Stanowisko Zespołu Ekspertów Polskiego Towarzystwa Menopauzy i Andropauzy dotyczące zastosowania preparatów PROMENSIL® i PROMENSIL FORTE® u kobiet w okresie około- i pomenopauzalnym

Po 2002 r. w rezultacie upowszechnienia wyników dużego prospektywnego, badania z randomizacją Women’s Health Initiative (WHI) częstość stosowania menopauzalnej terapii hormonalnej (MTH) drastycznie się zmniejszyła. Wstępne rezultaty WHI podważyły wyniki wcześniej wykonanych badań obserwacyjnych wskazujących na ochronne działanie estrogenów na układ sercowo-naczyniowy, wykazując jednocześnie podwyższone ryzyko epizodów zatorowo-zakrzepowych oraz rozwoju raka piersi u kobiet stosujących estrogeny w połączeniu z progestagenami [1]. Obawa przed stosowaniem MTH została dodatkowo spotęgowana opublikowaniem wyników badania Million Women Study (MWS), które wykazało zwiększone ryzyko rozwoju raka gruczołu piersiowego wśród kobiet stosujących tę terapię [2]. Mimo że wiele spośród wyników badań WHI i MWS nie zostało potwierdzonych w późniejszych analizach o bardziej wiarygodnej metodyce, oba te badania odbiły się szerokim echem w mediach, co spowodowało znaczny spadek zaufania do MTH zarówno ze strony pacjentek, jak i lekarzy. Po opublikowaniu wyników badania WHI w 2002 r. w Stanach Zjednoczonych roczna liczba recept na preparaty dla kobiet w wieku menopauzalnym zawierające estrogeny spadła z 91 milionów w 2001 r. do 57 milionów w 2003 r. [3]. Również w Polsce zanotowano w ostatniej dekadzie znaczny spadek liczby pacjentek otrzymujących systemową MTH. Dzieje się tak mimo tego, że 11 lat po publikacji wyników badania WHI dla ogromnej rzeszy kobiet MTH nadal pozostaje najskuteczniejszym i relatywnie bezpiecznym sposobem likwidacji/łagodzenia objawów zależnego od wieku

hipogonadyzmu [4].

Wraz z załamaniem rynku MTH obserwuje się znaczny wzrost zainteresowania rolą fitoestrogenów jako alternatywy dla substytucyjnego leczenia estrogenami kobiet po menopauzie [5]. Fitoestrogeny stanowią liczną grupę polifenolowych, niesteroidowych substancji pochodzenia roślinnego, strukturalnie przypominających 17β-estradiol (E2). Dzięki temu strukturalnemu podobieństwu, substancje te mają zdolność wchodzenia w interakcję z receptorami estrogenowymi (ERa oraz ERβ) i wywierania działania agonistycznego bądź antagonistycznego w stosunku do tych receptorów poprzez receptorozależne szlaki sygnalizacyjne [6, 7]. Większość dostępnych dzisiaj produktów pochodzenia roślinnego zarejestrowanych do łagodzenia objawów menopauzalnych zawiera ekstrakty otrzymywane z soi, koniczyny czerwonej lub pluskwicy groniastej [8]. Skuteczność tych preparatów zależy od zdolności przemiany zawartych w nich izoflawonoidów do ich aktywnego metabolitu – equolu [7-hydroksy-3-(4’-hydroskyfenyl)-chromanu], którego działanie estrogenne jest znacznie silniejsze od jego prekursorów [9]. Profil farmakokinetyczny izoflawonoidów z koniczyny czerwonej (red clover izoflavones – RCI) jest korzystniejszy w porównaniu z izoflawonoidami z ziaren soi, które stężenie maksymalne (Tmax) osiągają po 6 godz., podczas gdy RCI już po 3 godz. 30 min. Ponadto izoflawonoidy sojowe wykazują okres półtrwania 7,5 godz., co oznacza, że muszą być przyjmowane co najmniej 2 razy dziennie. Dla porównania RCI w produkcie Premensil® mają okres półtrwania wynoszący 17 godz. 20 min, co pozwala na stosowanie tego produktu w jednorazowej dawce dobowej [10, 11].

W preparatach sojowych izoflawonoidy występują w formie nieaktywnych glikozydów (połączonych z resztą cukrową). I tak na przykład, w deklarowanej masie 40 mg izoflawonoidów sojowych zawartych jest 60% aktywnych aglikonów i 40% cukrów. Izoflawonoidy sojowe wymagają enzymatycznej hydrolizy w jelicie z udziałem flory jelitowej [7]. Problemem o potencjalnie istotnym znaczeniu klinicznym jest niska biodostępność izoflawonoidów uzyskiwanych z ziaren soi. Wykazano, że średnia różnica pomiędzy deklarowaną a rzeczywistą zawartością izoflawonoidów w preparatach sojowych może wynosić nawet 50% [12].

Literatura przedmiotu z ostatniej dekady zawiera wzrastającą liczbę publikacji dotyczących przydatności izoflawonoidów pochodzących z koniczyny czerwonej w łagodzeniu objawów menopauzalnych [13].

Koniczyna czerwona (Trifolium pratense L.) jest rośliną z rodziny bobowatych. Występuje w całej Europie, w środkowej Azji oraz północnej Afryce. Uprawiana jest także w Australii i obydwu Amerykach. W Polsce jest rośliną występującą powszechnie. W wyselekcjonowanych odmianach koniczyny czerwonej zawartość izoflawonoidów jest znacząco wyższa niż w soi. W postaci aglikonów znaczenie mają przede wszystkim cztery izoflawonoidy obecne w koniczynie czerwonej, wśród których biochanina A jest prekursorem najskuteczniejszej genisteiny, a formononetyna – daidzeiny. Występujące w preparatach z czerwonej koniczny biochanina A i formononetyna nie występują w produktach sojowych [8]. Unikalne działanie obu tych izoflawonidów obejmuje m.in. rozszerzanie tętnic wieńcowych oraz aktywność antyproliferacyjną w obrębie gruczołu piersiowego i prostaty, a także modulowanie aktywności aromatazy i 5-a-reduktazy za pomocą biochaniny A [14–16]. Formononetyna silniej niż daidzeina działa na zwiększenie wytwarzania osteoblastów. Po spożyciu biochanina A ulega demetylacji do genisteiny, a formononetyna demetylowana jest do daidzeiny, które to związki są następnie metabolizowane do equolu.

Izoflawonoidy z czerwonej koniczyny działają jak selektywne aktywatory receptorów estrogenowych: pobudzają aktywność receptorów estrogenowych β bez stymulacji receptora a.

PROMENSIL® i PROMENSIL FORTE® są to środki spożywcze zawierające standaryzowany ekstrakt z czerwonej koniczyny. Promensil® dostępny jest w dwóch formach:

• Promensil® Forte (80 mg bioaktywnych izoflawonoidów),

• Promensil® (40 mg bioaktywnych izoflawonoidów).

Ekstrakt z czerwonej koniczyny zawarty w produkcie Promensil® (MF11RCE) jest standaryzowany na wysoką, wynoszącą 40%, zawartość izoflawonoidów (inne dostępne na rynku preparaty zawierają ekstrakty 8-procentowe).

Na 40 mg bioaktywnych izoflawonoidów zawartych w preparacie Promensil® składają się następujące związki:

• biochanina A (26 mg),

• formononetyna (16 mg),

• genisteina (1 mg),

• daidzeina (0,5 mg).

Zawarte w produkcie Promensil® izoflawonoidy w 99,9% występują w formie aktywnych aglikonów (bez reszty cukrowej). Izoflawonoidy zawarte w tym preparacie charakteryzują się wysoką biodostępnością m.in. w związku z faktem, że nie podlegają wstępnej enzymatycznej hydrolizie w jelicie i dostają się do krwiobiegu po zaledwie 15 min od przyjęcia [17].

Literatura przedmiotu zawiera szereg publikacji dostarczających dowodów o wysokim stopniu wiarygodności (IA – badania z randomizacją kontrolowane za pomocą placebo, przeprowadzone metodą podwójnie ślepej próby, czyli randomised controlled trias – RCT) dotyczących skuteczności preparatu Promensil® w łagodzeniu objawów menopauzalnych, szczególnie o charakterze wazomotorycznym. Wyniki tych badań zestawiono w tabeli I.

Literatura przedmiotu zawiera niejednoznaczne wyniki badań co do skuteczności preparatu Promensil® w łagodzeniu menopauzalnych objawów wazomotorycznych. Cztery spośród 6 opisanych w tabeli I RCT wykazały znamienną redukcję intensywności uderzeń gorąca i nocnych potów po okresie co najmniej 6 tygodni leczenia zarówno dawką 40 mg, jak i 80 mg RCI/dobe. Z kolei w dwóch pozostałych badaniach różnice w nasileniu objawów wazomotorycznych po 3–12 miesiącach przyjmowania RCI były wyraźne, ale okazały się nieistotne statystycznie w odniesieniu do obserwowanych w grupie placebo.

Literatura przedmiotu zawiera dwie metaanalizy wyników prac poświęconych skuteczności izoflawonoidów z koniczyny czerwonej w łagodzeniu objawów menopauzalnych, które zawierają przeciwstawne wnioski. Coon i wsp. [23] stwierdzili znamienny spadek liczby epizodów uderzeń gorąca po zastosowaniu RCI, podczas gdy w analizie zbiorczej Lethaby i wsp. [25] różnica między RCI a placebo nie była znamienna statystycznie. Niespójność wyników badań nad skutecznością RCI zdaje się wynikać z powodów metodologicznych. Wiele z przeprowadzonych na ten temat badań charakteryzowało się zbyt mało liczną populacją badaną. Ponadto w badaniach tych obserwuje się szczególnie zaznaczony efekt placebo (nawet 59% skuteczności), co wynika być może ze specyfiki psychologicznej populacji kobiet zainteresowanych zastosowaniem fitoestrogenów, które charakteryzują się badziej nasilonymi obawami przed stosowaniem hormonów. Ponadto w niewielu badaniach temu tematowi poświęconych oceniano wpływ dawki RCI na skuteczność terapii. Przegląd literatury wskazuje na trend uzależnienia skuteczności od zawartości RCI w preparacie. Preparaty zawierające 80 mg RCI/dobę szybciej prowadzą do poprawy w zakresie objawów wazomotorycznych aniżeli te zawierające o połowę mniejszą dawkę RCI [23].

Należy podkreślić, że w świetle literatury przedmiotu podawanie izoflawonoidów z koniczyny czerwonej łagodzi objawy menopauzalne po dłuższym okresie kuracji (3–6 tygodni) [19] w porównaniu z systemową terapią hormonalną prowadzoną przy użyciu estrogenów.

Istnieją dowody na skuteczność preparatu Promensil® w redukcji nasilenia objawów pozasomatycznych menopauzy [18]. Po 6 miesiącach stosowania tego produktu stwierdzono znamienną poprawę w zakresie nastroju depresyjnego i występowania nerwowości lub niepokoju u kobiet pomenopauzalnych.

Opublikowano również dowody na skuteczność izoflawonoidów z koniczyny czerwonej w zakresie poprawy jakości życia seksualnego. Po 8 tygodniach stosowania preparatu Promensil® zaobserwowano istotną poprawę w zakresie indeksu komórkowej dojrzałości pochwy ze znaczącym wzrostem obecności w rozmazie cytohormonalnym komórek warstwy powierzchniowej [20, 26]. Hidalgo i wsp. [20] stwierdzili ponadto znamienną poprawę po 90 dniach stosowania preparatu Promensil® (80 mg RCI/dobę) w zakresie dolegliwości bólowych podczas stosunku płciowego, czemu towarzyszyła istotna redukcja nasilenia objawu suchości w pochwie. Prawdopodobnie w rezultacie tych korzystnych zmian pacjentki uczestniczące w tym badaniu obserwowały znamienną poprawę w zakresie libido. W jednym z badań stwierdzono brak wpływu RCI na jakość życia seksulanego [22].

Literatura przedmiotu zawiera dowody na skuteczność osteoprotekcyjną izoflawonoidów z czerwonej koniczyny [27, 28]. Atkinson i wsp. [29] zaobserwowali po 12 miesiącach stosowania produktu Promensil® (40 mg RCI/dobę) zmniejszenie utraty składników mineralnych oraz większą gęstość kości w obrębie kręgosłupa lędźwiowego, a także znamienny wzrost markerów kościotworzenia w porównaniu z grupą otrzymującą placebo. Dowodów na skuteczność osteoprotekcyjną RCI dostarczyło również badanie Clifton-Bligh i wsp. [30], którzy stwierdzili znamienny (o 4,1%) wzrost gęstości kości bliższego odcinka przedramienia po 6 miesiącach stosowania izoflawonoidów z koniczyny czerwonej. W tym kontekście warto przytoczyć wyniki badań eksperymentalnych wykonanych na modelach zwierzęcych, które wykazały osteoprotekcyjny wpływ RCI [31, 32].

Od wielu lat toczy się debata na temat potencjału kardioprotekcyjnego fitoestrogenów. Najbardziej zachęcające w tym względzie publikacje dotyczą stosowania izoflawonoidów z koniczyny czerwonej [33–35]. Hidalgo i wsp. [20] zaobserwowali znamienny spadek zawartości trójglicerydów (średnio o 9,3%) po 90 dniach stosowania preparatu Promensil® (80 mg RCI/dobę). W kontekście wpływu suplementacji izoflawonoidami z koniczyny czerwonej na układ sercowo-naczyniowy warto wspomnieć o neutralnym efekcie długotrwałego przyjmowania RCI na wskaźnik masy ciała, a także zawartość tkanki tłuszczowej [29, 36].

Przedmiotem wielu kontrowersji jest profil bezpieczeństwa długotrwałej suplementacji fitoestrogenami, szczególnie pochodzenia sojowego, oraz izoflawonoidami z pluskwicy groniastej (Cimicifuga racemosa). Dostępne wyniki badań dotyczące profilu bezpieczeństwa stosowania izoflawonoidów z koniczyny czerwonej dostarczają zachęcających wniosków. W tabeli II przedstawiono wyniki prac dotyczące wpływu długotrwałego stosowania preparatu Promensil® na gruczoł piersiowy.

Oba badania cytowane w tabeli II wykazały brak wpływu długotrwałego stosowania tego preparatu na gęstość mammograficzną piersi. Szczególne znaczenie kliniczne ma badanie Powlesa i wsp. [37], które wykonano w populacji kobiet o zwiększonym ryzyku raka piersi (obciążenie wywiadu rodzinnego wystąpieniem raka piersi u krewnego pierwszego stopnia). Warto w tym kontekście przytoczyć wyniki badania Ingrama i wsp. [38], które wykazały redukcję częstości występowania cyklicznej mastalgii o 44% już po krótkotrwałym okresie stosowania RCI. Badania in vitro wykazały wpływ produktu Promensil® na hamowanie procesu nowotworzenia w linii komórek nowotworowych sutka w obecności estrogenów, poprzez zmiany w rearanżacji cytoszkieletu i aktywności kinaz MAP [39].

W literaturze przedmiotu znaleźć można trzy prace przedstawiające wyniki badań nad wpływem preparatu Promensil® na endometrium. Wyniki tych badań zestawiono w tabeli III.

Przedstawione w tabeli III badania w sposób pośredni wskazują na brak aktywności proliferacyjnej w odniesieniu do endometrium izoflawonoidów zawartych w preparcie Promensil®. Spostrzeżenie to potwierdza wynik metaanalizy opublikowanej w bazie Cochrane w 2007 r., w myśl której stosowanie RCI przez okres 2 lat nie skutkuje stymulacją estrogenną endometrium [25]. Wyniki te sugerują brak konieczności monitorowania ultrasonograficznego stanu endometrium u pomenopauzalnych pacjentek suplementowanych przy użyciu RCI w zakresie dawek 40–80 mg/dobę.

Należy podkreślić, że jednoznaczne określenie bezpieczeństwa onkologicznego stosowania RCI nie jest obecnie możliwe i wymaga przeprowadzenia długotrwałych badań obserwacyjnych z punktami końcowymi w postaci oceny zapadalności na nowotwory estrogenozależne w populacji kobiet stosujących fitoestrogeny w porównaniu z placebo. Wyniki badań przestawionych w tabelach II i III należy traktować jako dowody pośrednie na bezpieczeństwo onkologiczne RCI.

Przyjmowanie izoflawonoidów z koniczyny czerwonej charakteryzuje się dobrym profilem tolerancji i niewielkim ryzykiem wystąpienia niegroźnych objawów niepożądanych. Najczęstszymi tego typu objawami notowanymi rzadko lub bardzo rzadko podczas przyjmowania preparatu Promensil® są: zgaga, bóle brzucha, nudności lub wzdęcia. Dolegliwości te występują z częstością nieznamiennie większą w porównaniu z podawaniem placebo [36].

Przegląd dostępnej literatury przedmiotu poświęconej skuteczności, bezpieczeństwu i tolerancji stosowania izoflawonoidów z koniczyny czerwonej zawartych w preparatach Promensil® i Promensil Forte® wskazują na konieczność kontynuowania badań szczególnie w zakresie efektywności stosowania RCI w łagodzeniu objawów menopauzalnych. Badania takie jednoznacznie określą miejsce preparatów zawierających izoflawonoidy z koniczyny czerwonej w medycynie menopauzy. W chwili obecnej dostępne są badania o wysokim poziomie wiarygodności wyników wskazujące na skuteczność tych produktów, jakkolwiek są też badania wskazujące na brak skuteczności, szczególnie dawki 40 mg RCI/dobę.

Preparaty Promensil® wyróżniają się spośród bardzo wielu dostępnych na naszym rynku produktów fitoestrogenowych korzystnym poziomem standaryzacji substancji czynnych, dokładnym zdefiniowaniem ich charakteru i dawek oraz wysoką ich biodostępnością. Mają też dobrze udokumentowany korzystny profil bezpieczeństwa i tolerancji długotrwałego ich stosowania. Na podkreślenie zasługuje fakt relatywnie dużej ilości badań na wysokim poziomie wiarygodności dowodów poświęconych zastosowaniu tego produktu u kobiet w okresie menopauzy.

W świetle obecnego stanu wiedzy na temat relacji potencjalnych korzyści do ryzyka stosowania produktu Promensil® wydaje się, iż warto rozważyć jego zastosowanie (szczególnie z dawką 80 mg RCI/dobę) u kobiet, których jakość życia uległa istotnemu pogorszeniu z powodu objawów związanych z menopauzą, a które nie mogą lub nie chcą stosować hormonalnej terapii menopauzalnej opartej na podawaniu systemowym estrogenów i/lub progestagenów.

Piśmiennictwo

1. Rossouw JE, Anderson GL, Prentice RL, et al. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: principal results From the Women’s Health Initiative randomized controlled trial. JAMA 2002; 288: 321-33.

2. Beral V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet 2003; 362: 419-27.

3. Hersch AL, Stefanick ML, Stafford RS. National use of postmenopausal hormone therapy: annual trends and response to recent evidence. JAMA 2004; 291: 47-53.

4. De Villiers TJ, Gass MLS, Haines CJ, et al. Global consensus statement on menopausal hormonal therapy. Climacteric 2013; 16: 203-204.

5. Nachtigall LE, Baber RJ, Barentsen R, et al. Complementary and hormonal therapy for vasomotor symptom relief: a conservative clinical approach. J Obstet Gynaecol Can 2006; 28: 279-89.

6. Kuiper GG, Lemmen JG, Carlsson B, et al. Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor beta. Endocrinology 1998; 139: 4252-63.

7. Miksicek RJ. Interaction of naturally occurring nonsteroidal estrogenes with expressed recombinant human estrogen receptor. J Steroid Biochem Mol Biol 1994; 49: 153-60.

8. Czerpak R, Pietryczuk A, Jabłońska-Trypuć A i wsp. Aktywność biologiczna izoflawonoidów i ich znaczenie terapeutyczne i kosmetyczne. Postępy Fitoterapii 2009; 2: 113-21.

9. Setchell KD, Brown NM, Lydeking-Olsen E. The clinical importance of the metabolite equol – a clue to the effectiveness of soy and its isofalvones. J Nutr 2002; 132: 3577-84.

10. Howes J, Waring M, Huang L, Howes LG. Long-term pharmacokinetics of an extract of isoflavones form red clover (Trifolium pretense). J Alter Compl Med 2002; 8: 135-42.

11. Watanabe S, Yamaguchi M, Sobue T, et al. Pharmacokinetics of soybean isoflavones in plasma, urine and feces of men after ingestion of 60 g baked soybean powder (kinako). J Nutr 1998; 128: 1710-15.

12. Clarke DB, Bailey V, Lloyd AS. Determination of phytoestrogens in dietary supplements by LC-MS/MS. Food Addit Contamin 2008; 25: 534-47.

13. Panay N. Taking an integrated approach: managing women with phytoestrogens. Climacteric 2011; 14 Suppl 2: 8-12.

14. Lee KH, Choi EM. Biochanin A stimulates osteoblastic differentiation and inhibits hydrogen peroxide-induced production of inflammatory mediators in MC3T3-E1 cells. Biol Pharm Bull 2005; 28: 1948-53.

15. Mannella P Tosi V, Russo E, et al. Effects of red clover extracts on breast cancer cell migration and invasion. Gynecol Endocrinol 2012; 28: 29-33.

16. Schrepfer S, Deuse T, Münzel T, et al. The selective estrogen receptor-beta agonist biochanin A shows vasculoprotective effects without uterotrophic activity. Menopause 2006; 13: 489-99.

17. Promensil – a clinical summary. Clinician’s Guide, Novogen 2009.

18. Lipovac M, Chedraui P, Gruenhut C, et al. Improvement of post menopausal depressive and anxiety symptoms after treatment with isoflavones derived from red clover extracts. Maturitas 2010; 65: 258-61.

19. Van de Weijer PH, Barentsen R. Isoflavones from red clover (Promensil) significantly reduce menopausal hot flush symptoms compared to placebo. Maturitas 2002; 42: 187-93.

20. Hidalgo LU, Chedraui PA, Morocho N, et al. The effect of red clover isoflavones on menopausal symptoms, lipids and vaginal cytology in menopausal women: A randomised double blind, placebo controlled study. Gynecol Endocrinol 2005; 21: 257-64.

21. Jeri A. The use of an isoflavone supplement to relieve hot flushes. Female Patient 2002; 27: 35-37.

22. Del Giorno C, Da Fonseca AM, Bagnoli VR, et al. Effects of trifolium pratense on climacteric and sexual symptoms in postmenopausal women. Rev Assoc Med Bras 2010; 56: 558-62.

23. Tice JA, Ettinger B, Ensrud K, et al. Phytoestrogen supplements for the treatment of hot flashes: the Isoflavone Clover Extract (ICE) Study:

a randomized controlled trial. JAMA 2003; 290: 207-14.

24. Coon JT, Pittler MH, Ernst E. Trifolium pretense isoflavones in the treatment of menopausal hot flushes: a systematic review and meta-analysis. Phytomedicine 2007; 14: 153-9.

25. Lethaby AE, Brown J, Marjoribanks J, et al. Phytoestrogens for vasomotor menopausal symptoms. Cochrane Database Syst Rev 2007; 17(4): CD001395.

26. Woods R, Colville N, Blazquez J, et al. Effects of red clover isoflavones (Promensil) versus placebo on uterine endometrium, vaginal maturation index and the uterine artery in healthy postmenopausal women.

J Br Menopause Soc 2003; Suppl S2: 23.

27. Gautam AK, Bhargavan B, Tyagi AM, et al. Differential effects of formononetion and cladrin on osteoblast function, peak bone mass achievement and bioavailability in rats. J Nutr Biochem 2011; 22: 318-27.

28. Occhiuto F, Pasquale RD, Guglielmo G, et al. Effects of phytoestrogenic isoflavones from red clover (Trifolium pratense L.) on experimental osteoporosis. Phytother Res 2007; 21: 130-4.

29. Atkinson C, Compston JE, Day NE, et al. The effects of phytoestrogen isoflavones on bone density in women: a double-blind, randomised placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr 2004; 79: 326-33.

30. Clifton-Bligh PB, Baber RJ, Fulcher GR, et al. The effect of isoflavones extracted from red clover (Rimostil) on lipid and bone metabolism. Menopause 2001; 8: 259-65.

31. Kaczmarczyk-Sedlak I, Wojnar W, Zych M, et al. Effect of formononetin on mechanical properties and chemical composition of bones in rats with ovariectomy-induced osteoporosis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2013; Article ID 457052.

32. Shu-Jem Su, Yao-Tsung Yeh, Huey-Wen Shyu. The preventive effect of biochanin a on bone loss in ovariectomized rats: involvement in regulation of growth and activity of osteoblasts and osteoclasts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2013; Article ID 594857.

33. Chedraui P, San Miguel G, Hidalgo L, et al. Effect of trifolim pretense-derived isoflavones on the lipid profile of postmenopausal women with increased body mass index. Gynecol Endorinol 2008; 24: 620-24.

34. Teede HJ, McGrath BP, DeSilva L, et al. Isoflavones reduce arterial stiffness: a placebo-controlled study in men and postmenopausal women. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; 1: 1066-71.

35. Terzic MM, Dotlic J, Maricic S, et al. Influence of red clover-derived isoflavones on serum lipid profile in postmenopausal women. J Obstet Gynaecol Res 2009; 35: 1091-5.

36. Atkinson C, et al. Red clover-derived isoflavones and mammographic breast density; a double-blind, randomised, placebo-controlled trial. Breast Cancer Res 2004; 6(3): 170-9.

37. Powles T, Howell A, Evans DG, et al. Red clover isoflavones are safe and well tolerated in women with a family history of breast cancer. Menopause Int 2008; 14: 6-12.

38. Ingram D, Hickling C , West L, et al. A double-blind randomized controlled trial of isoflavones in the treatment of cyclical mastalgia. Breast 2002; 11: 170-4.

39. Manella P, Tosi V, Russo E, et al. Effects of red clover extracts on breast cancer cell migration and invasion. Gynecol Endocrinol 2012; 28: 29-33.

40. Imhof M, Gocan A, Reithmayr F, et al. Effects of a red clover extract (MF11RCE) on endometrium and sex hormones in post-menopausal women. Maturitas 2006; 55: 76-81.

41. Baber RJ, Templeman C, Morton T, et al. Randomized placebo-controlled trail of an isoflavone supplement and menopausal symptoms in women. Climacteric 1999; 2: 85-92.