozy, fibrynogenu, kwasu moczowego, hs-CRP oraz cholesterolu w błonach erytrocytarnych. Tylko aktywność ATP-azy-Na+/K+ nie różniła się istotnie od wartości uzyskanych w grupie porównawczej. Średnie stężenie HDL-C było istotnie większe w grupie porównawczej w stosunku do grupy badanej (tab. I).
Fenofibrat w dawce 267 mg/dobę stosowany u kobiet menopauzalnych z ZM przez 4 tyg. spowodował istotne zmniejszenie stężenia TG (298,19 ±51,72 vs 212,63 ±52,28 mg/dl). Po 12 tyg. stężenie TG jeszcze się zmniejszyło do średniej wartości 194,07 ±44,72 mg/dl. Stężenie TC również uległo znacznemu zmniejszeniu po 4 tyg. terapii, a po 12 tyg. osiągnęło wartość uzyskaną w grupie porównawczej (222,63 ±18,98; 199,50 ±18,83; 192,60 ±26,01 vs 195,40 ±20,10 mg/dl). Podczas terapii fenofibratem odnotowano statystycznie istotne zmniejszenie stężenia fibrynogenu i kwasu moczowego w stosunku do wartości wyjściowych, po 12 tyg. terapii stężenie tych parametrów osiągnęło wartości obserwowane w grupie porównawczej. Fenofibrat korzystnie wpłynął na wartości glikemii na czczo, zmniejszając istotnie stężenie glukozy już po 4 tyg. terapii. Średnie wartości glukozy po 12 tyg. nadal jednak były istotnie wyższe niż w grupie porównawczej. Ponadto, wykazano istotne zmniejszenie stężenia cholesterolu błonowego (tab. II). Niestety, po 12 tyg. leczenia wartości średnie nie osiągnęły poziomu wartości odnotowanych u kobiet zdrowych. W trakcie terapii fenofibratem nie obserwowano żadnych istotnych zmian stężenia hs-CRP (tab. I) i aktywności ATP-azy-Na+/K+ (tab. II).

Dyskusja
Zespół metaboliczny charakteryzuje się nagromadzeniem czynników ryzyka, które wzajemnie na siebie wpływają. Wśród nich istotną rolę odgrywają TG, których stężenie w surowicy narasta w dość szybkim tempie [15]. Coraz częściej mówi się o tym, że to jednak hipertriglicerydemia w największym stopniu jest czynnikiem prowadzącym do zawału serca i udaru [16]. Ponadto, zwiększające się stężenie TG i otyłość brzuszna (> 89 cm) to dwie najbardziej charakterystyczne cechy ZM, które zostały uznane za największe czynniki ryzyka wystąpienia incydentów sercowo-naczyniowych, a także śmiertelności wśród kobiet w okresie menopauzy [17].
Obecnie dostępnymi w Polsce lekami, które najsilniej zmniejszają stężenie TG, są fibraty. Podobnie jak statyny, fibraty wykazują działanie plejotropowe. Receptory aktywowane proliferatorami peroksysomów a odpowiadają za kontrolowanie odpowiedzi przeciwzapalnej poprzez hamowanie transkrypcji czynnika NFkB [2] i tym samym tłumienie produkcji czynników prozapalnych, takich jak interleukina 6 (IL-6), prostaglandyny i CRP [3].
W większości prac zaobserwowano, że terapia fenofibratem istotnie zmniejsza stężenie CRP, niezależnie od działania hipolipemicznego. Największe obniżenie tego parametru odnotowali Coban i wsp. [18] – o ok. 67% po 3 mies. stosowania mikronizowanego fenofibratu w dawce 200 mg/dobę u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym i dyslipidemią, oraz Yesilbursa i wsp. [19] – o 71% po 2 mies. terapii dawką leku wynoszącą 250 mg/dobę. Nie można jednak pominąć badania przeprowadzonego przez uczonych koreańskich, którzy u pacjentów z hipertriglicerydemią nie obserwowali istotnych zmian stężenia CRP pod wpływem leczenia fenofibratem przez 2 mies. Jedynie w podgrupie chorych z wyjściowym stężeniem CRP > 3 mg/dl wykazano istotny spadek tego parametru [20]. W badaniach własnych wykazano, że fenofibrat w dawce 267 mg/dobę po 12 tyg. stosowania w grupie kobiet menopauzalnych z dyslipidemią aterogenną nie zmienia istotnie stężenia hs-CRP.
Fibraty wykazują korzystny wpływ na stężenie fibrynogenu. Należy jednak podkreślić, że działanie to dotyczyło fenofibratu, ciprofibratu i bezafibratu, w przypadku zaś terapii gemfibrozylem nie stwierdzono istotnych zmian tego parametru [21]. Dodatkowym, ważnym efektem działania fenofibratu w ZM jest zmniejszenie stężeń kwasu moczowego i glukozy [22]. Wyniki badań własnych potwierdzają te korzystne właściwości fenofibratu.
Niewiele jest prac dotyczących wpływu fenofibratu na strukturę błon erytrocytów i właściwości reologiczne krwi. Uważa się, że aktywność ATP-azy-Na+/K+ w warunkach hiperlipidemii jest uzależniona od zawartości cholesterolu błonowego oraz stężeń produktów peroksydacji lipidów [9]. W badaniach własnych nie zaobserwowano istotnych zmian w aktywności ATP-azy-Na+/K+ pomiędzy pacjentkami z ZM a zdrowymi kobietami, pomimo że stężenia cholesterolu błonowego były istotnie większe w ZM. Sugeruje to, że nie istnieje ścisła i prosta zależność pomiędzy aktywnością ATP-azy-Na+/K+ a zawartością cholesterolu błonowego. Zmniejszenie stężenia cholesterolu w surowicy bezpośrednio przekłada się na redukcję cholesterolu w błonie erytrocytarnej. Poprawę płynności błony erytrocytarnej u pacjentów leczonych statynami, jak również po inkubacji ze statynami w warunkach in vitro wykazano już u chorych na hipercholesterolemię typu 2 we wcześniejszych pracach własnych [23, 24]. Fenofibrat istotnie statystycznie obniżył zawartość cholesterolu błonowego już po 4 tyg. terapii o 16%, a po 12 tyg. leczenia o 22%. Wartości te jednak nie osiągnęły poziomu wartości obserwowanych u pacjentek zdrowych.

Wnioski
1. U otyłych pacjentek z dyslipidemią aterogenną w okresie menopauzy wykazano istotne większe stężenie fibrynogenu, hs-CRP, kwasu moczowego, glukozy oraz cholesterolu w błonach erytrocytarnych w porównaniu z grupą kobiet zdrowych. Nie stwierdzono istotnych zmian w aktywności ATP-azy-Na+/K+.
2. Terapia mikronizowanym fenofibratem w dawce 267 mg/dobę po 12 tyg.:
• spowodowała istotne zmniejszenie stężenia fibrynogenu, kwasu moczowego, glukozy i cholesterolu błonowego,
• nie odnotowano istotnych zmian w aktywności ATP-azy-Na+/K+ i stężeniu hs-CRP.
3. Średnie wartości cholesterolu błonowego i glukozy po leczeniu fenofibratem były nadal większe niż w grupie porównawczej.

Piśmiennictwo
1. Fruchart JC. Mechanisms of the hypolipemic action of fibrates. J Lip Res 1996; 37: 907-11.
2. Chapman MJ. Fibrates: therapeutic review. Br J Diabetes Vasc Dis 2006; 6: 11-8.
3. Barbier O, Pindera TI, Duguay C, et al. Pleiotropic actions of peroxisome proliferator-activated receptors in lipid metabolism and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22: 717-54.
4. Stern M, Williams K, Gonzales-Villapando C, et al. Does the metabolic syndrome improve identification of individuals at risk of type 2 diabetes and cardiovascular disease? Diabetes Care 2004; 27: 2676-81.
5. Alberti KG, Zimmet P, Shaw J. Metabolic syndrome-a new world-wide definition. A Consensus Statement from the International Diabetes Federation. Diabet Med 2006; 23: 469-80.
6. Cho GJ, Lee JH, Park HT, et al. Postmenopausal status according to years since menopause as an independent risk factor for the metabolic syndrome. Menopause 2008; 15: 524-9.
7. Hokanson JE, Austin MA. Plasma trigliceride level is a risk factor for cardiovascular disease independent of high density lipoprotein cholesterol level: a mata-analysis of population-based prospective studies. J Cardiovasc Risk 1996; 3: 213-9.
8. Gordon DJ, Probstfield JL, Garrison RJ, et al. High-density lipoprotein cholesterol and cardiovascular disease: four prospective American studies. Circulation 1989; 79: 8-15.
9. Koter M, Franiak I, Strychalska K, et al. Damage to the structure of erythrocyte plasma membranes in patients with type-2 hypercholesterolemia. Int J Biochem Cell Biol 2004; 36: 205-15.
10. Dodge JT, Mitchell C, Hanahan DJ. The preparation and chemical characteristics of haemoglobin – free ghost of human erythrocytes. Arch Biochem Biophys 1963; 100: 119-30.
11. Rodriguez-Vico F, Martinez-Cayuela M, Zafra MF, et al. A procedure for the simultaneous determination of lipid and protein in biomembranes and other biological samples. Lipids 1991; 26: 77-80.
12. Kłyszejko-Stefanowicz L. Cytobiochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1995.
13. Bartosz G, Bartosz M, Sokal A, Gebicki JM. Stimulation of erythrocyte membrane Mg (2+)-ATPase activity by dinitrophenol and other membrane-disturbing agents. Biochem Mol Biol Int 1994; 34: 521-9.
14. Clauss A. Rapid physiological coagulation method for the determonation of fibrinogen. Acta Haemat 1957; 17: 237-41.
15. Rosenson RS. New approaches in the intensive management of cardiovascular risk in the metabolic syndrome. Curr Probl Cardiol 2005; 30: 241-79.
16. Ninomiya JK, L’Italien G, Criqui MH, et al. Association of the metabolic syndrome with history of myocardial infarction and stroke in the Third National Health and Nutrition Examination Survey. Circulation 2004; 109: 42-6.
17. Tanko LB, Bagger YZ, Qui G, et al. Enlarged waist combined with elevated triglycerides as a strong predictor of accelerated atherogenesis and related cardiovascular mortality in postmenopausal women. Circulation 2005; 111: 1883-90.
18. Coban E, Sari R. The effect of fenofibrate on the levels of high sensitivity C-reactive protein in dyslipidemic obese patients. Endocr Res 2004; 30: 343-9.
19. Yesilbursa D, Serdar A, Saltan Y, et al. The effect of fenofibrate on serum paraoxonase activity and inflammatory markers in patients with combined hyperlipidemia. Kardiol Pol 2005; 62: 526-9.
20. Kim JC. Effects of fenofibrate on C-reactive protein levels in hypertri-glicerydemic patients. J Cardiovasc Pharmacol 2006; 47: 759-63.
21. Piotrowski G, Gawor Z, Piotrowski W. Fibraty we współczesnej kardiologii. Czynniki Ryzyka 2003; 2-4: 104-11.
22. Harvengt C, Heller F, Dasager JP. Hypolipidemic and hypourycemic action of fenofibrate in various types of hyperlipoproteinemias. Artery 1998; 7: 73-80.
23. Koter M, Broncel M, Chojnowska-Jezierska J, et al. The effect of atorvastatin on erythrocyte membranes and serum lipids in patients with type-2 hypercholesterolemia. Eur J Clin Pharmacol 2002; 58: 501-6.
24. Franiak-Pietryga I, Koter-Michalak M, Broncel M, et al. Anti-inflammatory and hypolipemic effects in vitro of simvastatin comparing to epicatechin in patients with type-2 hypercholesterolemia. Food Chem Toxicol 2009; 47: 393-7.