The influence of tumour progression on serum concentration of HER2 receptor extracellular domain and metalloproteinase 9 in patients with uterine cervical cancer

Wstęp
Najsilniejszym czynnikiem etiologicznym w rozwoju raka szyjki macicy jest zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego (ang. human papillomavirus – HPV), niemniej jednak nadekspresja receptorów naskórkowego czynnika wzrostu (ang. epidermal growth factor receptors – EGFRs) również odgrywa ważną rolę onkogenną. Jednym z tych receptorów jest HER2 (białko p185). HER2 jest receptorem przezbłonowym o aktywności kinazy tyrozynowej, zbudowanym z trzech domen – wewnątrzkomórkowej, przezbłonowej i zewnątrzkomórkowej. Domena zewnątrzkomórkowa (ektodomena) receptora HER2 (ang. extracellular domain of HER2 – ECDHER2) jest odpowiedzialna za wiązanie ligandów, czego konsekwencją jest przenoszenie sygnału do jądra komórki i stymulacja mitogenna. Nadekspresja onkoproteiny HER2 w komórkach nabłonkowych wywołuje ich proliferację i rozwój fenotypu złośliwego [1–3]. Nadekspresja białka HER2 jest obserwowana w licznych guzach, głównie w raku piersi [2, 4, 5], ale także w raku jajnika, macicy, pęcherza moczowego, jelita grubego, przełyku, trzustki, płuca. W większości przypadków nad-ekspresja białka HER2 jest rezultatem amplifikacji genu HER2 [3]. Nadekspresję białka receptorowego w guzie pośrednio można wykryć, mierząc stężenie ECDHER2 w surowicy. Ektodomena HER2 jest odszczepiana od receptora w wyniku proteolitycznej hydrolizy z udziałem metaloproteinaz, m.in. żelatynaz (MMP-9 i MMP-2) i uwalniana do krwiobiegu jako rozpuszczalna cząsteczka (białko p105). Zwiększone jej stężenie obserwowano m.in. w raku piersi, macicy, prostaty, żołądka, jelita grubego, trzustki, wątroby oraz w nowotworach głowy i szyi [6–8]. Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej (ang. matrix metalloproteinases – MMPs) są enzymami proteolitycznymi zaangażowanymi w wieloetapowy proces progresji choroby nowotworowej, w tym w inwazję i przerzutowanie. Udział MMPs w tych procesach jest możliwy dzięki temu, że substratami dla nich są składniki macierzy zewnątrzkomórkowej i błony podstawnej naczyń [9, 10]. Zwiększoną ekspresję/stężenie (aktywność) żelatynaz obserwuje się w nowotworach o różnej lokalizacji narządowej, m.in. w raku piersi [11], macicy [12], prostaty [13], pęcherza moczowego [14], przełyku [15], jelita grubego [16] czy płuca [17].
Cel pracy
Celem pracy była analiza stężeń w surowicy ECDHER2 i MMP-9 w odniesieniu do cech kliniczno-patologicznych u chorych na raka szyjki macicy, a także ocena korelacji stężenia tych białek.
Materiał i metody

Osoby badane
Grupę badaną stanowiło 40 chorych na raka szyjki macicy w wieku 30–79 lat (średnia wieku 52,4±12,1 roku), z różnym stopniem zaawansowania klinicznego. W stadium I było 28 chorych, II – 8, III – 2, IV – 2. Grupę kontrolną stanowiło 20 kobiet w wieku 23–58 lat (średnia wieku 37,4±11,1 roku). Kobiety włączone do grupy kontrolnej przedstawiły: • aktualne badanie cytologiczne z wynikiem w granicach normy, wykluczające raka szyjki macicy, • aktualne badanie USG lub mammografię, wykluczające raka piersi. Ponadto w wywiadzie nie stwierdzono u nich występowania innych nowotworów. Stężenia ECDHER2 i MMP-9 w grupie badanej oznaczano w momencie rozpoznania choroby. Badane były pacjentkami Katedry i Kliniki Onkologii i Brachyterapii CM UMK Centrum Onkologii w Bydgoszczy. Badania przeprowadzono za zgodą Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu przy Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy.
Materiał do badań
Stężenia ECDHER2 i MMP-9 oznaczano w surowicy. Krew pobierano z żyły odłokciowej w ilości 3 ml. Próbkę krwi po wykrzepieniu wirowano przez 15 min przy 3000 obrotach/min. Surowicę przechowywano w temp. –70°C.
Metody oznaczania ECDHER2 i MMP-9
Do pomiaru stężenia ECDHER2 używano odczynników firmy Calbiochem & Oncogene Research Products. Natomiast stężenie MMP-9 oznaczano za pomocą zestawu odczynników: Quantikine Human MMP-9 (total) Immunoassay firmy R&D Systems (Minneapolis, MN). Są to testy immunoenzymatyczne posługujące się metodą ELISA. Testy służą do ilościowego oznaczania stężenia ECDHER2 i MMP-9 (forma aktywna i latentna) w supernatantach hodowli komórkowych, surowicy i osoczu krwi.
Analiza statystyczna
Wnioskowanie statystyczne przeprowadzono, stosując nieparametryczny test Manna-Whitneya oraz korelację Pearsona. Za istotne statystycznie uznano różnice, dla których wartość p<0,05.
Wyniki
W tab. 1. przedstawiono zależność pomiędzy dwoma badanymi parametrami a stadium rozwoju choroby nowotworowej. Stężenie w surowicy zarówno ECDHER2, jak i MMP-9 było istotnie większe u chorych na raka szyjki macicy niż w grupie kontrolnej (odpowiednio: p=0,000 000 041 i p=0,007). Stężenie ECDHER2 było istotnie większe u chorych w stadium I niż III (p=0,038), w podgrupie w stadium I–II niż u chorych w stadium III–IV (p=0,027) oraz u chorych na raka operacyjnego niż u chorych na raka nieoperacyjnego (p=0,047). Z kolei stężenie MMP-9 zwiększało się wraz ze stopniem zaawansowania klinicznego. Było istotnie większe u chorych w stadium III niż w stadium I (p=0,03), w podgrupie chorych na raka zaawansowanego odlegle (III–IV) niż zaawansowanego miejscowo (I–II) (p=0,03) oraz większe u chorych na raka naciekającego struktury poza szyjką macicy (II–IV) niż u chorych na raka ograniczonego do szyjki macicy (I) (p=0,048). Natomiast na stężenie zarówno ECDHER2, jak i MMP-9 nie miał wpływu status N (tab. 1.). Stężenia obu markerów przeanalizowano także w podgrupach wydzielonych na podstawie mediany wieku chorych. Tylko stężenie ECDHER2 było istotnie większe u osób powyżej 54. roku życia niż u osób przed 54. rokiem życia (1,27 vs 1,14 ng/ml) (tab. 1.). Wiek badanych miał wpływ na stężenie ECDHER2 nie tylko w grupie badanej, ale także w grupie kontrolnej. Współczynnik korelacji w grupie badanej wynosił r=0,27, natomiast w grupie kontrolnej – r=0,20 (p<0,05). Zatem w obu grupach stężenie ECDHER2 zwiększało się wraz z wiekiem (ryc. 1.). Zakres wartości referencyjnych wyznaczony w badaniach własnych na podstawie grupy kontrolnej jako xśr.± 2SD wynosił dla stężenia ECDHER2: 0,08–1,12 ng/ml (min.–maks.: 0,18–1,11), natomiast dla stężenia MMP-9: 0–843,7 ng/ml (min.–maks.: 168,5–986,9). W tab. 2. przedstawiono częstość występowania stężeń przekraczających górną granicę zakresu wartości referencyjnych dla ECDHER2 i MMP-9 u chorych na raka szyjki macicy. Stężenie ECDHER2 było zwiększone u 67,5% badanych osób, częściej w stadium I i II (75,0 i 62,5%) niż w III i IV (0%) oraz częściej u chorych na raka operacyjnego niż nieoperacyjnego (73,3 vs 28,6%). Z kolei stężenie MMP-9 było zwiększone u 37,5% chorych, częstość ta rosła wraz ze stadium zaawansowania raka szyjki macicy, od 28,6% w stadium I do 100% w stadium III. Była też większa u chorych z guzem nieoperacyjnym niż operacyjnym (43,0 vs 36,7%). Oba markery – ECDHER2 i MMP-9 wykazywały słabą korelację ujemną (r=–0,19) (ryc. 2.). W pracy dokonano także oceny korelacji stężeń ECDHER2 i MMP-9 z wynikami badania morfologii krwi obwodowej (tab. 3.). ECDHER2 wykazywała najsilniejszą dodatnią korelację z liczbą leukocytów, WBC (r=0,38), natomiast MMP-9 – ujemną korelację z stężeniem hemoglobiny, HGB (r=–0,35) (tab. 3.).
Omówienie wyników
Do niedawna brak standaryzacji w ocenie stanu HER2 uniemożliwiał porównywanie wskaźnika nadekspresji w różnych guzach litych. Po wprowadzeniu do analizy Hercep Testu wykazano, że częstość występowania nadekspresji wynosi 51%, 44%, 26% i 25%, odpowiednio w guzie Wilma, raku pęcherza moczowego, trzustki i piersi. W innych badanych guzach częstość ta była mniejsza od 20% [19]. Przed wprowadzeniem tej wystandaryzowanej metodologii częstość nadekspresji w raku macicy stwierdzana w różnych badaniach wahała się od 8 do 77% [19–23], a nadekspresja była niekorzystnym czynnikiem rokowniczym [24, 25]. Poza tym, zdaniem jednych badaczy częstość nadekspresji była większa we wczesnych stadiach raka [24], inni twierdzili, że w późnych [26]. Częściej nadekspresję stwierdzano w nabłonkowych rakach szyjki macicy i u chorych w starszym wieku [20, 22]. Natomiast w badaniach Chavez-Blanco i wsp. [19], z wykorzystaniem Hercep Testu, nadekspresję HER2 stwierdzono tylko u jednej na 35 chorych z rakiem pierwotnym oraz u 2 na 4 – z nawrotem choroby. Pośrednią miarą ekspresji receptora HER2 w materiale biopsyjnym jest ocena w surowicy stężenia zewnątrzkomórkowej domeny tego receptora (białko p105) metodą ELISA. Istnieje korelacja pomiędzy ekspresją białka w błonie komórkowej a stężeniem w surowicy jego rozpuszczalnej formy [7]. Mimo licznych zalet (np. możliwość wielokrotnego oznaczania w płynach ustrojowych) białko to jest rzadko oznaczane i głównie w raku piersi. Natomiast niewiele jest doniesień na temat znaczenia badania tej rozpuszczalnej formy receptora u chorych na raka szyjki macicy. W badaniach Contreras i wsp. [27] stwierdzono, że stężenie ECDHER2 było większe u chorych na raka macicy niż w grupie kontrolnej. Podobną zależność uzyskano w badaniach własnych. Poza tym stwierdzono, że stężenie ektodomeny HER2 było większe u chorych we wcześniejszych stadiach choroby (I–II) niż późnych (III–IV) (1,20 vs 0,98 ng/ml) oraz u chorych na raka operacyjnego niż u chorych nieoperowanych (1,22 vs 1,01 ng/ml). Stężenie ECDHER2 było zwiększone aż u 67,5% chorych. Tak duża częstość występowania zwiększonego stężenia, w odniesieniu do zakresu wartości referencyjnych wyznaczonego na podstawie grupy kontrolnej, być może jest spowodowana różnicą wieku osób w obu grupach. Mediana wieku chorych wynosiła 54 lata, natomiast zdrowych 36,5 roku. Może mieć to znaczenie o tyle, że w obu grupach stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy wiekiem a stężeniem ECDHER2 (w grupie badanej r=0,27, w grupie kontrolnej r=0,20). Wynika z tego, że wraz z wiekiem stężenie surowiczego HER2 rośnie. Stężenie ektodomeny HER2 oznaczano w kombinacji z metaloproteinazą 9, dla której substratami są nie tylko elementy macierzy pozakomórkowej i błony podstawnej, ale także receptory czynników wzrostu, w tym HERs. Stężenie mRNA metaloproteinazy 9 i ekspresja białka są zwiększone w guzie i w komórkach zrębu zarówno w neoplazji śródnabłonkowej wysokiego stopnia, jak i w inwazyjnym płaskonabłonkowym raku szyjki macicy [28]. Można więc wnioskować, że MMP-9 prawdopodobnie jest wczesnym markerem tego raka. Częstość występowania nadekspresji MMP-9 (IHC) jest dość duża i waha się wg różnych badaczy od 70 do 94% [29–33]. Ekspresja MMP-9 koreluje ze stadium zaawansowania klinicznego wg FIGO [30, 32–34] oraz występowaniem przerzutów do węzłów chłonnych [29, 35]. Na podstawie danych literaturowych wiadomo, że zwiększona jest nie tylko ekspresja MMP-9 w materiale biopsyjnym guza macicy, ale także stężenie/aktywność w osoczu krwi (zymografia żelatynowa) [36]. W badaniach własnych stężenie MMP-9 oznaczano w surowicy metodą ELISA. Stężenie było większe w grupie badanej niż kontrolnej, natomiast u chorych na raka szyjki macicy zwiększało się wraz ze stadium zaawansowania klinicznego. Było większe u chorych na raka zaawansowanego odlegle niż miejscowo (1032,0 vs 478,4 ng/ml) oraz u chorych na raka naciekającego struktury poza szyjką macicy niż u chorych na raka ograniczonego do szyjki macicy (923,8 vs 453,2 ng/ml). Częstość występowania zwiększonego stężenia MMP-9 w całej grupie badanej wynosiła 37,5% i rosła wraz ze stadium zaawansowania klinicznego od 28,6% w stadium I do 100% w stadium III. W pracy dokonano także oceny korelacji dwóch oznaczanych białek. Stwierdzono, że większemu stężeniu MMP-9 u chorych na raka szyjki macicy towarzyszyło małe stężenie ECDHER2 (współczynnik korelacji r=–0,19).
Wnioski
1. Stężenie ektodomeny HER2 w surowicy u chorych na raka szyjki macicy było większe we wcześniejszych stadiach choroby niż w rakach zaawansowanych. 2. Stężenie metaloproteinazy 9 zwiększało się wraz z progresją choroby nowotworowej. 3. Surowicze stężenia ektodomeny HER2 i MMP-9 wykazywały ujemną korelację.
Piśmiennictwo
1. Cook T. What is HER2? Eur J Oncol Nurs 2000; 4: 2-9. 2. Yarden Y. Biology of HER2 and its importance in breast cancer. Oncology 2001; 61: 1-13. 3. Roskoski R. The ErbB/HER receptor protein-tyrosine kinases and cancer. Biochem Biophys Res Commun 2004; 319: 1-11. 4. Kim R, Tanabe K, Uchida Y, Osaki A, Toge T. The role of HER-2 oncoprotein in drug-sensitivity in breast cancer. Oncol Rep 2002; 9: 3-9. 5. Piccart M, Lohrisch C, Di Leo A, Larsimont D. The predictive value of HER2 in breast cancer. Oncology 2001; 61: 73-82. 6. Carney WP, Neumann R, Lipton A, Leitzel K, Ali S, Price CP. Potential clinical utility of serum HER-2/neu oncoprotein concentrations in patients with breast cancer. Clin Chim Acta 2003; 49: 1579-98. 7. Wu JT. C-erbB2 oncoprotein and its soluble ectodomain: a new potential tumor marker for prognosis early detection and monitoring patients undergoing Herceptin treatment. Clin Chim Acta 2002; 322: 11-9. 8. Lipton A, Ali SM, Leitzel K, et al. Elevated serum HER-2/neu level predicts decreased response to hormone therapy in metastatic breast cancer. J Clin Oncol 2002; 6: 1467-72. 9. Nabeshima K, Inoue T, Shimao Y, Sameshima T. Matrix metalloproteinases in tumor invasion: Role for cell migration. Pathol International 2002; 52: 255-64. 10. Cairns RA, Khokha R, Hill RP. Molecular mechanisms of tumor invasion and metastasis: An integrated view. Current Mol Med 2003; 3: 659-71. 11. Duffy MJ, Maguire MT, Hil A, McDermott E, O'Higgins N. Metalloproteinases: role in breast carcinogenesis, invasion and matastasis. Breast Cancer Res 2000; 2: 252-7. 12. Argüello-Ramírez J, Pérez-Cárdenas E, Delgado-Chávez R, Solorza-Luna G, Villa-Trevin~o S, Arenas-Huertero F. Matrix metalloproteinases-2, -3, and -9 secreted by explants of benign and malignant lesions of the uterine cervix. Int J Gynecol Cancer 2004; 14: 333-40. 13. Vaarala M. Differential gene expression in prostate cancer. University of Oulu, Auditorium 1, 2000; 2: 12. 14. Kanayama H. Matrix metalloproteinases in bladder cancer. J Med Invest 2001; 48: 31-43. 15. Yamamoto H, Vinitketkumnuen A, Adachi Y, et al. Association of matrilysin-2 (MMP-26) expression with tumor progression and activation of MMP-9 in esophageal squamous cell carcinoma. Carcinogenesis 2004; 25: 2353-60. 16. Morán A, Iniesta P, García-Aranda C, De Juan C. Clinical relevance of MMP-9, MMP-2, TIMP-1 and TIMP-2 in colorectal cancer. Oncol Rep 2005; 13: 115-20. 17. Ohbayashi H. Matrix metalloproteinases in lung diseases. Curr Protein Pept Sci 2002; 3: 409-21. 18. Ruokolainen H. The prognostic role of metalloproteinases-2 and -9 (MMP-2, MMP-9) and their tissue inhibitors-1 and –2 (TIMP-1, TIMP-2) in head and neck squamous cell carcinoma. University of Oulu, Auditorium 7, 2005; 12: 16. 19. Chavez-Blanco A, Perez-Sanchez V, Gonzalez-Fierro A, et al. HER2 expression in cervical cancer as a potential therapeutic target. BMC Cancer 2004; 4: 59-64. 20. Mitra AB, Murty VS, Pratap M, Sodhani P, Chaganti RS. ERBB2 (HER2/neu) oncogene is frequently amplified in squamous cell carcinoma of the uterine cervix. Cancer Res 1994; 54: 637-9. 21. Carreras R, Alameda F, Mancebo G, et al. A study of Ki-67, c-erbB2 and cyclin D-1 expression in CIN-I, CIN-III and squamous cell carcinoma of the cervix. Histol Histopathol 2007; 22: 587-92. 22. Oka K, Nakano T, Arai T. C-erbB-2 oncoprotein expression is associated with poor prognosis in squamous cell carcinoma of the cervix. Cancer 1994; 73: 664-71. 23. Costa MJ, Walls J, Trelford JD. c-erbB-2 oncoprotein overexpression in uterine cervix carcinoma with glandular differentiation. A frequent event but not an independent prognostic marker because it occurs late in the disease. Am J Clin Pathol 1995; 104: 634-42. 24. Hale RJ, Buckley CH, Fox H, Williams J. Prognostic value of c-erbB-2 expression in uterine cervical carcinoma. J Clin Pathol 1992; 45: 594-6. 25. Niibe Y, Nakano T, Ohno T, Suzuki Y, Oka K, Tsujii H. Prognostic significance of c-erbB-2/HER2 expression in advanced uterine cervical carcinoma with para-aortic lymph node metastasis treated with radiation therapy. Int J Gynecol Cancer 2003; 13: 849-55. 26. Nakano T, Oka K, Ishikawa A, Morite S. Correlation of cervical carcinoma c-erbB-2 oncogene with cell proliferation parameters in patients treated with radiation therapy for cervical carcinoma. Cancer 1997; 79: 513-20. 27. Contreras DN, Cobos E, Lox CD. Evaluation of the circulating fraction of the HER-2/neu oncogene in patients with cervical cancer. Eur J Gynecol Oncol 2002; 23: 491-5. 28. Davidson B, Goldberg I, Kopolovic I, Lerner-Geva L, Gotlieb WH, Weis B, Ben-Baruch G, Reich R. Expression of matrix metalloproteinase-9 in squamous cell carcinoma of the uterine cervix-clinicopatologic study using immunohistochemistry and mRNA in situ hybridization. Gynecol Oncol 1999; 72: 380-6. 29. Zhou CY, Yao JF, Chen XD. Expression of matrix metalloproteinases-2, 9 and their inhibitor – TIMP- 1, 2 in human squamous cell carcinoma of uterine cervix. Ai Zheng 2002; 21: 735-9. 30. Rauvala M. Matrix metalloproteinases -2 and -9 and tissue inhibitors of metalloproteinases -1 and -2 in gynecological cancers. Acta Univ Oul D 886, 2006. 31. Sheu BC, Lien HC, Ho HN, Lin HH, Chow SN, Huang SC, Hsu SM. Increased expression and activation of gelatinolytic matrix metalloproteinases is associated with the progression and recurrence of human cervical cancer. Cancer Res 2003; 63: 6537-42. 32. Luo CF, Zhu RQ, Wang H, Lu YL. Expression of COX-2 and MMP-9 in cervical carcinoma and their clinical significance. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 2007; 29: 526-30. 33. Asha NS, Karunagaran D, Nair MB, Sudhakaran PR. Changes in matrix metalloproteinases and their endogenous inhibitors during tumor progression in the uterine cervix. J Cancer Res Clin Oncol 2003; 129: 123-31. 34. Chung JY, Kim YT, Nam JH, Gong GY. Matrix metalloproteinases-2, -9 immunohistochemical staining in cervical carcinoma: The relationship with clinicopathologic prognostic factors. Korean J Obstet Gynecol 2001; 44: 1671-7. 35. Ouyang YW, Peng ZL, Yao XY, Liu SL, He YD. The expression of matrix metalloproteinases-2 and -9 in cervical cancer and a study of their relationship. Sichuan Da Xue Bao Yi Xue Ban 2004; 35: 330-3. 36. Yang SF, Wang PH, Lin LY, Ko JL, Chen GD, Yang JS, Lee HS, Hsieh YS. A significant elevation of plasma level of matrix metalloproteinase-9 in patients with high-grade intraepithelial neoplasia and early squamous cell carcinoma of the uterine cervix. Reprod Sci 2007; 7: 710-8.
Adres do korespondencji
dr med. Ewa Kopczyńska Katedra i Zakład Patobiochemii i Chemii Klinicznej Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy ul. M. Skłodowskiej-Curie 9 85-094 Bydgoszcz tel. +48 52 585 36 00 e-mail: kopczynska@cm.umk.pl