Wpływ niskich nierumieniotwórczych dawek promieniowania ultrafioletowego B na ekspresję reduktazy metylenotetrahydrofolianowej w skórze

Wprowadzenie

Promieniowanie ultrafioletowe (ang. ultraviolet radiation – UVR) jest najpowszechniejszym i być może najważniejszym czynnikiem środowiskowym oddziałującym na człowieka [1, 2]. Ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe może powodować zarówno stan zapalny w skórze [3, 4], jak i stan tolerancji immunologicznej [5, 6]. Pod wpływem promieniowania ultrafioletowego dochodzi do uszkodzenia DNA komórek naskórka i zaburzenia procesów naprawczych, co w konsekwencji może być przyczyną rozwoju niemelanocytowych nowotworów skóry [7, 8].

Reduktaza metylenotetrahydrofolianowa (ang. methylenetetrahydrofolate reductase – MTHFR) jest enzymem odgrywającym istotną rolę w metabolizmie folianów. Związki te są niezbędne w procesach naprawy DNA ulegającego uszkodzeniu pod wpływem promieniowania ultrafioletowego. Ponadto wykazano, że foliany biorą udział w regulacji proliferacji keratynocytów oraz innych komórek ulegających szybkim podziałom. Substratem dla MTHFR jest białko wewnątrzkomórkowe – 5,10-metylenotetrahydrofolian, który pełni istotną rolę w syntezie i naprawie DNA jądra komórkowego, podczas gdy w osoczu stwierdza się produkt reakcji enzymatycznej – 5-metylenotetrahydrofolian niezbędny do syntezy metioniny i metylacji DNA. Naprawa uszkodzeń DNA jest kluczowym zjawiskiem chroniącym organizm przed rozwojem nowotworów [9–13]. Nieprawidłowa aktywność MTHFR została uznana za jeden z czynników biorących udział w kancerogenezie. Obecnie pojedyncze prace wskazują na udział polimorfizmów w genie kodującym MTHFR w rozwoju niemelanocytowych nowotworów skóry [14]. Na podstawie danych z literatury uważa się, że foliany pełnią rolę fotoprotekcyjną.

Przeprowadzone uprzednio badania własne wykazały zwiększoną ekspresję białka MTHFR w rakach podstawnokomórkowych skóry w porównaniu ze skórą zdrową [15]. Promieniowanie ultrafioletowe, zwłaszcza w wysokich dawkach, jest głównym czynnikiem promującym rozwój nowotworów skóry poprzez działanie fotoimmunosupresyjne, jednakże dokładny mechanizm immunomodulacji i rozwoju stanu fotoimmunosupresji nie jest w pełni poznany. Nadal otwarte pozostaje zagadnienie wpływu niskich, nierumieniotwórczych dawek promieniowania ultrafioletowego na układ immunologiczny i ich udział w zjawisku fotokancerogenzy oraz rola takiej ekspozycji w uruchomieniu mechanizmów adaptacyjnych, zapobiegających rozwojowi efektów biologicznych wywołanych przez wysokie dawki promieniowania UVB. W opublikowanych badaniach własnych wykazano, że niskie dawki promieniowania UVB działają protekcyjnie w stosunku do rozwoju rumienia, ekspresji cytokin prozapalnych czy tworzenia dimerów tyminowych [8].

Cel pracy

Ze względu na biologiczną rolę, jaką spełnia MTHFR w procesach naprawczych DNA, celem pracy była ocena wpływu niskich dawek promieniowania UVB na ekspresję MTHFR w skórze zdrowych wolontariuszy.

Materiał i metodyka

Do badań zakwalifikowano 46 wolontariuszy (24 kobiety, 22 mężczyzn; średnia wieku 40,2 roku). Były to osoby ogólnie zdrowe, które nie przyjmowały żadnych leków. Każdy ochotnik wyraził pisemną zgodę na udział w badaniu. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę lokalnej Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi (nr RNN/148/2001/KE). Do badania nie kwalifikowano osób, które w okresie 2 miesięcy przed rozpoczęciem eksperymentu korzystały z solariów bądź były poddane zwiększonej ekspozycji słonecznej. Wolontariusze zostali podzieleni na cztery grupy (A–D) w zależności od stosowanego schematu naświetlań. Osiem osób było naświetlanych przewlekle nierumieniotwórczymi dawkami UVB przez 10 kolejnych dni [10 × 0,7 MED (ang. minimal erythema dose) – całe ciało] – grupa A. Kolejnych 8 ochotników było eksponowanych przez 10 kolejnych dni na nierumieniotwórcze dawki UVB (10 × 0,7 MED – całe ciało), a następnie naświetlanych aplikowaną miejscowo wysoką dawką 3 MED UVB (10 × 10 cm – skóra pośladka) – grupa B. Wolontariusze z grupy C (6 osób) poddawani byli pojedynczej, miejscowo aplikowanej ekspozycji na rumieniotwórczą dawkę 3 MED (10 × 10 cm – skóra pośladka). Grupę kontrolną, niepoddawaną naświetleniom stanowiło 24 ochotników (grupa D).

U wszystkich ochotników pobierano wycinki ze skóry pośladka przy zastosowaniu sztancy o średnicy 4 mm, które później analizowano za pomocą metody Western blot. Poza grupą kontrolną (grupa D) biopsje skóry pobierano 24 godziny po ostatnim naświetlaniu. Charakterystykę kliniczną wolontariuszy (grupy A–D) przedstawia tabela I.

Źródłem promieniowania UVB były lampy 100 W typu B12 (Philips, Eindhoven, Holandia), emitujące spektrum UVB w zakresie 285–340 nm. Natężenie promieniowania na powierzchni skóry przy 20-centymetrowej odległości obiektu od świetlówek wynosiło 3,85 mW/cm². Pomiaru natężenia dokonywano miernikiem typu UV meter (Typ I) (Waldmann Medizintechnik, Villingen-Schwenningen, Niemcy). Miejscowe naświetlanie promieniowaniem UVB (dawka 3 MED) i fototesty dla promieniowania UVB wykonano przy zastosowaniu lampy UV 109 (Waldman Medizintechnik, Vilingen-Schwenningen, Niemcy), emitującej promieniowanie UVB w zakresie 280–360 nm, przy maksimum emisji w paśmie 310 nm. Natężenie emitowanego promieniowania mierzono przy użyciu miernika promieni UV (Waldman Medizintechnik W, UV21, Villingen-Schwenningen, Niemcy) w spektrum 285–350 nm. Fototesty wykonywano w grupie 3–6 w obrębie skóry pleców. Naświetlań dokonywano wzrastającymi dawkami UVB w obrębie 6 pól o wymiarach 1 × 1 cm. Dawka wstępna okreś­lana na podstawie wywiadu, badania klinicznego i fototypu skóry [16] wynosiła 0,01–0,09 J/cm². Najmniejszą dawkę promieniowania ultrafioletowego, która po 24 godzinach powodowała jednolity, miernie nasilony rumień w całym naświetlanym polu, określono jako minimalną dawkę rumieniową (MED).

Metoda Western blot

Pobrane bioptaty skóry umieszczano w 0,5 ml buforu lizującego, zawierającego 0,25-procentowy Triton X-100 oraz Complete (inhibitor proteaz, Roche, Szwajcaria). W celu wykrycia białka zastosowano poliklonalne kozie przeciwciała pierwszorzędowe (SantaCruz Biotechnoloy, Santa Cruz, USA) skierowane swoiście przeciwko ludzkiemu MTHFR (1 : 200). Jako przeciwciał drugorzędowych użyto oślich przeciwciał znakowanych HRP (1 : 20 000) skierowanych przeciwko kozim IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratory, Suffolk, Wielka Brytania) lub oślich przeciwciał znakowanych HRP (1 : 20 000) skierowanych przeciwko mysim globulinom (Jackson ImmunoResearch Laboratory Suffolk, Wielka Brytania). W celu uwidocznienia uzyskanych prążków użyto ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Wielka Brytania) oraz systemu do wizualizacji chemiluminescencji ChemiImager™ System (Alpha Innotech, San Leandro, Kanada). Gęstość optyczną (ang. integrated density value – IDV) prążków analizowano przy użyciu oprogramowania ChemiImager™ Software (Alpha Innotech, San Leandro, Kanada).

Analiza statystyczna

Do porównań statystycznych, poza średnią arytmetyczną i odchyleniem standardowym, obliczono medianę, dolny i górny kwartyl, wartości minimum i maksimum. Do oceny istotności różnic badanych parametrów pomiędzy dwoma grupami zastosowano test U Manna-Whitneya. Dla wszystkich porównań za wartość istotną statystycznie uznawano p < 0,05.

Wyniki

W badanej grupie ochotników fototyp I/II stwierdzono u 21 osób, III również u 21 badanych, natomiast IV jedynie u 4 wolontariuszy. Średnia wartość MED wynosiła 0,145 J/cm² (tab. I). We wszystkich analizowanych bioptatach stwierdzono ekspresję MTHFR. Ekspresja MTHFR u osób naświetlanych, niezależnie od stosowanego schematu, nie różniła się statystycznie od wyników uzyskanych u osób niepoddanych ekspozycji na UVR (p > 0,05 dla wszystkich porównań) (tab. II, ryc. 1.). Porównując jednak wartości bezwzględne, najwyższą ekspresję MTHFR obserwowano w grupie A naświetlanej przez 10 kolejnych dni nierumieniotwórczymi dawkami UVB (mediana 0,7 × 106 IDV). Najniższą ekspresję analizowanego białka wykazano u wolontariuszy eksponowanych przez 10 kolejnych dni na nierumieniotwórcze dawki UVB, a następnie naświetlanych w obrębie skóry pośladka dawką 3 MED (0,3 × 106 IDV, grupa B, p < 0,05) (tab. II, ryc. 1. i 2.). W grupie kontrolnej ekspresja MTHFR wynosiła 0,5 × 106 IDV, podczas gdy wartość uzyskana w grupie naświetlanej wyłącznie dawką jednorazową 3 MED była pośrednia (0,53 × 106 IDV) (tab. II, ryc. 1.).

Omówienie

Prawidłowe stężenie folianów, dostarczanych do organizmu ludzkiego w diecie, jest uznawane za jeden z czynników związanych z mniejszą zapadalnością na nowotwory. Wykazano, że niedobór folianów wiąże się z rozwojem anemii megaloblastycznej, powstawaniem wad wrodzonych, głównie cewy nerwowej, a także zwiększonym ryzykiem rozwoju chorób układu krążenia [17]. Dane z piśmiennictwa wskazują, że ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe ma zdolność degradowania zarówno kwasu foliowego, jak też występującego zewnątrzkomórkowo 5-metylenotetrahydrofolianu, co pozwala wnioskować o obecności kolejnego związku o podłożu molekularnym pomiędzy UVR a kancerogenezą. Skóra, podlegając ciągłej ekspozycji na UVR, jest zatem tkanką charakteryzującą się zwiększonym zapotrzebowaniem na foliany ze względu na ich stałą degradację pod wpływem promieni ultrafioletowych. Jest to bardzo ważne zjawisko, tym bardziej że prawidłowa ekspresja tych białek jest niezbędna do funkcjonowania mechanizmów naprawy DNA. Wiadomo bowiem, że ekspozycja na UVR nie tylko wpływa na stężenie folianów, ale równocześnie nasila tworzenie fotoproduktów, które jeśli nie są usuwane prawidłowo przez systemy naprawcze, prowadzą do powstawania mutacji i inicjacji procesu fotokancerogenezy. Keratynocyty eksperymentalnie pozbawione folianów, a następnie poddawane ekspozycji na UVR wykazywały obniżoną zdolność naprawy uszkodzonego DNA i ulegały apoptozie [18, 19]. W prowadzonych badaniach wykazano, że podczas ekspozycji skóry pod wpływem UVA, UVB i światła widzialnego dochodzi do fotodegradacji 5-metylenotetrahydrofolianu. Autorzy wnioskują, że zjawisko to jest wynikiem oksydacji tego białka pod wpływem wolnych rodników [19]. Do chwili obecnej jedynie pojedyncze prace analizowały wpływ UVR na stężenie i ekspresję folianów. Fukuwatari i wsp. [20] wykazali w warunkach in vivo, że promieniowanie UVA powoduje degradację kwasu foliowego w surowicy, jednakże nie wpływa na stężenie 5-metylenotetrahydrofolianu. W badaniu przeprowadzonym w grupie chorych na łuszczycę leczonych naświetlaniami wąskim pasmem UVB nie wykazano wpływu tego promieniowania na stężenie folianów zarówno w surowicy, jak i w erytrocytach pacjentów [21]. Offer i wsp. [22] analizowali fotoprotekcyjne właściwości 5-metylenotetrahydrofolianu i jego zdolność do naprawy DNA jądra komórkowego po ekspozycji na promieniowanie UVA, UVB oraz światło widzialne. Wykazano, że 5-metylenotetrahydrofolian w niewielkim stopniu ulega degradacji pod wpływem promieniowania UVA i hamuje aktywację naturalnych substancji fotouczulających, np. porfiryn, oraz jest wymiataczem wolnych rodników, które są zaangażowane w uszkodzenie DNA jądra komórkowego i fotokancerogenezę [22].

Do chwili obecnej nie wiadomo, jaka ekspresja folianów w skórze jest wymagana dla prawidłowego przebiegu procesu naprawy DNA, jednakże badania przeprowadzone wśród pacjentów z rakiem kolczystokomórkowym wykazały, że spożywanie warzyw zawierających duże ilości kwasu foliowego dwukrotnie obniżało ryzyko wznowy nowotworu [23].

W dostępnym piśmiennictwie nie analizowano wpływu promieniowania ultrafioletowego na ekspresję reduktazy metylenotetrahydrofolianowej w skórze osób zdrowych. Obserwowana w badaniu własnym największa ekspresja tego białka w grupie eksponowanej przewlekle na niskie dawki UVB może wynikać z uruchamiania naturalnych systemów naprawczych DNA jądra komórkowego uszkodzonego przez UVB. Istotne zmniejszenie ekspresji MTHFR po dodatkowej ekspozycji na wysoką dawkę 3 MED UVB spowodowane jest najprawdopodobniej kumulacją dawki i fotodegradacją enzymu niezbędnego w szlaku metabolicznym folianów. Potwierdzeniem tej hipotezy może być uzyskana różnica badanych wartości ekspresji MTHFR pomiędzy grupą B i C. O istotnej roli wysokości dawki promieniowania ultrafioletowego w rozwoju procesu naprawczego świadczy fakt obniżenia ekspresji MTHFR w grupie osób poddanych tym samym procedurom co w grupie A i dodatkowo naświetlanych jednorazową wysoką dawką 3 MED UVB.

Na podstawie wyników własnych można wnioskować, że działające przewlekle dawki UVB poprzez zwiększenie ekspresji MTHFR stymulują naturalne procesy naprawcze zachodzące w skórze. Obserwacje te wymagają jednak dalszych badań na większej grupie wolontariuszy, w dłuższym przedziale czasowym.



Praca finansowana z funduszu prac statutowych Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr 503-1152-1 oraz projektu MNiSW nr NN402474731.

Piśmiennictwo

 1. Sinha R.P., Häder D.P.: UV-induced damage and repair: a review. Photochem Photobiol Sci 2002, 1, 225-236.  

2. Norval M.: Effects of solar radiation on the human immune system. J Photochem Photobiol 2001, 63, 28-40.  

3. Boonstra A., Savelkoul H.F.: The role of cytokines in ultraviolet-B induced immunosuppression. Eur Cytokine Net 1997, 8, 117-123.  

4. Garssen J., van Loveren H.: Effects of ultraviolet exposure on the immune system. Crit Rev Immunol 2001, 21, 359-397.  

5. Scholzen T.E., Brzoska T., Kalden D.H., O'Reilly F., Armstrong C.A., Luger T.A. i inni: Effect of ultraviolet light on the release of neuropeptides and neuroendocrine hormones in the skin: mediators of photodermatitis and cutaneous inflammation. J Invest Dermatol Symp Proc 1999, 4, 55-60.  

6. Schwarz A., Schwarz T.: Molecular determinants of UV-induced immunosuppression. Exp Dermatol 2002, 11, 9-12.  

7. Narbutt J., Norval M., Slowik-Rylska M., Jochymski C., Kozłowski W., Sysa-Jedrzejowska A. i inni: Suberythemal ultraviolet B radiation alters the expression of cell cycle-related proteins in the epidermis of human subjects without leading to photoprotection. Br J Dermatol 2009, 161, 890-896.  

8. Narbutt J., Lesiak A., Sysa-Jedrzejowska A., Woźniacka A., Cierniewska-Cieslak A., Boncela J. i inni: Repeated low-dose ultraviolet (UV) B exposures of humans induce limited photoprotection against the immune effects of erythemal UVB radiation. Br J Dermatol 2007, 156, 539-547.  

9. Larsson S.C., Giovannucci E., Wolk A.: Folate intake, MTHFR polymorphisms, and risk of esophageal, gastric, and pancreatic cancer: a meta-analysis. Gastroenterology 2006, 131, 1271-1283.

10. Blount B.C., Mack M.M., Wehr C.M., MacGregor J.T., Hiatt R.A., Wang G. i inni.: Folate deficiency causes uracil misincorporation into human DNA and chromosome breakage: implications for cancer and neuronal damage. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94, 3290-3295.

11. Choi S.W., Kim Y.I., Weitzel J.N., Mason J.B.: Folate depletion impairs DNA excision repair in the colon of the rat. Gut 1998, 43, 93-99.

12. Branda R.F., Blickensderfer D.B.: Folate deficiency increases genetic damage caused by alkylating agents and gamma-irradiation in Chinese hamster ovary cells. Cancer Res 1993, 53, 5401-5408.

13. Wei Q., Shen H., Wang L.E., Duphorne C.M., Pillow P.C., Guo Z. i inni: Association between low dietary folate intake and suboptimal cellular DNA repair capacity. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003, 12, 963-969.

14. Laing M.E., Dicker P., Moloney F.J., Ho W.L., Murphy G.M., Conlon P. i inni: Association of methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism and the risk of squamous cell carcinoma in renal transplant patients. Transplantation 2007, 15, 113-116.

15. Lesiak A., Wódz-Naśkiewicz K., Pawliczak R, Rogowski-Tylman M., Sysa-Jędrzejowska A., Sobjanek M. i inni: Ekspresja receptora dla witaminy D oraz reduktazy metylenotetrahydrofolianowej w rakach podstawnokomórkowych skóry. Przegl Dermatol 2010, 97, 313-318.

16. Fitzpatrick TB.: The validity and practicality of sun-reactive skin types I through VI. Arch Dermatol 1988, 124, 869-871.

17. French M.: The role of folic acid and vitamin B12 in genomic stability of human cells. Mutat Res 2010, 475, 57-67.

18. Williams J.D., Jacobson M.K.: Photobiological implications of folate depletion and repletion in cultured human keratinocytes. J Photochem Photobiol B 2010, 99, 49-61.

19. Juzeniene A., Thu Tam T.T., Iani V., Moan J.: 5-methyltetrahydrofolate can be photodegraded by endogenous photosensitizers. Free Radic Biol Med 2009, 15, 47, 1199-1204.

20. Fukuwatari T., Fujita M., Shibata K.: Effects of UVA irradiation on the concentration of folate in human blood. Biosci Biotechnol Biochem 2009, 73, 322-327.

21. Rose R.F., Batchelor R.J., Turner D., Goulden V.: Narrowband ultraviolet B phototherapy does not influence serum and red cell folate levels in patients with psoriasis. J Am Acad Dermatol 2009, 61, 259-262.

22. Offer T., Ames B.N., Bailey S.W., Sabens E.A., Nozawa M., Ayling J.E.: 5-methyltetrahydrofolate inhibits photosensitization reactions and strand breaks in DNA. FASEB J 2007, 21, 2101-2107.

23. Hughes M.C., Van der Pols J., Marks G.C., Green A.C.: Food intake and risk of squamosus cell carcinoma of the skin in a community: the Nambour skin cancer kohort study. Int J Cancer 2006, 119, 1953-1960.





Otrzymano: 9 XII 2010 r.

Zaakceptowano: 17 I 2011 r.