miRNA – rola i znaczenie w alergii pokarmowej

WPROWADZENIE

Alergia pokarmowa jest niepożądaną reakcją organizmu mediowaną przez spożywane produkty [1]. Alergeny pokarmowe to przede wszystkim cząsteczki białkowe, na które najbardziej narażony jest przewód pokarmowy [2]. Ekspozycja nawet na bardzo małą ilość alergenu może wywołać objawy dotyczące każdego odcinka przewodu pokarmowego, takie jak nudności, biegunka, ból brzucha, wymioty, dysfagia czy hematochezja [3]. Objawy te mogą stanowić jedyną manifestację alergii pokarmowej, ale także towarzyszyć reakcji anafilaktycznej, wyprzedzając wstrząs. Częstość występowania alergii pokarmowej różni się w poszczególnych populacjach świata i w pewnym stopniu zależy od nawyków żywieniowych, a także wieku. Najbardziej powszechnymi produktami wywołującymi alergie w wieku dziecięcym są: mleko krowie, jaja, soja, pszenica, orzeszki ziemne, orzechy oraz gluten [4]. U dzieci częstość występowania wynosi 5–10% w krajach zachodnich i 7% w Chinach [5], natomiast u osób dorosłych 4% w krajach rozwijających się [1]. Głównymi produktami, po których obserwuje się reakcje alergiczne u dorosłych, są owoce morza, ryby i surowe pokarmy roślinne [4]. W ciągu ostatnich dwóch dekad częstość występowania alergii pokarmowej na orzechy ziemne u dzieci znacznie wzrosła – z 1% do 4% w krajach zachodnich, między innymi w USA, Wielkiej Brytanii i Kanadzie, prawdopodobnie ze względu na popularność masła orzechowego [1]. Postępowanie diagnostyczne w przypadku podejrzenia alergii pokarmowej obejmuje przeprowadzenie wywiadu z pacjentem, badanie przedmiotowe, wykonanie testów skórnych, a także badań laboratoryjnych [2]. Złotym standardem w potwierdzeniu lub wykluczeniu alergii pokarmowej jest podwójnie ślepa próba kontrolowana placebo, która ze względów bezpieczeństwa powinna być przeprowadzana pod ścisłym nadzorem lekarza [4]. Pacjenci z podejrzeniem alergii pokarmowej prowadzą dziennik, w którym zapisują skrupulatnie, jaką żywność spożywali. Stosowane są też diety eliminacyjne, które polegają na całkowitym zaprzestaniu spożywania pokarmów potencjalnie odpowiedzialnych za wystąpienie reakcji alergicznej [1] (ryc. 1).
Niepożądane reakcje na pokarm to określenie stosowane do opisywania różnych reakcji na spożywane produkty. Należą do nich reakcje immunologiczne, czyli IgE-zależne oraz IgE-niezależne, a także reakcje nieimmunologiczne, do których zalicza się nietolerancję pokarmową związaną na przykład z niedoborem enzymu laktazy u osób z nietolerancją laktozy, a także awersję pokarmową i zatrucie pokarmowe [6]. Nietolerancja pokarmowa jest zwykle reakcją powtarzalną, która pojawia się po spożyciu określonego pokarmu bądź jego składnika, niezależnie od tego, czy dana osoba jest świadoma jego spożycia [4]. Awersja pokarmowa to niechęć do spożywania pewnych produktów, a w konsekwencji ich unikanie. Mogą jej towarzyszyć takie objawy, jak wymioty i nudności, więc często jest mylona z alergią pokarmową [7]. Zatrucie pokarmowe najczęściej jest wywoływane przez bakterie, wirusy, pleśń, toksyny i inne substancje drażniące, które są obecne w spożywanych pokarmach [7]. W prawidłowych warunkach układ immunologiczny wykrywa i eliminuje obce antygeny, natomiast gdy dochodzi do nadmiernego i niewłaściwego reagowania na patogeny, alergeny pokarmowe i toksyny, prowadzi to do chorób alergicznych lub autoimmunologicznych.

REAKCJA ALERGICZNA ZALEŻNA OD PRZECIWCIAŁ IGE

Alergia pokarmowa zależna od przeciwciał IgE dotyczy głównie osób dorosłych w wieku 20–50 lat [1]. Ten rodzaj alergii pokarmowej jest bardzo niebezpieczny, ponieważ niesie ryzyko wystąpienia uogólnionej reakcji anafilaktycznej zagrażającej wystąpieniem wstrząsu. Cechą reakcji zależnych od IgE jest krótki czas od zadziałania czynnika sprawczego – od kilku minut do 2 godzin [1]. Wśród tego typu reakcji wyróżnia się także zespół alergii jamy ustnej (oral allergy syndrome – OAS), który charakteryzuje się świądem, obrzękiem lub pieczeniem w jamie ustnej [10]. Zespół dotyczy osób, u których występują także cechy alergii wziewnej. Może do niego dochodzić w wyniku reakcji krzyżowej alergenu wziewnego z pokarmowym [2]. Patomechanizm reakcji polega na wytworzeniu swoistych przeciwciał IgE skierowanych przeciwko alergenom pokarmowym i powstaniu komórek pamięci immunologicznej. Po ponownym kontakcie z alergenem następuje aktywacja reakcji, które prowadzą do degranulacji komórek efektorowych, takich jak mastocyty i bazofile [2]. Alergenowość cząsteczek zależy od liczby epitopów zdolnych do przyłączenia swoistych przeciwciał [8]. Epitop alergenu pokarmowego przyłącza się do cząsteczek IgE za pośrednictwem receptorów FcεRI znajdujących się na powierzchni tych komórek efektorowych [2]. Dalej następuje uwalnianie histaminy, która jest mediatorem zapalnym, oraz zostają uwolnione między innymi prozapalne leukotrieny, czynnik aktywujący płytki krwi (platelet-activating factor – PAF) i cytokiny prozapalne, takie jak interleukina 4 (IL-4), IL-5 oraz IL-13 [9].

REAKCJA ALERGICZNA NIEZALEŻNA OD PRZECIWCIAŁ IGE

Wśród tych reakcji wyróżnia się zapalenie okrężnicy, zapalenie jelita grubego oraz enteropatie wywołane białkiem znajdującym się w pożywieniu [2]. Ten rodzaj alergii dotyczy głównie noworodków i dzieci i zazwyczaj ustępuje po 1–5 lat [2]. Mechanizm alergii pokarmowej niezależnej od przeciwciał IgE nie jest do końca poznany. Są publikacje, w których zakłada się, że w mechanizm tej reakcji są zaangażowane głównie limfocyty Th2, wydzielające cytokiny prozapalne, które są pobudzane po kontakcie z alergenem pokarmowym [3]. Dochodzi także do zwiększonej ekspresji czynnika martwicy nowotworów α (TNF-α) oraz zmniejszonej ekspresji receptorów TNF-β w błonie śluzowej jelit [3]. Zauważono wzrost ekspresji cytokiny prozapalnej IL-13 [4]. Prawdopodobnie cząsteczki te są zaangażowane w niszczenie jelitowych komórek nabłonka i powstawanie nacieku eozynofilów. Brak swoistych przeciwciał w surowicy w przebiegu alergii pokarmowej IgE-niezależnej powoduje, że trudno jest ją zidentyfikować.

MICRORNA

microRNA (miRNA) to grupa jednoniciowych cząsteczek o długości 19–25 nukleotydów, które pośredniczą w regulacji posttranskrypcyjnej wielu genów [10, 11]. Cząsteczkom tym przypisuje się udział w regulacji wielu procesów, m.in. różnicowania, proliferacji, angiogenezy, onkogenezy, a także w odpowiedzi immunologicznej [12]. Pojedyncze cząsteczki miRNA mogą kontrolować ekspresję wielu różnych genów [13]. miRNA może spełniać funkcję regulacyjną także poprzez wprowadzanie zmian epigenetycznych w docelowych genach, takich jak metylacja DNA, acetylacja histonów, a także przebudowa chromatyny zależna od ATP [11]. Większość miRNA znajduje się wewnątrz komórek, a także jest obecne w surowicy, moczu i ślinie [14]. Zewnątrzkomórkowe miRNA są chronione przed RNAzami poprzez tworzenie eksosomów bądź kompleksów białkowo-lipidowych [15]. W surowicy miRNA tworzy kompleks z białkami Agronaute 2 (AGO2), co też zabezpiecza je przed degradacją [11]. W licznych publikacjach wykazano zwiększoną bądź zmniejszoną ekspresję miRNA w przebiegu wielu chorób, takich jak nowotwory, choroby układu oddechowego i choroby alergiczne. Szacuje się, że miRNA mają pod kontrolą ok. 60% genów kodujących białka u ludzi, co stanowi obiecujący cel terapeutyczny i interesujący przedmiot dalszych badań [7] (ryc. 2).
Na powstanie dojrzałego miRNA składa się kilka procesów. W pierwszym etapie w wyniku transkrypcji powstaje pierwotny transkrypt pri-miRNA (primary miRNA) przy udziale enzymu polimerazy RNA II [16, 17]. Następnie pri-miRNA są przekształcane w prekursory miRNA (pre-miRNA) o długości ok. 60 nukleotydów, które kształtem przypominają szpilkę do włosów [15]. Drugi etap powstawania miRNA jest przeprowadzany przy udziale kompleksu Drosha-DGCR8. W kompleksie tym DGCR8 odgrywa swoją rolę poprzez przyłączenie się do jednoniciowych końców pri-miRNA i aktywowanie domeny rybonukleazy, co powoduje powstawanie transkryptów pre-miRNA [12]. Powyższe etapy odbywają się w jądrze komórkowym, natomiast etap powstawania dojrzałych dwuniciowych miRNA przy udziale kompleksu Dicer zachodzi w cytoplazmie [17]. Transkrypty do cytoplazmy są przenoszone przy udziale białka eksportyny 5 (Exp-5) [17]. Powstają kompleksy miRNA-miRNA [12]. Jedna z nici jest nazywana wiodącą, natomiast druga pasażerską [12]. Aktywna postać miRNA powstaje po połączeniu się z kompleksem białkowym, tworząc kompleks miRISC (microRNA induced silencing complex) [15]. W wielu publikacjach stwierdzono, że miR hamuje ekspresję genów poprzez przyłączenie się do 3’ końca regionu nieulegającego translacji w docelowym mRNA (3’-UTR) na zasadzie komplementarności zasad [11]. Gdy komplementarność zasad jest całkowita, wyciszanie ekspresji genu odbywa się poprzez degradację docelowego mRNA, natomiast gdy jest niecałkowita, wyciszanie odbywa się poprzez hamowanie translacji [11].

ZEWNĄTRZKOMÓRKOWE MIRNA JAKO BIOMARKER CHORÓB ALERGICZNYCH

Dotychczasowe badania sugerują, że miRNA może odgrywać kluczową rolę w patogenezie chorób alergicznych. Ekspresja poszczególnych typów miRNA różni się zarówno pomiędzy typami komórek, jak i w przebiegu poszczególnych chorób alergicznych. miRNA są wykrywalne w surowicy, ślinie i moczu. Klaster miRNA-17-92 zawiera 6 typów miRNA: miRNA-17, miRNA-18a, miRNA-19a, miRNA-20a, miRNA-19b-1, miRNA-92a [18]. W badaniu na myszach z alergią pokarmową wykazano znacznie wyższy poziom miRNA-19a niż u myszy kontrolnych, natomiast poziomy pozostałych pięciu typów miRNA klastra miRNA-17-92 się nie różniły [18]. W innym badaniu na myszach z zespołem alergii ustno-jelitowej (oral-intestinal allergy syndrome – OIAS) stwierdzono, że ekspresja miRNA-98 była znacznie wyższa niż u myszy kontrolnych [19]. miRNA może więc być potencjalnym biomarkerem chorób alergicznych ze względu na specyficzną dysregulację ekspresji w stosunku do danej choroby, jak również dużą stabilność poprzez tworzenie m.in. form eksosomów.

MIRNA W ALERGII POKARMOWEJ

Na podstawie doświadczenia na myszach C57BL/6 wykazano, że klaster miRNA-17-92 oraz miRNA-98 odgrywają znaczącą rolę w patogenezie alergii pokarmowej [18]. W badaniu tym oceniano rolę miRNA-19a w hamowaniu ekspresji IL-10 przez limfocyty B pod wpływem działania IL-4, która jest cytokiną prozapalną. Interleukina 10 jest cytokiną przeciwzapalną produkowaną w organizmie człowieka głównie przez pobudzone limfocyty T, przede wszystkim Th2 oraz Treg, także przez limfocyty B, monocyty i komórki tuczne. Główną rolą IL-10 jest hamowanie odpowiedzi immunologicznej. Cytokina ta uczestniczy także w regulacji stanu zapalnego poprzez hamowanie ekspresji limfocytów Th1 produkujących IL-2, interferon g (IFN-g), hamuje uwalnianie cytokin prozapalnych przez makrofagi, takie jak IL-6, IL-8, IL-12, GM-CSF, TNF-a. W przebiegu wielu chorób alergicznych stwierdzono niedobór IL-10. W doświadczeniu u myszy wystąpiła alergia pokarmowa po dożołądkowym podawaniu roztworu zawierającego albuminy jaja kurzego w dawce 1 mg, a także toksyny cholery w dawce 20 g w 0,3 ml soli fizjologicznej przez 4 tygodnie. W celu pomiaru stężenia IL-4 i przeciwciał IgE w surowicy pobrano próbki krwi od uśmierconych myszy. Wyizolowano surowicę przez odwirowanie i analizowano za pomocą immunoenzymatycznego testu ELISA. W wyciętych fragmentach jelita czczego analizowano naciek eozynofilów i obecność komórek tucznych w błonie śluzowej, a także poddano je ocenie pod kątem obecności specyficznych alergenowo limfocytów T CD4+. W tym celu komórki LPMC (the lamina propria mononuclear cells) oraz komórki dendrytyczne zostały wyizolowane poprzez magnetyczne sortowanie komórek MACS (magnetic cell storting), a następnie analizowano je przy użyciu cytometrii przepływowej. Izolowano również limfocyty B CD19+ przy użyciu MACS, które później zostały poddane analizie z wykorzystaniem RT-qPCR (real time quantitative polymerase chain reaction) w celu wyizolowania całkowitego RNA, w tym miRNA. W doświadczeniu tym wykonano również test immunoprecypitacji chromatyny ChIP (chromatin immunoprecipitation assay). Limfocyty B inkubowano przez 15 minut z formaldehydem w celu uwolnienia DNA z chromatyny. Lizat komórkowy został oczyszczony z G-agarozy za pomocą inkubacji ze specyficznymi przeciwciałami lub izotopem przeciwciał IgG jako próba kontrolna. Oczyszczone DNA poddano analizie za pomocą qPCR. W eksperymencie tym zastosowanie western blottingu miało na celu ukazanie na sfotografowanych wynikach poziomu IL-10 po stymulacji solą fizjologiczną, lipopolisacharydem, IL-4 w limfocytach B. Wykazano, że u myszy z alergią pokarmową poziom miRNA-19a był istotnie wyższy niż u myszy kontrolnych, natomiast poziom IL-10 istotnie niższy. Stwierdzono także, że obecność IL-4 w hodowli komórkowej znacząco zwiększa ekspresję miRNA-19a. Zbadano też, czy niedobór miRNA-19a wpływa na hamowanie wydzielania IL-10 przy jednoczesnym poddaniu komórek działaniu IL-4. Wykazano, że leczenie LPS zwiększa ekspresję IL-10 u myszy dzikich i z niedoborem miRNA-19a, natomiast leczenie IL-4 spowodowało zahamowanie ekspresji IL-10 u myszy dzikich, ale nie u myszy z niedoborem miRNA-19a. Powyższe badania wskazują, że u myszy z alergią pokarmową ekspresja IL-10 była hamowana przez miRNA-19a w limfocytach B, a także przez IL-4, co sugeruje istotną rolę miRNA-19a w patogenezie chorób alergicznych.
W kolejnej publikacji autorzy sprawdzali, czy klaster miRNA-17-92 hamuje ekspresję trombospondyny 1 w jelitowych limfocytach B CD35+ [20]. Trombospondyna 1 (TSP-1) jest białkiem adhezyjnym, które znajduje się w płytkach krwi, jest nazywana także czynnikiem aktywującym płytki krwi. Jako glikoproteina adhezyjna wiąże się z fibrynogenem, fibronektyną, lamininą, kolagenem typu V i integryną αVβI, odgrywając istotną rolę w angiogenezie, procesach nowotworzenia, a także jest zaangażowana w agregację płytek krwi i w proces zapalny. Opublikowane dane wskazują, że TSP-1 odgrywa ważną rolę w regulacji układu odpornościowego. W doświadczeniu tym wykorzystano szczep myszy BALB/c. Myszom podawano dożołądkowo albuminę jaja kurzego i toksynę cholery raz w tygodniu przez 5 kolejnych dni. Dzień po ostatniej prowokacji antygenem myszy zostały uśmiercone, pobrano od nich krew, wyizolowano z niej surowicę, a także pobrano fragmenty jelit w celu oceny ekspresji IL-4, IL-5, IL-13 za pomocą testu ELISA. Z pobranych fragmentów jelit wyizolowano LPMC i za pomocą MACS otrzymano limfocyty B CD35+ oraz CD19+. W doświadczeniu tym oceniano obecność specyficznych alergenowo limfocytów T CD4+ oraz liczbę eozynofilów i komórek tucznych w błonie śluzowej jelit. Za pomocą RT-PCR oceniono ekspresję TSP-1 oraz klastra miRNA-17-92 w limfocytach B. W badaniach wykazano podwyższony poziom swoistych przeciwciał IgE w surowicy, a także zwiększone stężenie cytokin charakterystycznych dla limfocytów Th2, naciek eozynofilów oraz komórek tucznych w błonie śluzowej jelit. U myszy z alergią pokarmową zauważono zwiększoną ekspresję miRNA-19a w jelitowych limfocytach B CD35+ w porównaniu z myszami kontrolnymi. Ekspresja TSP-1 w limfocytach B pobranych od myszy z alergią pokarmową była znacznie niższa niż u myszy kontrolnych. Dane te wskazują, że w przebiegu chorób alergicznych zwiększa się poziom miRNA-19a w limfocytach B, co wpływa na poziom trombospondyny 1 w tych komórkach. W badaniu sprawdzono także wpływ cytokin wydzielanych przez limfocyty Th2 na regulację ekspresji miRNA-19a w limfocytach B poprzez poddanie ich działaniu IL-4, IL-5 oraz IL-13. Otrzymane wyniki sugerują, że ekspozycja jedynie na IL-4 spowodowała istotnie zwiększoną ekspresję miRNA-19a. Wykazano także zwiększoną ekspresję receptorów dla IL-4 u myszy z alergią pokarmową. Następnie zbadano wpływ IL-4 na ekspresję trombospondyny 1 w jelitowych limfocytach B. W hodowli z LPS odnotowano zwiększoną ekspresję TSP-1. Wyniki wskazują, że zwiększona ekspresja TSP-1 mogłaby zostać zniesiona przez ekspozycję na IL-4. miRNA-19a odgrywa istotną rolę w regulacji ekspresji zaangażowanej w odpowiedź immunologiczną TSP-1 w jelitowych limfocytach B. Podsumowując – u myszy z alergią pokarmową stwierdzono zmniejszoną liczbę limfocytów B CD35+ produkujących IL-10 i TSP-1 oraz nadekspresję miRNA-19a. Zwiększony poziom miRNA-19a w limfocytach B CD35+ może wpływać na zmniejszoną ekspresję trombospondyny 1 oraz IL-10, które odgrywają rolę w hamowaniu alergii pokarmowej.
Inni autorzy badali wpływ galektyny 1 na hamowanie OIAS [19]. Galektyna 1 to wielofunkcyjne białko należące do rodziny lektyn [21]. Charakteryzuje się obecnością domeny rozpoznającej węglowodany, wiążącej B-galaktozydazy [21]. Galektyna 1 odgrywa ważną rolę w adhezji komórkowej, apoptozie, nowotworzeniu, a także w procesach zapalnych i regulacji układu odpornościowego [22–25]. Stwierdzono, że galektyna 1 hamuje odpowiedź immunologiczną poprzez promowanie wydzielania limfopoetyny zrębu grasicy (thymic stroma lymphopoietin – TSLP), naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), IL-10, IL-25, a także transformującego czynnika wzrostu β1 (TGF-β1) przez komórki nabłonka jelitowego. Zespół alergii ustno-jelitowej jest powszechny i charakteryzuje się świądem oraz obrzękiem ust, podniebienia i języka, zwykle po spożyciu niektórych pokarmów. W niektórych przypadkach obrzęk gardła może spowodować trudności w oddychaniu, a nawet prowadzić do uduszenia się. Należy on do alergii pokarmowych zależnych od IgE i może stanowić wynik reakcji krzyżowej pomiędzy alergenem wziewnym a pokarmowym. W doświadczeniu wykorzystano szczep myszy BALB/c. Myszy uczulono poprzez podanie w błonę śluzową jamy ustnej mieszaniny zawierającej ekstrakt z orzechów oraz toksynę, jednocześnie w grupie badanej podawano galektynę 1. W 15. dniu myszom podano dożołądkowo mieszaninę ekstraktu z orzechów w soli fizjologicznej w dawce 5 mg na osobnika. Po 4 godzinach myszy uśmiercono i pobrano od nich krew, błonę śluzową jamy ustnej, a także fragmenty jelit w celu przeprowadzenia dalszych badań. Określano stężenie histaminy i poziom swoistych przeciwciał IgE w surowicy, a także IL-4, wykorzystując test ELISA. Pod mikroskopem oglądano fragmenty jelit i błon śluzowych w celu oceny nacieku eozynofilów i komórek tucznych. Komórki także inkubowano ze znakowanymi fluorochromem przeciwciałami bądź z izotopem przeciwciała IgG. W celu wybarwienia wnętrza komórek inkubowano je z paraformaldehydem i saponiną, a następnie z przeciwciałem znakowanym fluorochromem lub izotopem przeciwciała IgG. Następnie komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Poziomy IL-10 oraz miRNA-98 oceniono z zastosowaniem RT-qPCR. Zbadano także interferencyjny RNA. W tym celu komórki CD14+ wyizolowano z LPMC za pomocą MACS. Komórki CD14+ przetworzono na CD45 shRNA zawierające lentiwirusy i niespecyficzne shRNA zawierające lentiwirusy. Wpływ interferencyjnego RNA zmierzono metodą western blotting. Wykazano, że u myszy z OIAS po podaniu galektyny 1 oraz mieszaniny zawierającej ekstrakt z orzechów ekspresja IL-10 w jelitowych komórkach CD14+ wyniosła 7,13%, w grupie kontrolnej ok. 5,17%, a u myszy z OIAS bez podania galektyny 1 jedynie 1,12%. Dane te świadczą o tym, że galektyna 1 zwiększa ekspresję IL-10 przez jelitowe komórki CD14+. Zbadano także zależność pomiędzy ekspresją miRNA-98 i IL-10 w jelitowych limfocytach B CD14+. Poziom miRNA-98 był istotnie większy u myszy z alergią niż w grupie kontrolnej. W grupie myszy, którym podawano galektynę-1 oraz ekstrakt z orzechów bądź samą galektynę 1, nie stwierdzono zwiększonej ekspresji miRNA-98 w limfocytach B CD14+, natomiast poziom IL-10 był znacznie niższy u myszy uczulonych. Dane te wskazują, że miRNA-98 hamuje ekspresję IL-10. Oceniano także wpływ IL-4 na ekspresję miRNA-98 w limfocytach B CD14+. Wraz ze wzrostem stężenia IL-4 zwiększała się ekspresja miRNA-98. W kolejnym kroku przeprowadzono analizę dotyczącą zależności pomiędzy działaniem galektyny 1 a hamowaniem ekspresji miRNA-98 w limfocytach B CD14+. Potwierdzono, że galektyna 1 zmniejsza poziom miRNA-98. W dalszej analizie wykazano, że wraz ze wzrostem stężenia galektyny 1 zwiększała się ekspresja IL-10. Przeprowadzono także analizę dotyczącą oddziaływania galektyny 1 na ekspresję miRNA-98 oraz IL-10 poprzez CD45. CD45 jest receptorem dla galektyny 1. Dlatego też limfocyty B CD14+ zostały przetworzone na komórki CD14+ z deficytem receptorów CD45. Wykazano, że komórki pozbawione receptorów CD45 nie reagowały na działanie galektyny 1. Galektyna 1 pośredniczy w regulacji ekspresji miRNA-98 oraz IL-10 w limfocytach B CD14+ poprzez łączenie się ze swoistym receptorem CD45. Podsumowując – u myszy z OIAS poziom IL-10 jest znacznie niższy niż u myszy w grupie kontrolnej. Ponadto u myszy poddanych sensytyzacji zwiększa się ekspresja miRNA-98, co sugeruje, że w przebiegu alergii pokarmowej dochodzi do nadekspresji miRNA-98, które może hamować ekspresję IL-10. Wykazano również, że galektyna 1 hamuje ekspresję miRNA-98, co powoduje zahamowanie OIAS u myszy.
W innym badaniu oceniano wpływ temperatury stosowanej w procesie przetwarzania na występowanie miRNA w próbkach mleka. W tym celu zebrano próbki mleka z trzech różnych gospodarstw i przechowywano je w temperaturze 1°C do czasu przetwarzania w celu zminimalizowania wzrostu liczby bakterii. Próbki mleka z każdego gospodarstwa poddano procesom przetwarzania, które różniły się zastosowaną temperaturą, ciśnieniem oraz czasem trwania. Jedną próbkę mleka przetwarzano przy bardzo wysokiej temperaturze, kolejną próbkę poddano separacji, czyli oddzieleniu frakcji tłustej, a także homogenizacji, gotowaniu i pasteryzacji. Próbki natychmiast po tym zamrożono w temperaturze –20°C. Zamrożono także próbkę mleka surowego, które nie zostało poddane żadnemu procesowi. W doświadczeniu tym wyizolowano całkowite RNA z próbek mleka pochodzących z trzech różnych gospodarstw. Czystość RNA mierzono spektrofotometrycznie. Wykonano także łańcuchową reakcję polimeryzacji (PCR) i otrzymane produkty poddano elektroforezie w żelu agarozowym w celu rozdziału produktów pod względem ich rozmiarów. Wyniki wskazują, że zastosowanie wyższych temperatur w przetwórstwie mleka wpływa na zmniejszenie liczby miRNA. Długość miRNA we wszystkich próbkach mleka, z wyjątkiem próbki, która została poddana obróbce wysoką temperaturą, wyniosła ok. 22 nukleotydy, czyli jest to prawidłowa długość miRNA. Próbka mleka, która została przetworzona w wysokiej temperaturze, zawierała krótsze odcinki miRNA. Wśród odczytów najczęstszą sekwencję (36%) stanowiło miRNA-148a. W badaniu wykryto różnicę w ekspresji 52 typów miRNA pomiędzy mlekiem pasteryzowanym a mlekiem poddanym działaniu wysokiej temperatury, a także różnicę w ekspresji 25 różnych miRNA pomiędzy mlekiem pasteryzowanym a surowym. Wyniki wykazały, że w mleku pasteryzowanym poziom miRNA był wyższy niż w pełnym mleku surowym. Ponadto oddzielenie frakcji tłuszczu w jednej z próbek mleka spowodowało, że poziom miRNA był wyższy niż w mleku pełnym. Dane wskazują, przetwarzanie mleka w niższych temperaturach, czyli w procesie pasteryzacji lub także homogenizacji, powoduje, że eksosomy, które chronią miRNA przed degradacją, są dalej nienaruszone. W publikacji wskazuje się na ochronny wpływ cząsteczek miRNA zawartych w mleku w przebiegu chorób alergicznych.

PODSUMOWANIE

Powyższe dane wskazują, że w przebiegu alergii pokarmowej występuje zmniejszona ekspresja IL-10, a także nadekspresja mediatorów zapalnych, takich jak IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-13 oraz IFN-, TNF-. Ponadto wykazano istotną rolę w patogenezie alergii pokarmowej cząsteczek miRNA, takich jak miRNA-19a oraz miRNA-98, których nadekspresja hamowała wydzielanie IL-10. Zmniejszona ekspresja trombospondyny 1, która odgrywa rolę w alergii pokarmowej poprzez regulację układu odpornościowego, jest spowodowana zwiększonym poziomem miRNA-19a w limfocytach B. Cząsteczka galektyny 1 hamuje OIAS, co może być przedmiotem przyszłych badań nad lekiem dla pacjentów z alergią pokarmową. miRNA-19a oraz miRNA-98 stanowią interesujący cel dalszych badań ze względu na zwiększoną ekspresję tych cząsteczek w patogenezie alergii pokarmowej. Badania pozwalające na wykrycie tych typów miRNA w surowicy osób z alergią pokarmową mogą ułatwić diagnostykę tej choroby. Cząsteczki miRNA mogą także chronić przed występowaniem alergii. miRNA zawarte w mleku, zwłaszcza miRNA-148a, ulega degradacji podczas jego przetwarzania wysokich temperaturach. Niższe temperatury stosowane w procesach przetwarzania mleka chronią miRNA przed degradacją. U osób spożywających mleko surowe zaobserwowano złagodzenie objawów astmy, co powoduje, że miRNA zawarte w mleku może wpływać na występowanie alergii.

KONFLIKT INTERESÓW

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

PIŚMIENNICTWO

1. Nowak-Wegrzyn A, Szajewska H, Lack G. Food allergy and the gut. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2017; 14: 241-57.
2. Yu W, Freeland DMH, Nadeau KC. Food allergy: immune mechanisms, diagnosis and immunotherapy. Nat Rev Immunol 2016; 16: 751-65.
3. Ebisawa M, Ito K, Fujisawa T. Japanese guidelines for food allergy 2017. Allergol Int 2017; 66: 248-64.
4. Robinson F. FLAIR-FLOW 4: synthesis report on food allergy for health professionals. Nutr Bull 2002; 27: 85-92.
5. Tang MLK, Mullins R J. Food allergy: is prevalence increasing? Intern Med J 2017; 47: 256-61.
6. Turnbull JL, Adams HN, Gorard DA. Review article: the diagnosis and management of food allergy and food intolerances. Aliment Pharmacol Ther 2015; 41: 3-25.
7. Gawęcki J. Apetyt. Żywienie człowieka. Podstawy nauki o żywieniu. Warszawa 2010; 6.2: 82-7.
8. Fal AM. Alergia, choroby alergiczne, astma. Tom II. Wydawnictwo Medycyna Praktyczna, Kraków 2011.
9. Santos AF, Brough HA. Making the most of in vitro tests to diagnose food allergy. J Allergy Clin Immunol Practice 2017; 5: 237-48.
10. Moriyama T. Diversity of food allergy. J Nutr Sci Vitaminol 2015; 61 Suppl: S106-8.
11. Lu TX, Rothenberg ME. Diagnostic, functional and therapeutic roles of microrna in allergic diseases. J Allergy Clin Immunol 2013; 132: 3-13.
12. Grenda A, Budzyński M, Filip A. Biogenesis of microRNAs and their role in the development and course of selected hematologic disorders. Postepy Hig Med Dosw (online) 2013; 67: 174-85.
13. Philip A, Ferro VA, Tate RJ. Determination of the potential bioavailability of plant microRNAs using a simulated human digestion process. Mol Nutr Food Res 2015; 59: 1962-72.
14. Rebane A. microRNA and allergy. In: microRNA: Medical Evidence: From Molecular Biology to Clinical Practice. Santulli G (eds). Springer International Publishing. Cham 2015; 331-52.
15. Pua HH, Ansel KM. MicroRNA regulation of allergic inflammation and asthma. Curr Opin Immunol 2015; 36: 101-8.
16. Alsaweed M, Hartmann PE, Geddes DT, Kakulas F. MicroRNAs in breastmilk and the lactating breast: potential immunoprotectors and developmental regulators for the infant and the mother. Int J Environm Res Public Health 2015; 12: 13981-4020.
17. Noronha Fernandes-Brum C, Marinho Rezende P, Cherubino Ribeiro TH, et al. A genome-wide analysis of the RNA-guided silencing pathway in coffee reveals insights into its regulatory mechanisms. PLoS One 2017; 12: e0176333.
18. Liu ZQ, Yang G, Geng XR, et al. Micro RNA-17-92 cluster mediates interleukin-4-suppressed IL-10 expression in B cells. Am J Transl Res 2016; 8: 2317-24.
19. Xie RD, Xu LZ, Yang LT, et al. Galectin-1 inhibits oral-intestinal allergy syndrome. Oncotarget 2017; 8: 13214-22.
20. Yang LT, Li XX, Qiu SQ, et al. Micro RNA-19a suppresses thrombospondin-1 in CD35+ B cells in the intestine of mice with food allergy. Am J Transl Res 2016; 8: 5503-11.
21. Camby I, Le Mercier M, Lefranc F, Kiss R. Galectin-1: a small protein with major functions. Glycobiology 2006; 16: 137R-57R.
22. Yang H, Lan Q, Liu R, et al. Characterization of galectin-1 from Chinese giant salamanders Andrias davidianus and its involvements during immune response. Developm Comp Immunol 2017; 70: 59-68.
23. Happel CS, Stone KD, Freeman AF, et al. Food allergies can persist after myeloablative hematopoietic stem cell transplantation in dedicator of cytokinesis 8-deficient patients. J Allergy Clin Immunol 2016; 137: 1895-8.e5.
24. Crawford G, Enders A, Gileadi U, et al. DOCK8 is critical for the survival and function of NKT cells. Blood 2013; 122: 2052-61.
25. Tangye SG, Pillay B, Randall KL, et al. Dedicator of cytokinesis 8-deficient CD4+ T cells are biased to a Th2 effector fate at the expense of Th1 and Th17 cells. J Allergy Clin Immunol 2017; 139: 933-49.