Stem cells in the treatment of osteoporotic fractures – medical science fiction or a therapy method in the future?

Wstęp

U kobiet proces starzenia jest nieodłącznie związany z menopauzą. Terminem tym określa się ostatnie fizjologiczne krwawienie miesiączkowe, po którym przez okres 12 miesięcy nie występuje i nie stwierdza się przy tym żadnych patologicznych przyczyn takiego stanu organizmu [1]. Ten naturalny etap w życiu każdej kobiety, występujący niezależnie od liczby przebytych porodów czy warunków socjoekonomicznych [2], jest konsekwencją zaniku aktywności pęcherzyków jajnikowych, w związku z czym zmniejsza się biosynteza estrogenów. Stopień zmniejszenia stężenia estrogenów decyduje o rozwoju objawów klimakterycznych, czyli indywidualnych i niejednorodnych zespołów objawów zarówno somatycznych, jak i psychosomatycznych mających negatywny wpływ na jakość życia kobiet [3, 4]. Objawy okresu menopauzy dotyczą zwłaszcza zmian w układzie moczowo-płciowym, krążenia, mięśniowym, a także kostnym [4]. Niezwykle istotne jest szybkie diagnozowanie poszczególnych schorzeń oraz ich leczenie.

W niniejszej pracy autorzy przedstawili nowatorskie badania z zastosowaniem komórek macierzystych, które w przyszłości mogą stanowić alternatywę dla stosowanych obecnie metod walki z konsekwencjami osteoporozy, stanowiącej jedną z najczęściej występujących chorób w okresie menopauzy.

Problem osteoporozy u pacjentek w okresie pomenopauzalnym

Amerykański Narodowy Instytut Zdrowia (National Institutes of Health – NIH) definiuje osteoporozę jako chorobę szkieletu, charakteryzującą się upośledzoną wytrzymałością kości, co powoduje zwiększone ryzyko wystąpienia złamania [5], a głównymi jej cechami jest zmniejszenie masy kostnej w połączeniu z zaburzeniem architektoniki tkanki kostnej.

Około 30. r.ż. osiągana jest szczytowa masa kostna, po czym dochodzi do powolnego zmniejszania gęstości tkanki kostnej (bone mineral density – BMD). Szybkość tej inwolucji po menopauzie szacuje się na 1,2–2% rocznie [6, 7]. Nasilenie utraty masy kostnej rozpoczyna się średnio 2–3 lata przed ostatnim krwawieniem miesięcznym. Wtedy też dochodzi do zmniejszenia syntezy estrogenów, co jest uważane za jeden z najważniejszych elementów złożonej patogenezy osteoporozy. Hipoestrogenizm powoduje bowiem wzmożenie destrukcyjnej aktywności osteoklastów oraz hamuje czynność osteoblastów [8].

Schorzenie charakteryzuje się długoletnim przebiegiem bezobjawowym. Pierwszą oznaką jest najczęściej złamanie, określane jako osteoporotyczne lub niskoenergetyczne, powstające w następstwie stosunkowo lekkiego urazu, który u osoby zdrowej nie spowodowałby przerwania ciągłości kości [7]. Ryzyko wystąpienia złamania bliższego odcinka kości udowej, kręgosłupa oraz nadgarstka w związku z obecnością zmian osteoporotycznych u kobiet w wieku menopauzalnym szacuje się na ok. 40% [7, 9]. Ponieważ proces gojenia się kośćca, zwłaszcza u osób starszych, jest złożony i długotrwały, złamania w przebiegu osteoporozy pomenopauzalnej są nie tylko najczęstszą przyczyną niepełnosprawności, ale także w wyniku powikłań mogą doprowadzić do śmierci pacjentki. Ryzyko zgonu w ciągu pierwszego roku po złamaniu w obrębie stawu biodrowego jest nawet o 25% większe niż w populacji ogólnej [6]. Pomimo postępu w zakresie ortopedycznych metod zaopatrywania złamań, często dochodzi także do przemieszczenia w kruchej strukturze osteoporotycznej kości stabilizatorów w postaci wkrętów lub gwoździ. Metalowa głowa endoprotezy w leczeniu złamań szyjki kości udowej może także z czasem zagłębiać się w strukturę panewki stawowej, powodując bolesność biodra, a w dalszej perspektywie – konieczność reoperacji [10]. Zatem, pomimo coraz doskonalszych metod leczenia operacyjnego, złamania w przebiegu osteoporozy pozostają poważnym problemem medycznym, socjalnym, a także ekonomicznym. Przewiduje się, że z powodu zwiększenia przeciętnej długości życia i postępującego starzenia się społeczeństw – zwłaszcza krajów wysoko rozwiniętych – odsetek osób dotkniętych osteoporozą i jej konsekwencjami w postaci złamań będzie coraz wyższy. Należy więc poszukiwać nowych, skutecznych i trwałych metod terapii, które spowodują poprawę rokowania i jakości życia.

Komórki macierzyste w leczeniu osteoporozy

Komórki macierzyste (stem cells – SCs) ze względu na ich zdolność do samoodnowy oraz ogromny potencjał proliferacyjny, który umożliwia im różnicowanie się w wyspecjalizowane komórki różnych tkanek i narządów, stały się przedmiotem badań licznych grup naukowców na całym świecie [11], niosąc nadzieję na poprawę rokowania i optymalizację metod terapii wielu jednostek chorobowych, w tym schorzeń dotyczących układu kostnego.

Ponieważ rozwój osteoporozy jest związany z defektem samoodnawiania się progenitorów mezenchymalnych, bezpośrednie podanie komórek macierzystych do uszkodzonej tkanki może wspomagać procesy naprawcze kości i chrząstki.

Na szczególną uwagę zasługują mezenchymalne komórki macierzyste (mesenchymal stem cells – MSCs). Stanowią one potencjalne źródło komórek progenitorowych osteoblastów, chondroblastów, adipocytów, mięśni szkieletowych i gładkich, a nawet kardiomiocytów [11, 12].

Model zwierzęcy

Terapia komórkowa ma ogromny wpływ na gospodarkę kostną [13, 14]. Przeprowadzono badania eksperymentalne na modelach mysich, które wykazały zależną od wieku inhibicję powstawania osteoklastów i osteoblastów. U starszych myszy stężenie interleukiny 11 (IL-11), która reguluje przemodelowanie kości, było zmniejszone, co skutkuje zwolnieniem procesu różnicowania się osteoblastów. Ponadto zmniejszone było również stężenie

IL-6, która w prawidłowych warunkach produkowana jest przez osteoblasty, a także reguluje powstawanie

osteoklastów. Analogicznie do wyników uzyskanych w innych chorobach, badacze oczekiwali, że transplantacja MSCs pochodzenia szpikowego (bone marrow-derived mesenchymal stem cells – BMSCs) przyczyni się do odtworzenia tkanki kostnej. Dożylne podanie okazało się jednak nieskuteczne. Pozytywne rezultaty przyniósł dopiero allogeniczny przeszczep BMSCs bezpośrednio do jamy szpikowej mysich modeli eksperymentalnych. Dokonano porównania badanych myszy z myszami wzorcowymi odpowiadającymi sobie pod względem wiekowym. Zauważono, że miejscowa transplantacja prowadzi do zwiększenia gęstości kości, zmniejszenia resorpcji kości i częściowej poprawy mechanizmów regulatorowych gospodarki kostnej

[13, 14]. Z uwagi na pozytywne rezultaty uzyskane w modelach doświadczalnych, prowadzone są obecnie badania z wykorzystaniem ludzkich MSCs w celu prowadzenia terapii osób cierpiących na osteoporozę.



Źródła ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Dowiedziono, że ludzkie MSCs pochodzące ze szpiku kostnego lub okostnej są zdolne do tworzenia w warunkach in vivo tkanki osteogennej [11], natomiast MSCs pochodzące z tkanki tłuszczowej (adipose-derived mesenchymal stem cells – ADSCs) okazały się nieco mniej wydajnym źródłem [15]. Starzenie się organizmu wywiera jednak mniejszy wpływ na ADSCs niż na BMSCs. Chen i wsp. [16] porównali czas podwojenia BMSCs i ADSCs w hodowli w zależności od wieku pacjentów, od których pobrano komórki. Czas podwojenia ADSCs zarówno wśród młodszych pacjentów, jak i starszych chorych na osteoporozę wyniósł mniej niż 70 godzin, natomiast w przypadku BMSCs wzrastał wraz z liczbą pasaży. Po stymulacji w kierunku indukcji osteogenezy stopień mineralizacji ADSCs w grupie osób starszych był zbliżony do wyników uzyskanych wśród młodszych pacjentów. Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzenia szpikowego starszych osób cechowała natomiast mniejsza ekspresja genów odpowiedzialnych za osteogenezę. Ekspresja genu p21 i aktywność -galaktozydazy, związanej z procesem starzenia, były mniejsze w ADSCs w porównaniu z BMSCs [16]. Dane te świadczą o większym potencjale proliferacyjnym i różnicującym ADSCs w porównaniu z BMSCs u starszych pacjentów. Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej pacjentów chorych na osteoporozę mogą zatem stać się wkrótce bardzo efektywnym źródłem pozyskiwania osteoblastów w celu leczenia powikłań osteoporozy, a nawet jej profilaktyki. Wyeliminowany zostałby problem ewentualnego odrzucenia przeszczepu allogenicznego, gdyż ADSCs pochodziłyby od pacjenta, który w danym momencie potrzebuje terapii komórkowej.

Uzyskane dotychczas wyniki badań pozwalają stwierdzić, że MSCs krwi pępowinowej również mogą mieć zastosowanie w terapii wielu chorób dotyczących układu kostnego, m.in. osteoporozy czy wrodzonej łamliwości kości (osteogenesis imperfecta). W praktyce klinicznej są podejmowane próby wykorzystywania MSCs w leczeniu wrodzonej łamliwości kości oraz skomplikowanych urazów, polegające na autologicznym przeszczepianiu MSCs, które przyspieszają odtwarzanie tkanki kostnej lub chrzęstnej [17, 18]. Przeszczepiano już BMSCs od rodzeństwa u dzieci z wrodzoną łamliwością kości. Poprawa wskaźników klinicznych pozwala sugerować, że pochodzące ze szpiku kostnego MSCs czynnie uczestniczą w naprawie tkanki kostnej i chrzęstnej [19, 20].

Hodowla i różnicowanie

mezenchymalnych komórek macierzystych w kierunku osteoblastów

Prowadzenie hodowli MSCs w warunkach in vitro w celu późniejszego podania progenitorów osteogennych do miejsce złamania wymaga obecności szeregu swoistych czynników wzrostu lub związków chemicznych o właściwościach różnicujących [12]. Rycina 1. przedstawia substancje, które należy dodać do pożywki hodowlanej (witamina D3, witamina C, deksametazon, BMP-2, -glicerofosforan, kwas walproinowy) w celu uzyskania osteoblastów, oraz specyficzne czynniki transkrypcyjne ulegające ekspresji w toku różnicowania uruchamiane podczas powstawania osteoblastów [21, 22].

Różnicowanie MSCs w kierunku poszczególnych

linii komórkowych jest procesem podlegającym kontroli, m.in. przez białka morfogenetyczne kości (bone morphogenetic proteins – BMPs,): BMP-2 i BMP-7 zostały poddane badaniom klinicznym i uzyskały pozytywną opinię w celu prowadzenia terapii trudnych do leczenia złamań kości [22]; BMP-9 jest jednym z mniej poznanych BMPs, jednak najnowsze doniesienia wskazują na jego rolę w indukcji różnicowania MSCs w kierunku osteoblastów. Ekspresja BMP-9 w MSCs zwiększa ilość markerów osteogenezy i wpływa na formowanie się beleczek kostnych oraz macierzy tkanki kostnej [23]. Ponadto BMP-9 wykazuje działanie synergistyczne w kościotworzeniu z takimi szlakami przekaźnictwa komórkowego, jak: Wnt/-katenina, insulinopodobny czynnik wzrostu (insulin-like

growth factor – IGF) i szlak retinoidowy [23]. Dzięki swojej silnej aktywności różnicującej wkrótce BMP-9 może się stać najważniejszym czynnikiem przyspieszającym namnażanie osteoblastów w osteoporotycznych kościach.

Mezenchymalne komórki macierzyste cechują się dodatkowo ekspresją receptorów estrogenowych  i , a także receptora androgenowego [24]. 17-estradiol, fitoestrogen genisteina, testosteron oraz dihydrotestosteron efektywnie przeciwdziałają adipogenezie w MSCs. Właściwości takie wykazano w MSCs stymulowanych do różnicowania w kierunku adipocytów. W komórkach tych oceniono marker świadczący o adipogenności – receptory aktywowane przez proliferatory peroksysomów gamma

(peroxisome proliferator-activated receptors gamma –

PPAR-) oraz odsetek komórek tłuszczowych. Ponadto, gdy MSCs stymulowano do różnicowania w kierunku osteoblastów, wszystkie wymienione hormony powodowały zwiększenie ekspresji osteokalcyny (markera osteogenezy) i zmniejszały liczbę komórek tłuszczowych w hodowli. Dane te świadczą o korzystnym efekcie, jaki można uzyskać, dodając do MSCs, różnicujących się w kierunku osteoblastów estrogeny, a także łatwiejsze do pozyskania roślinne fitoestrogeny.

Dzięki takiej kombinacji można szybciej uzyskać większą liczbę komórek kościotwórczych, redukując liczbę adipocytów.

Podsumowanie

Częste występowanie złamań osteoporotycznych okresu pomenopauzalnego oraz konsekwencje socjalne i ekonomiczne niepowodzeń w ich leczeniu [25] każą poszukiwać innych niż tylko chirurgiczno-ortopedyczne sposobów naprawy kośćca. Odkrycie potencjału osteo­gennego MSCs i liczne źródła, z których można te komórki pozyskać, niosą nadzieję na poprawę rokowania oraz jakości życia pacjentek. Szczególnie ważna jest obecność receptorów estrogenowych na MSCs, dzięki czemu, poprzez dodanie fitoestrogenów, można zwiększyć efektywność hodowli komórkowych. Możliwość uzyskania MSCs z tkanki tłuszczowej i ich relatywnie wysoki potencjał proliferacyjny, niezależny od wieku pacjenta, pozwala na kliniczne zastosowanie autologicznych MSCs w celu leczenia nawet zaawansowanych zmian osteoporotycznych.

Istnieje wiele doniesień potwierdzających, iż miejscowe podanie MSCs jest efektywną, bezpieczną i trwałą metodą, zapewniającą regenerację i przyspieszającą zrost złamań kości w różnych jednostkach klinicznych. Wydaje się, że mimo wysokich kosztów hodowli komórkowych, w ciągu najbliższych lat problem trudnych do leczenia powikłań osteoporozy może być zredukowany.

Piśmiennictwo

1. Problemy kliniczne okresu okołomenopauzalnego. Wytyczne The North American Menopause Society. Med Prakt 2002; 4: 146-55.

2. Hunter M. Mid-life menopause: psychological and social meanings. Premature menopause. A multidisciplinary approach. Whurr Publishers. London 2000; 37-53.

3. Bodera P, Poznański S, Dobrzański P. Menopauza – fizjologiczny okres

w życiu kobiety. Przew Lek 2005; 5: 74-7.

4. Gajos A. Farmakoterapia a menopauza. Świat Farm 2010; 5: 22-3.

5. Suzin J, Szubert M, Kowalczyk-Amico K. Osteoporoza – częsty problem kobiety po menopauzie. Przegl Menopauz 2009; 6: 320-3.

6. Management of osteoporosis in postmenopausal women: 2010 position statement of The North American Menopause Society. Menopause 2010; 17: 25-54.

7. Tkaczuk-Włach J, Sobstyl M, Jakiel G. Osteoporoza – obraz kliniczny, czynniki ryzyka i diagnostyka. Przegl Menopauz 2010; 2: 113-7.

8. Daniels CE. Estrogen therapy for osteoporosis prevention in post menopausal women. Pharmacy Update – NIH 2001; March/April.

9. Heaney RP, Recker RR, Ryan RA. Urinary calcium in perimenopausal

women: normative values. Osteoporos Int 1999; 9: 13-8.

10. Synder M. Bara T. Znaczenie osteoporozy w praktyce ortopedycznej. Przegl Menopauz 2003; 2: 62-7.

11. Kawiak J. Komórki macierzyste organizmu dorosłego w biologii i medycynie. Postępy Biol Komórki 2009; 36: 99-110.

12. Bajek A, Olkowska J, Drewa T. Mezenchymalne komórki macierzyste

narzędziem terapeutycznym w regeneracji tkanek i narządów. Postępy Hig Med Dośw 2011; 65: 124-132.

13. Ichioka N, Inaba M, Kushida T, et al. Prevention of senile osteoporosis in SAMP6 mice by intrabone marrow injection of allogeneic bone marrow cells. Stem Cells 2002; 20: 542-51.

14. Jethva R, Otsuru S, Dominici M, Horwitz EM. Cell therapy for disorders

of bone. Cytotherapy 2009; 11: 3-17.

15. Hayashi O, Katsube Y, Hirose M, et al. Comparison of osteogenic ability

of rat mesenchymal stem cells from bone marrow, periosteum, and

adipose tissue. Calcif Tissue Int 2008; 82: 238-47.

16. Chen HT, Lee MJ, Chen CH, et al. Proliferation and differentiation potential of human adipose-derived mesenchymal stem cells isolated from elderly patients with osteoporotic fractures. J Cell Mol Med 2011 (Epub ahead of print).

17. Bieback K, Klüter H. Mesenchymal stromal cells from umbilical cord blood. Curr Stem Cell Res Ther 2007; 2: 310-23.

18. Jackson L, Jones DR, Scotting P, Sottile V. Adult mesenchymal stem cells: differentiation potential and therapeutic applications. J Postgrad Med 2007; 53: 121-7.

19. Horwitz EM, Prockop DJ, Gordon PL, et al. Clinical responses to bone marrow transplantation in children with severe osteogenesis imperfecta. Blood 2001; 97: 1227-31.

20. Anselme K, Broux O, Noel B, et al. In vitro control of human bone marrow stromal cells for bone tissue engineering. Tissue Eng 2002; 8: 941-53.

21. D’Ippolito G, Schiller PC, Ricordi C, et al. Age-related osteogenic potential of mesenchymal stromal stem cells from human vertebral bone marrow. J Bone Miner Res 1999; 14: 1115-22.

22. Olkowska-Truchanowicz J. Różnicowanie komórek prekursorowych izolowanych z tkanki tłuszczowej – nowe możliwości dla inżynierii tkankowej i terapii komórkowej. Postępy Biol Komórki 2009; 36: 217-31.

23. Luther G, Wagner ER, Zhu G, et al. BMP-9 induced osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells: molecular mechanism and therapeutic potential. Curr Gene Ther 2011; 11: 229-40.

24. Benvenuti S, Cellai I, Luciani P, et al. Androgens and estrogens prevent rosiglitazone-induced adipogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest 2011 (Epub ahead of print).

25. Cummings SR, Melton LJ. Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures. Lancet 2002; 359: 1761-7.