Influence of intensity of primary tumour hypoxia and vascularisation on standard prognostic factors in prostate cancer patients – are biological markers helpful in prediction of cancer disease course?

Wstęp
Według danych Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) w 2000 r. zarejestrowano na świecie 513 tys. (co stanowi 9,7% wszystkich zachorowań na nowotwory złośliwe wśród mężczyzn) nowych zachorowań na raka stercza i 201 tys. (co stanowi 5,6% wszystkich zgonów z powodu nowotworów złoś- liwych u mężczyzn) zgonów z powodu tego raka [1]. W Polsce rak stercza jest drugim co do częstości nowotworem złośliwym [6257 (10%) nowych zachorowań] wśród mężczyzn i czwartą przyczyną zgonu z tego powodu [3578 (7%) zgonów] [2]. Skala problemu zdrowotnego, jaką obrazują przedstawione liczby, sprawia, że poszukiwanie sposobów poprawy rejestrowanych wyników leczenia jest ciągle aktualne.
Obiecującym kierunkiem badań prowadzącym do zindywidualizowanego wykorzystania uznanych metod postępowania (obserwacja, leczenie chirurgiczne, radioterapia, hormonoterapia, leczenie skojarzone) jest próba identyfikacji biologicznych cech nowotworu o dodatkowym znaczeniu rokowniczym i predykcyjnym. Celem badań jest sprawdzenie hipotezy o zależności markerów biologicznych (unaczynienia, hipoksji) z czynnikami o uznanej wartości rokowniczej: stopniem zaawansowania klinicznego (klasyfikacja TNM), stopniem złośliwości histologicznej (skala Gleasona) oraz wyjściowym stężeniem PSA.
Biologicznymi czynnikami o potencjalnym znaczeniu prognostycznym i predykcyjnym są markery współistniejących ze sobą w guzie i powiązanych patogenetycznie zjawisk – hipoksji i unaczynienia.
Wartość oceny hipoksji wynika zarówno z jej wpływu na wzrost promieniooporności [3] i chemiooporności guzów litych [4, 5], jak i progresję choroby nowotworowej. Centralny mediator odpowiedzi komórkowej na niskie utlenowanie, białko Hif-1a (hypoxia-inducible factor 1a) [5–7], promuje transkrypcję genów uczestniczących w podstawowych procesach życiowych komórki, zdolności naciekania środowiska oraz angiogenezie [7–13]. Ta ostatnia z kolei uważana jest za kluczowy proces decydujący o wzroście guza i tworzeniu przerzutów odległych [8]. Komplementarnymi markerami angiogenezy, obecnymi już we wczesnych jej etapach, są specyficzne dla endoteliocytów antygeny, takie jak CD31 czy CD34 [14]. Wszystkie wymienione markery są łatwo oznaczalne metodami immunohistochemicznymi.
Materiał i metody
Pacjenci
Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Bioetyczną przy Uniwersytecie Mikołaja Kopernika w Toruniu, Collegium Medicum w Bydgoszczy. Analizie poddano 43 bloczki parafinowe gruczolakoraków stercza pochodzących od pacjentów po pierwotnej prostatektomii. Średnia wieku mężczyzn w dniu operacji wynosiła 64,4 ±6,4 roku (48–75 lat). Średnie przedoperacyjne stężenie PSA osiągnęło wartość 11,1 ±7 ng/ml (3,31–39,90). Wskaźnik Gleasona wahał się 3–9 (średnia 6,2 ±1,3). U 21 chorych w badaniu pooperacyjnym stwierdzono cechę pT2, u 22 – pT3.
Badania immunohistochemiczne
Barwienie wszystkich biomarkerów przeprowadzono metodą EnVision [zestaw EnVision + System HRP, Dako, K4001; przeciwciała monoklonalne firm Chemicon (anty-Hif-1) i Dako] na skrawkach grubości 5 µm pochodzących z guzów nowotworowych zatopionych w bloczkach parafinowych. Umieszczone na adhezyjnych szkiełkach podstawowych (Knittel Glaser) skrawki inkubowano 2 godz. w termostacie komorowym w temp. 60°C, następnie odparafinowano i uwodniono. Aktywność endogennej peroksydazy hamowano 3-procentowym nadtlenkiem wodoru. Po odsłonięciu determinant antygenowych: termicznie (kuchenka mikrofalowa) dla przeciwciała anty-Hif-1a oraz enzymatycznie (0,1-procentowy roztwór pepsyny) dla przeciwciał anty-CD34, próbki inkubowano z pierwotnym przeciwciałem (Hif-1a 1 : 100; CD34 1 : 100), a następnie z odczynnikiem EnVision + System HRP. Do uwidocznienia badanych struktur wykorzystano chromogen DAB (Dako, K3468). Jądra komórkowe podbarwiono hematoksyliną (Dako, S2020). W ostatnim etapie preparaty odwadniano i zamykano w medium (Consul Mount, Thermo Shandon, USA).
Wszystkie preparaty oceniało przy użyciu mikroskopów świetlnych Olympus BX41 (Hif-1a) i Nikon Eclipse 80i z systemem do analizy obrazu (CD34) dwóch badaczy (E.Ś. i H.A.), wykorzystując wkładkę mikrometryczną (Olympus Polska), by uniknąć błędu powtórnego zliczania tych samych komórek. Pola widzenia preparatów barwionych w kierunku Hif-1a przeglądano pod 400-krotnym powiększeniem, dla barwienia CD34 – 200-krotnym.
Ocena hipoksji Nasilenie hipoksji w badanych tkankach określono na podstawie analizy ekspresji jej endogennego markera, białka Hif-1a. Wyniki jądrowego barwienia Hif-1a przedstawiono w postaci indeksu wiązania, LI (labelling index) – jako odsetek pozytywnie wybarwionych (brązowych) jąder w całkowitej liczbie ocenianych komórek. W kilku polach widzenia zliczano co najmniej 500 (maks. 1000) komórek raka stercza.
Ocena unaczynienia Stopień unaczynienia guzów określono na podstawie analizy gęstości naczyń wykazujących ekspresję białka CD34. Posługując się metodą Weidnera [15, 16], w każdym preparacie oceniano 5 pól widzenia o największej liczbie mikronaczyń (hot spots), obliczano z nich średnią arytmetyczną, a następnie przeliczano na powierzchnię 1 mm².
Analiza statystyczna
Zgodność rozkładu zmiennych z rozkładem normalnym sprawdzano testem Shapiro-Wilka. W przypadku prób o rozkładzie zbliżonym do normalnego do porównania średnich zmiennych niezależnych wykorzystano test t-Studenta. Gdy rozkład odbiegał istotnie od normalnego, różnicę między grupami analizowano testami U Manna-Whitneya i Kruskala-Wallisa. Zależność między dwiema cechami określano współczynnikiem korelacji Spearmana. Za granicę znamienności statystycznej przyjęto poziom p Ł 0,05. Obliczeń dokonano za pomocą programu komputerowego Statistica.
Wyniki
Stan utlenowania
Obecność hipoksji w guzie pierwotnym (dodatnie barwienie w kierunku Hif-1a) potwierdzono w 90,7% (39/43) raków stercza (ryc. 1.). Średni LI Hif-1a (%) wyniósł 16,1 ±13,8 (0,0–52,4), mediana 11,2.
Odnotowano istotną statystycznie korelację indeksu wiązania Hif-1a ze stopniem złośliwości histologicznej guzów w skali Gleasona (R = 0,32, p < 0,05; ryc. 2.). Nie wykazano korelacji pomiędzy nasileniem hipoksji nowotworu a pozostałymi klasycznymi czynnikami rokowniczymi (pTNM, PSA).
Stan unaczynienia
Średnia gęstość naczyń CD34 (+) wyniosła 159 ±52/mm² (75–312), mediana 148 (ryc. 3.). Odnotowano istotną statystycznie korelację pomiędzy gęstością naczyń wykazujących ekspresję CD34 a stopniem złośliwości histologicznej guzów w skali Gleasona (R = 0,65, p < 0,001; ryc. 4.).
Dodatkowo analizowano zależność pomiędzy gęstością naczyń a powszechnie przyjętymi grupami zróżnicowania histopatologicznego raka stercza: wysoko zróżnicowanym (stopień Gleasona 2–4), średnio zróżnicowanym (stopień Gleasona 5–6) i słabo zróżnicowanym (stopień Gleasona 7–10). Ze względu na niewielką liczebność grupy pierwszej (raki wysoko zróżnicowane) połączono ją z grupą drugą (raki średnio zróżnicowane). Analiza jednoczynnikowa wykazała istotną statystycznie różnicę pomiędzy medianami średnich gęstości naczyń CD34 (+) dla dwóch wyodrębnionych grup zróżnicowania (p < 0,01) o punktacji w skali Gleasona 2–6 (n = 21) oraz 7–10 (n = 22) (ryc. 5.).
Gęstość naczyń wykazujących ekspresję CD34 korelowała także ze stopniem zaawansowania klinicznego raka stercza – pTNM (R = 0,34, p < 0,05; ryc. 6.).
Dodatkowo wykazano istotny statystycznie (p < 0,01) wzrost gęstości naczyń wykazujących ekspresję CD34 dla guzów o zaawansowaniu pT3 (n = 21) w porównaniu z guzami o zaawansowaniu pT2 (n = 20). Średnia gęstość naczyń w pierwszej grupie wyniosła 184 ±54/mm² (116–312), mediana 182; w drugiej grupie 132 ±34/mm² (75–215), mediana 137.
Nie udowodniono zależności pomiędzy poziomem PSA a gęstością naczyń CD34 (+).
Gęstość naczyń CD34 (+) nie różniła się istotnie pomiędzy wyróżnionymi dla celów analizy statystycznej 4 podgrupami stężeń PSA: < 5 ng/ml (n = 5), ł 5–< 10 ng/ml (n = 18), ł 10–< 20 ng/ml (n = 14), > 20 ng/ml (n = 3).
Dyskusja
Przedstawione wyniki badania wskazują na istotne powiązania pomiędzy kliniczno-morfologicznymi i biologicznymi wskaźnikami agresywności przebiegu raka stercza, a w konsekwencji odległego rokowania u chorych. Stopień unaczynienia guza, odzwierciedlający proces neoangiogenezy nowotworowej, najpełniej koresponduje z zaawansowaniem procesu nowotworowego opisanego klasycznymi czynnikami prognostycznymi. W przeprowadzonym badaniu wykazano korelację (p < 0,05) tego parametru zarówno ze stopniem złośliwości histologicznej, jak i zaawansowaniem klinicznym raka stercza. Co więcej, gęstość naczyń CD34 (+) była istotnie różna (p < 0,001) dla pacjentów reprezentujących odmienne rokowniczo (i zgodne z powszechnie stosowanym podziałem) podgrupy: pT2 i pT3 oraz w skali Gleasona 2–6 i 7–10. Związek pomiędzy zaawansowaniem miejscowym (pT) nowotworu i jego unaczynieniem jest dobrze udokumentowany, a dotychczasowe dowody dotyczące raka stercza pochodzą także z badań z wykorzystaniem CD34 [17]. Wykazana w badaniu zależność gęstości naczyń od stopnia zróżnicowania histologicznego tkanki nowotworu wydaje się odzwierciedlać złożone, wzajemnie ze sobą powiązane procesy patofizjologiczne, regulowane na poziomie molekularnym i decydujące o ostatecznym spójnym profilu biologicznym nowotworu u danego pacjenta. Uzyskana korelacja potwierdza wcześniejsze badania oparte na ocenie ekspresji CD34 [17–19].
Brak korelacji pomiędzy badanymi czynnikami biologicznymi a stężeniem PSA nastręcza trudności interpretacyjne i pozostaje w sprzeczności z opublikowanymi skąpymi wynikami badań oceniającymi nasilenie angiogenezy nowotworowej w oparciu o barwienie VEGF [18]. Biorąc pod uwagę fakt, że stężenie PSA jest podstawowym monitorem skuteczności leczenia chorych na raka stercza, zagadnienie będzie wymagało wyjaśnienia w kolejnych analizach badawczych reprezentatywnych grup pacjentów.
Wyniki badania warunków utlenowania w guzie nie do końca odzwierciedlają zależności wykazane pomiędzy klinicznymi czynnikami rokowniczymi a unaczynieniem. Niemniej, zgodnie z danymi z piśmiennictwa [20], badanie potwierdza wysokie rozpowszechnienie zjawiska niedostatecznego utlenowania w rakach stercza (90,7%). Wykazany związek pomiędzy ekspresją Hif-1a i wskaźnikiem Gleasona (p < 0,05) pozostaje w zgodzie z wynikami badań Carnella i wsp. [21], opartych na egzogennym markerze hipoksji (antypimonidazol), i w logicznej zależności od własnych rezultatów badania nad wskaźnikiem unaczynienia. Korelacji takiej nie potwierdzili Du i wsp. [20], co może wynikać z odmiennych kryteriów interpretacji wyników reakcji immunohistochemicznych. Koncentrując uwagę na klasycznych czynnikach prognostycznych, warto zauważyć, że jedynym wskaźnikiem zależnym od badanych parametrów biologicznych okazał się stopień złośliwości histologicznej. W sposób komplementarny z nimi wydaje się odzwierciedlać nasilenie procesów decydujących o rozwoju i progresji raka stercza. Dalsze badania nad czynnikami rokowniczymi powinny koncentrować się na panelu podobnie spójnych kliniczno-biologicznych cech nowotworu u indywidualnego chorego.
Piśmiennictwo
1. Epstein JI, Algaba F, Allsbrook WC, et al. Tumours of the prostate. In: Pathology and genetics. Tumours of the urinary system and male genital organs. Eble JN (red.). IARC Press, Lyon 2004; 159-98.
2. Kordek R, Sosnowski M, Potemski P. Rak gruczołu krokowego. W: Onkologia. Podręcznik dla studentów i lekarzy. Kordek R, Jassem J, Jeziorski A, Kornafel J, Krzakowski M, Pawlęga J (red.). Wydawnictwo Via Medica, Gdańsk 2007; 261-6.
3. Nahum AE, Movsas B, Horwitz EM, Stobbe CC, Chapman JD. Incorporating clinical measurements of hypoxia into tumor local control modeling of prostate cancer: implications for the alpha/beta ratio. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2003; 57: 391-401.
4. Kimbro KS, Simons JW. Hypoxia-inducible factor-1 in human breast and prostate cancer. Endocr Relat Cancer 2006; 13: 739-749.
5. Tan Ch, de Noronha RG, Roecker AJ, et al. Identification of a novel small-molecule inhibitor of the hypoxia-inducible factor 1 pathway. Cancer Res 2005; 65: 605-12.
6. Koritzinsky M, Seigneuric R, Magagnin MG, van den Beucken T, Lambin P, Wouters BG. The hypoxic proteome is influenced by gene-specific changes in mRNA translation. Radiother Oncol 2005; 76: 177-86.
7. Phillips RJ, Mestas J, Gharaee-Kermani M, Burdick MD, Sica A, Belperio JA, Keane MP, Strieter RM. Epidermal growth factor and hypoxia-induced expression of CXC chemokine receptor 4 on non-small cell lung cancer cells is regulated by the phosphatidylinositol 3-kinase/PTEN/AKT/mammalian target of rapamycin signaling pathway and activation of hypoxia inducible factor-1alpha. J Biol Chem 2005; 280: 22473-81.
8. Swidzińska E, Naumnik W, Chyczewska E. Angiogeneza i neoangiogeneza – znaczenie w raku płuca i innych nowotworach. Pneumonol Alergol Pol 2006; 74: 414-20.
9. Jiang BH, Agani F, Passaniti A, Semenza GL. V-SRC induces expression of hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) and transcription of genes encoding vascular endothelial growth factor and enolase 1: involvement of HIF-1 in tumor progression. Cancer Res 1997; 57: 5328-35.
10. Alqawi O, Wang HP, Espiritu M, Singh G. Chronic hypoxia promotes an aggressive phenotype in rat prostate cancer cells. Free Radic Res 2007; 47: 788-97.
11. Luo Y, He DL, Ning L, Shen SL, Li L, Li X. Over-expression of hypoxia inducible factor-1alpha increases the invasive potency of LNCaP cells in vitro. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2006; 98: 1315-9.
12. Mabjeesh NJ, Willard MT, Frederickson CE, Zhong H, Simons JW. Androgens stimulate hypoxia-inducible factor 1 activation via autocrine loop of tyrosine kinase receptor/phosphatidylinositol 3’-kinase/protein kinase B in prostate cancer cells. Clin Cancer Res 2003; 9: 2416-25.
13. Palayoor ST, Tofilon PJ, Coleman CN. Ibuprofen-mediated reduction of hypoxia inducible factors Hif-1a and Hif-2a in prostate cancer cells. Clin Cancer Res 2003; 9: 3150-7.
14. Gryczyński M, Pietruszewska W. Wybrane aspekty apoptozy i proliferacji komórkowej raka krtani. Otolaryngologia 2002; 1: 151-60.
15. Weidner N. Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer. Am J Pathol 1995; 147: 919.
16. Luong RH, Baer KE, Craft DM, Ettinger SN, Scase TJ, Bergman PJ. Prognostic significance of intratumoral microvessel density in canine soft-tissue sarcomas. Vet Pathol 2006; 43: 622-31.
17. Bono AV, Celato N, Cova V, Salvadore M, Chinetti S, Novario R. Microvessel density in prostate carcinoma. Prostate Cancer Prostatic Dis 2002; 5: 123-7.
18. Stefanou D, Batistatou A, Kamina S, Arkoumani E, Papachristou DJ, Agnantis NJ. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and association with microvessel density in benign prostatic hyperplasia and prostate cancer. In Vivo 2004; 18: 155-60.
19. Trojan L, Thomas D, Friedrich D, Grobholz R, Knoll T, Alken P, Michel MS. Expression of different vascular endothelial markers in prostate cancers and BPH tissue: an immunohistochemical and clinical evaluation. Anticancer Res 2004; 24: 1651-6.
20. Du Z, Fujiyama C, Chen Y, Masaki Z. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in human normal, benign, and malignant prostate tissue. Chin Med J (Engl) 2003; 116: 1936-9.
21. Carnell DM, Smith RE, Daley FM, Saunders MI, Bentzen SM, Hoskin PJ. An immunohistochemical assessment of hypoxia in prostate carcinoma using pimonidazole: implications for radioresistance. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2006; 65: 91-9.