Znaczenie analizy wybranych haplotypów genu EVER2 w rogowaceniu słonecznym

Wprowadzenie

Najczęstszym stanem przedrakowym, na podłożu którego rozwijają się raki kolczystokomórkowe (ang. squamous cell carcinoma – SCC), jest rogowacenie słoneczne (ang. actinic keratosis – AK). Dane z piśmiennictwa wskazują, że w procesie powstawania AK znaczenie mają nie tylko czynniki środowiskowe, lecz także genetyczne lub wirusowe, choć danych dotyczących podłoża genetycznego AK jest niewiele. Szczegółowa analiza ustalonych i potencjalnych czynników ryzyka wystąpienia AK ma aktualnie szczególnie istotne znaczenie praktyczne, ponieważ w ostatnich dekadach liczba zachorowań na AK u ludzi rasy kaukaskiej znacznie się zwiększyła [1]. Szacunkowe dane wskazują, że w Polsce w ciągu ostatniego półwiecza liczba nowych przypadków AK wzrosła aż 5-krotnie, choć należy podkreślić, że nie istnieją polskie rejestry występowania AK [1, 2].
Niewątpliwie głównym czynnikiem środowiskowym w rozwoju AK jest nadmierna ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe (ang. ultraviolet radiation – UVR), przy czym prawdopodobieństwo ich powstawania wiąże się z kumulacyjną dawką promieniowania UV, a także z ekspozycją na jego sztuczne źródła. Znaczenie mają również czynniki modulujące odpowiedź na UVR, takie jak fototyp skóry, rasa, rude lub jasne włosy, niebieskie oczy, piegi oraz zamieszkiwanie w miejscach dużego nasłonecznienia. Oznacza to, że nie każda osoba ma identyczną skłonność do powstawania AK. W ostatnich latach zidentyfikowano wiele genów odpowiedzialnych za modyfikowanie ryzyka wystąpienia rogowacenia słonecznego. Początkowo w badaniach genetycznych skupiono się na poszukiwaniu genów i ich zaburzeń w tkankach nowotworowych, gdzie stwierdzono, że za rozwój ognisk AK odpowiada duże uszkodzenie DNA keratynocytów [1]. Pierwszym poznanym genem, który został powiązany z AK, był gen TP53, w obrębie którego stwierdzono powstające de novo, charakterystyczne dla UVR mutacje typu C→T i CC→TT [3]. Kolejnym etapem badań jest poszukiwanie predyspozycji genetycznej do powstawania AK ocenianej jako zmienność polimorficzna (ang. single nucleotide polymorphism – SNP) [4, 5]. Ostatnio zainteresowanie naukowców skupiło się na genach EVER. Wybór tych genów wiąże się z faktem wykrycia ich mutacji w Epidermodysplasia verruciformis, genetycznie uwarunkowanych rakach skóry spowodowanych zakażeniem swoistymi wirusami brodawczaka ludzkiego (ang. human papilloma virus – HPV) [6]. Dodatkowym, ważnym czynnikiem wskazującym na możliwy udział genów EVER w kancerogenezie jest zaangażowanie HPV w rozwój AK u pacjentów bez Epidermodysplasia verruciformis [7]. Ponadto wyniki badań analizy sprzężeń genomu wykazały silny związek pomiędzy AK a niestabilnością genomową w regionie chromosomu 17q, na którym położone są między innymi geny EVER [8]. W naszych poprzednich analizach wykazaliśmy, że polimorfizmy genu EVER2 są powiązane ze zwiększonym ryzykiem rozwoju AK oraz progresją do raka kolczystokomórkowego [9, 10]. Analiza haplotypów genów EVER dotychczas nie była wykonywana.

Cel pracy

Celem pracy była ocena predyspozycji genetycznej w powstawaniu AK na podstawie analizy haplotypów genu EVER2. Do badania włączono haplotypy genu EVER2 zbudowane z polimorfizmów, które w dostępnych danych z piśmiennictwa były znamiennie związane z AK i SCC.

Materiał i metodyka

Analizowano 65 pacjentów z AK, w tym 37 kobiet i 28 mężczyzn. Średni wiek pacjentów wynosił 75,68 ±6,22 roku, mediana 75, zakres od 61,0 do 91,0 lat. Wszyscy pacjenci mieli liczne AK (≥ 5 ognisk), stwierdzane w trakcie przeprowadzanych badań lub w wywiadzie. Zebrano dane kliniczne dotyczące wieku wystąpienia AK, czasu trwania choroby, rozległości zmian skórnych, współwystępowania SCC, fototypu skóry i przewlekłej ekspozycji na promieniowanie UV (częste spędzanie czasu na powietrzu, wyjazdy do krajów o dużym nasłonecznieniu, niestosowanie filtrów przeciwsłonecznych i korzystanie z solariów). Pacjenci mieli ogniska AK zlokalizowane na twarzy (policzki, nos, czoło), uszach, skalpie, grzbietach rąk, klatce piersiowej i na plecach. Średni czas trwania choroby wynosił 7,88 ±6,06 roku (mediana 5 lat, zakres od 6 miesięcy do 25 lat). Pierwsze zmiany wystąpiły średnio w wieku 67,8 ±7,99 roku (mediana 69, zakres od 44. do 89. roku życia). Grupa kontrolna obejmowała 274 osoby (137 kobiet, 137 mężczyzn), które były poddane testom na ustalenie ojcostwa w Zakładzie Genetyki Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego i wyraziły pisemną zgodę na anonimowe wykorzystanie swojego DNA do celów naukowych. Dokładny wiek osób z grupy kontrolnej nie był znany, ale wiadomo, że były to osoby młodsze w porównaniu z pacjentami. Ze względu na badaną predyspozycję genetyczną właściwe dobranie wieku w tym przypadku nie wpływało istotnie na wyniki analiz.
Na podstawie wyników otrzymanych w dostępnych badaniach dotyczących częstości występowania polimorfizmów genu EVER2 za pomocą programu PLINK [11] obliczono frekwencje poszczególnych haplotypów u pacjentów z AK i w grupie kontrolnej oraz oceniono ich związek z parametrami klinicznymi. W badaniach DNA izolowano z próbek krwi pełnej pobranej na kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) przy użyciu komercyjnego zestawu NucleoMag firmy Macherey-Nagel, Bethlehem w USA. Próbki krwi poddano genotypowaniu przy użyciu łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. real time-polymerase chain reaction – RT-PCR) przy użyciu zestawów o numerach katalogowych C_3068817_10, C_3068816_10 i 4331349 rs073AHS1DR0 SNP AbD zaprojektowanych przez producenta (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Reakcję przeprowadzono w aparacie 7500 Real Time PCR System firmy Applied Biosystems. Próbki o znanych genotypach losowo weryfikowano metodą sekwencjonowania. Reakcje łańcuchowe polimerazy przeprowadzano w aparacie GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Wellesley, USA) o następującym składzie mieszaniny reakcyjnej: 5,5 pmol/l każdego ze znaczników (ang. primer), 3,2 lL dNTP, 300 ng genomowego DNA, 1 lL MgCl2 w stężeniu 25 mmol/l i 3 U polimerazy Taq DNA (Fermentas, Wilno, Litwa). Do sekwencjonowania użyto BidDye Terminator v3.1 zgodnie z protokołem zaleconym przez producenta na analizatorze ABI PRISM 3130XL (Applied Biosystems).
Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Bioetyczną przy Warszawskim Uniwersytecie Medycznym. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu.

Analiza statystyczna

Jako próg istotności statystycznej przyjęto p < 0,05.

Wyniki

Za pomocą programu PLINK wyznaczono 5 haplotypów, tj. ATA, AGG, AGA, TGG, TGA, zbudowanych z polimorfizmów 917A>T (rs7208422), 988-4G>T (rs62079073) i 1107G>A (rs12452890) genu EVER2. W haplotypach litery oznaczają odpowiednio: pierwsza litera polimorfizm –917A>T, druga –988-4G>T, trzecia –1107G>A. U pacjentów z AK i w grupie kontrolnej najczęściej stwierdzanymi haplotypami były haplotypy AGG i TGA, natomiast ze względu na niską frekwencję odrzucono kombinację TTG, która występowała z częstością rzadszą niż 0,01 w obu grupach. Analiza porównawcza nie wykazała istotnych różnic w rozkładzie haplotypów (tab. 1). Przeprowadzono analizy częstości haplotypów w zależności od wybranych parametrów klinicznych u pacjentów z AK. Do analiz wybrano parametry, które wykazywały znamienność statystyczną we wcześniejszych pracach, tj. wiek wystąpienia AK, rozległość zmian skórnych, współistnienie SCC oraz fototyp skóry i wywiad przewlekłej ekspozycji na UVR. Badaniu poddano haplotypy zbudowane z polimorfizmów –917A>T i –988-4G>T oraz z polimorfizmów –988-4G>T i –1107G>A, które utworzyły łącznie 8 wariantów (AT, TT, AG, TG, TG, GG, TA, GA). W analizach wykazano istotnie częstsze występowanie haplotypu TG (–917A>T i –988-4G>T) u pacjentów, u których choroba wystąpiła przed 70. rokiem życia (0,6117 vs 0,417; p = 0,029), oraz stwierdzono istotną statystycznie przewagę występowania tego haplotypu u pacjentów, którzy mieli większą rozległość zmian skórnych, tj. występowania ognisk AK przynajmniej w 3 różnych okolicach (0,6085 vs 0,414; p = 0,029) (tab. 2). Wskazuje to na rolę konfiguracji TG w AK. Analiza częstości występowania haplotypów EVER2 u pacjentów w zależności od współistnienia SCC wykazała, że haplotyp TA utworzony z polimorfizmów –988-4G>T i –1107G>A występował tylko u pacjentów z AK, natomiast nie pojawiał sie u pacjentów ze współistniejącymi SCC (wynik na granicy istotności statystycznej, p = 0,059) (tab. 3). Haplotyp AG zbudowany z polimorfizmów (–917A>T i –988-4G>T) był częściej stwierdzany u pacjentów, u których choroba wystąpiła poniżej 70. roku życia, w porównaniu z pacjentami, u których AK pojawiło się w późniejszym wieku, a różnica ta była istotna statystycznie (0,5141 vs 0,3138; p = 0,023). Częstość tego haplotypu była natomiast istotnie większa u chorych z mniejszą rozległością AK (mniej niż 3 okolice) (0,5146 vs 0,3201; p = 0,027). Nie stwierdzono znamienności statystycznej zależności pomiędzy występowaniem któregokolwiek z haplotypów a fototypem skóry. Analiza częstości występowania haplotypów EVER w zależności od wywiadu przewlekłej ekspozycji na UVR wykazała, że haplotypy AT utworzone z polimorfizmów 917A>T i –988-4G>T oraz TG utworzony z polimorfizmów –988-4G>T i –1107G>A były zdecydowanie częstsze u pacjentów z AK, którzy negowali przewlekłą ekspozycję na promieniowanie UV (odpowiednio p = 0,007, p = 0,046) (tab. 4).

Omówienie

Haplotyp to w genetyce zestaw polimorfizmów pojedynczych nukleotydów położonych na tej samej chromatydzie, który dziedziczy się jako zestaw sprzężonych ze sobą alleli. Dane z piśmiennictwa wskazują, że w predyspozycji do powstawania nowotworów znaczenie mogą mieć nie tylko polimorfizmy genów, lecz także odpowiednie ich konfiguracje, czyli haplotypy [12]. Ponadto wiadomo, że niektóre polimorfizmy, chociaż położone w różnej odległości w obrębie jednego lub różnych genów, mogą mieć działanie synergistyczne, co potwierdza udział kilku niezależnych alleli w patogenezie choroby nowotworowej. W zestawieniu haplotypu allele mogą mieć charakter protekcyjny i chronić przed nowotworami lub promujący i wpływać na rozwój nowotworu [13]. Z tego powodu w najnowszych pracach, w których poszukuje się wariantów genetycznych odpowiedzialnych za powstawanie różnych pozaskórnych nowotworów złośliwych człowieka, przeprowadza się dodatkowo analizę haplotypów. Dotychczas jednak opublikowano jedynie nieliczne prace, w których oceniano haplotypy w stanach przedrakowych lub rakach skóry, pomimo licznych badań dotyczących zmienności w obrębie wielu genów, takich jak protoonkogeny, geny supresorowe, kontrolujące apoptozę lub regulujące naprawę DNA.
W aktualnie dostępnych kilku pracach dotyczących genów EVER wykazano, że obecność polimorfizmów genów EVER1 i EVER2 sprzyja występowaniu AK, SCC oraz raka szyjki macicy. W przypadku skórnej kancerogenezy związek ten dotyczył polimorfizmu TT i allela T 917A>T (rs7208422) oraz polimorfizmu TT, TG i allela T 988-4G>T. W rakach szyjki macicy zależności te stwierdzono pomiędzy wieloma polimorfizmami, przy czym były one najsilniejsze z polimorfizmem rs9893818, rs2290907 i rs16970849. Wszystkie te wyniki uzyskano u pacjentów, którzy nie mieli istotnych zaburzeń immunologicznych [9, 10, 14, 15]. Należy podkreślić, że w opublikowanym w 2015 r. badaniu przeprowadzonym u pacjentów leczonych immunosupresyjnie z powodu przeszczepów narządowych, u których dodatkowo występowały SCC, nie stwierdzono zaburzeń genów EVER, co pokazuje, że ich udział w kancerogenezie może być jeszcze przedmiotem dyskusji [16]. W przedstawionej pracy analizowaliśmy haplotypy genu EVER2 złożone z polimorfizmów, które uzyskały istotność statystyczną w poprzednich naszych pracach oraz w dostępnych badaniach nad AK i SCC. Do obecnych badań włączono w sumie 13 haplotypów, które otrzymały częstość powyżej 0,001, w tym 5 haplotypów złożonych z trzech alleli polimorfizmów 917A>T, 988-4G>T i 1107G>A, 4 haplotypy złożone z dwóch alleli polimorfizmów 917A>T i 988-4G>T oraz 4 haplotypy złożone z 988-4G>T i 1107G>A. Stwierdzono, że zarówno w grupie pacjentów, jak i w grupie kontrolnej najczęstsze były haplotypy AGG i TGA, choć nie wykazano istotnych statystycznie różnic pomiędzy nimi. Haplotyp TG (917A>T, 988-4G>T) zawierający allel promujący T 917A>T był istotnie częstszy u pacjentów, u których choroba wystąpiła przed 70. rokiem życia oraz zauważono istotną statystycznie przewagę występowania tego haplotypu u pacjentów z rozsianymi ogniskami AK. Uzyskane wyniki wskazują na promującą rolę konfiguracji TG w AK. W przeprowadzonych przez nas analizach wykazaliśmy również, że haplotyp TA utworzony z polimorfizmów 988-4G>T i 1107G>A nie występował u pacjentów, którzy mieli jednocześnie AK i SCC. Potwierdza to działanie protekcyjne allela T 988-4G>T, co wykazaliśmy w poprzednich naszych badaniach [9]. Ponadto u pacjentów z AK i ujemnym wywiadem przewlekłej ekspozycji na UVR stwierdzono częstsze występowanie haplotypów AT (917A>T, 988-4G>T) oraz TG (988-4G>T i 1107G>A).
Ograniczeniem naszej pracy jest relatywnie mała liczba pacjentów z AK. W przyszłości planowane są dalsze badania na większej grupie chorych, które umożliwią walidację otrzymanych wyników i lepsze zrozumienie genetycznych mechanizmów skórnej kancerogenezy. W ostatnich latach przeprowadzono kilka metaanaliz dotyczących różnych zaburzeń genetycznych u pacjentów z SCC, w których oceniano predyspozycje do wystąpienia choroby. Lista genów, których dziedzicznie przekazywane uszkodzenie wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na SCC, stale się wydłuża. W przeciwieństwie do SCC analiza polimorfizmów i haplotypów w AK była dotychczas oceniana bardzo rzadko. Znacznie częściej poszukiwania nowych haplotypów dotyczą predyspozycji genetycznej do występowania SCC, zwłaszcza w obrębie jamy ustnej. W badaniach nad tym nowotworem stwierdzono wpływ haplotypów genu sulfotransferazy (SULTIA1), haplotypów genu reduktazy metylenotetrahydrofolianowej (MTHFR), haplotypów genów związanych z naprawą DNA i genów z rodziny inhibitorów proteinazy serynowej (SERPIN) [17–20]. W SCC zlokalizowanych w obrębie skóry badano haplotypy genów mających znaczenie w melanogenezie, m.in. gen MC1R, ASIP AH, TYR, OCA2, SLC45A2, wśród których silną zależność opisano pomiędzy haplotypem genu ASIP AH oraz haplotypem genu dla IL-10 a ryzykiem wystąpienia SCC [21, 22]. Badano też haplotypy licznej grupy genów odpowiedzialnych za naprawę uszkodzeń DNA, wśród których wykazano niekorzystną rolę haplotypu genu XPA w kancerogenezie skórnej [23]. Niektóre z haplotypów mają wpływ protekcyjny. Analiza haplotypów zbudowanych z polimorfizmów genów regulatorowych, takich jak miR-146a i RNASEL, wykazała odwrotną zależność między predyspozycją a występowaniem SCC [24]. Reasumując powyższe dane – predyspozycja do występowania SCC ma charakter poligenowy. Zdecydowanie mniej wiadomo na temat predyspozycji genetycznej do występowania AK, czego przykładem jest fakt, że nie ma badań dotyczących oceny haplotypów w AK, zwłaszcza że to właśnie na podłożu AK rozwijają się SCC. Należy przypuszczać, że występujące odchylenia genetyczne w AK i SCC powinny być takie same, co wymaga jednak sprawdzenia w toku dalszych badań.

Podsumowanie

Wpływ czynników środowiskowych oraz dodatkowo współdziałanie różnych zaburzeń w wielu genach może doprowadzić do ryzyka zachorowania na AK. Do tej listy dołączane są wciąż nowe geny, których polimorfizmy mogą być traktowane jako wskaźniki ryzyka wystąpienia choroby nowotworowej. W wielu pracach przeprowadza się analizę rozkładu wariantów genu na chromosomach, tzw. analiza rozkładu haplotypów. Uzyskane w pracy dane przekonują o konieczności wykonywania badania haplotypów w ocenie predyspozycji genetycznej do stanów przedrakowych i raków skóry.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Piśmiennictwo

1. Włodarkiewicz A., Narbut J., Adamski Z., Chodorowska G., Kaszuba A., Reich A. i inni: Rogowacenie słoneczne – aktualny stan wiedzy. Stanowisko ekspertów Polskiego Towarzystwa Dermatologicznego. Przegl Dermatol 2014, 101, 156-167.
2. Zwierko M.: Epidemiologia nowotworów skóry. [w:] Złośliwe nowotwory skóry. P. Rutkowki (red.). Via Medica, Gdańsk, 2014, 1-10.
3. Nelson M.A., Einspahr J.G., Alberts D.S., Balfour C.A., Wymer J.A., Welch K.L. i inni: Analysis of the p53 gene in human precancerous actinic keratosis lesions and squamous cell cancers. Cancer Lett 1994, 85, 23-29.
4. Rehman I., Takata M., Wu Y.Y., Rees J.L.: Genetic change in actinic keratoses. Oncogene 1996, 12, 2483-2490.
5. Madan V., Lear J.T., Szeimies R.M.: Non-melanoma skin cancer. Lancet 2010, 375, 673-685.
6. Ramoz N., Rueda L.A., Bouadjar B., Montoya L.S., Orth G., Favre M.: Mutations in two adjacent novel genes are associated with epidermodysplasia verruciformis. Nat Genet 2002, 32, 579-581. 7. Pfister H., Fuchs P.G., Majewski S., Jablonska S., Pniewska I., Malejczyk M.: High prevalence of epidermodysplasia verruciformis-associated human papillomavirus DNA in actinic keratoses of the immunocompetent population. Arch Dermatol Res 2003, 295, 273-279.
8. Mortier L., Marchetti P., Delaporte E., Martin de L.E., Thomas P., Piette F.: Progression of actinic keratosis to squamous cell carcinoma of the skin correlates with deletion of the 9p21 region encoding the p16(INK4a) tumor suppressor. Cancer Lett 2002, 176, 205-214.
9. Kalińska-Bienias A., Majewski S.: Polimorfizm pojedynczych nukleotydów genu EVER2 w rakach kolczystokomórkowych skóry u pacjentów z rogowaceniem słonecznym. Przegl Dermatol 2013, 100, 281-286.
10. Kalinska-Bienias A., Kostrzewa G., Malejczyk M., Ploski R., Majewski S.: Possible association between actinic keratosis and the rs7208422 (c.917A→T, p.N306l) polymorphism of the EVER2 gene in patients without epidermodysplasia verruciformis. Clin Exp Dermatol 2015, 40, 318-323.
11. Purcell S., Neale B., Todd-Brown K., Thomas L., Ferreira M.A., Bender D.: PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Am J Hum Genet 2007, 81, 559-575.
12. Drewa G.: Genetyczne i środowiskowe uwarunkowania nowotworów. [w:] Genetyka medyczna. G. Drewa, T. Ferenc (red.). Elsevier Urban&Partner, Wrocław, 2011, 581-602.
13. Luizon M.R., de Almeida Belo V.: Matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 polymorphisms and haplotypes as disease biomarkers. Biomarkers 2012, 17, 286-288.
14. Patel A.S., Karagas M.R., Pawlita M., Waterboer T., Nelson H.H.: Cutaneous human papillomavirus infection, the EVER2 gene and incidence of squamous cell carcinoma: a case-control study. Int J Cancer 2008, 122, 2377-2379.
15. Castro F.A., Ivansson E.L., Schmitt M., Juko-Pecirep I., Kjellberg L., Hildesheim A. i inni: Contribution of TMC6 and TMC8 (EVER1 and EVER2) variants to cervical cancer susceptibility. Int J Cancer 2012, 130, 349-355.
16. Burger B., Sporri I., Stegmann D.A., de Mesmaker J., Schaub S., Itin P.H. i inni: Risk of cutaneous squamous cell carcinoma development in renal transplant recipients is independent of TMC/EVER alterations. Dermatology 2015, 231, 245-252.
17. Chung Y.T., Hsieh L.L., Chen I.H., Liao C.T., Liou S.H., Chi C.W.: Sulfotransferase 1A1 haplotypes associated with oral squamous cell carcinoma susceptibility in male Taiwanese. Carcinogenesis 2009, 30, 286-294.
18. Galbiatti A.L., Ruiz M.T., Rodrigues J.O., Raposo L.S., Maniglia J.V., Pavarino E.C.: Polymorphisms and haplotypes in methylenetetrahydrofolate reductase gene and head and neck squamous cell carcinoma risk. Mol Biol Rep 2012, 39, 635-643.
19. Michiels S., Danoy P., Dessen P., Bera A., Boulet T., Bouchardy C.: Polymorphism discovery in 62 DNA repair genes and haplotype associations with risks for lung and head and neck cancers. Carcinogenesis 2007, 28, 1731-1739.
20. Sun W., Lv W., Lv H., Zhang R., Jiang Y.: Genome-wide haplotype association analysis identifies SERPINB9, SERPINE2, GAK, and HSP90B1 as novel risk genes for oral squamous cell carcinoma. Tumour Biol 2015, Aug 30 [w druku].
21. Binstock M., Hafeez F., Metchnikoff C., Arron S.T.: Single-nucleotide polymorphisms in pigment genes and nonmelanoma skin cancer predisposition: a systematic review. Br J Dermatol 2014, 171, 713-721.
22. Welsh M.M., Karagas M.R., Kuriger J.K., Houseman A., Spencer S.K., Perry A.E.: Genetic determinants of UV-susceptibility in non-melanoma skin cancer. PLoS One 2011, 6, e20019.
23. Miller K.L., Karagas M.R., Kraft P., Hunter D.J., Catalano P.J., Byler S.H.: XPA, haplotypes, and risk of basal and squamous cell carcinoma. Carcinogenesis 2006, 27, 1670-1675.
24. Farzan S.F., Karagas M.R., Christensen B.C., Li Z., Kuriger J.K., Nelson H.H.: RNASEL and MIR146A SNP-SNP interaction as a susceptibility factor for non-melanoma skin cancer. PLoS One 2014, 9, e93602.

Otrzymano: 15 I 2016 r.
Zaakceptowano: 7 III 2016 r.