Transcriptional activity and alternative splice mRNA forms of Flt-1, Flk-1 genes in the estimation of risk progression of squamous intraepithelial lesions and cervical cancer

WSTĘP


Sygnał angiogenny naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF) jest przenoszony poprzez 2 wysoce specyficzne receptory śródbłonka naczyniowego Flt-1 (fms-like tyrosine kinase receptor – VEGFR-1) oraz Flk-1/KDR (fetal liver kinase 1/kinase insert domain containing receptor – VEGFR-2), należące do klasy III receptorów, posiadających własną kinazę tyrozynową oraz 7 zewnątrzkomórkowych domen immunoglobulinopodobnych (Ig) [1]. W wiązaniu VEGF do Flt-1 i Flk-1 pośredniczy druga domena Ig [2]. W trakcie badań nad angiogenezą zachodzącą w tkance łożyskowej odkryto i opisano obecność krótszej, rozpuszczalnej formy receptora Flt-1 (sFlt-1), niezwiązanej z błoną komórkową śródbłonka [1].
Chociaż VEGF jest wydzielany przez różne komórki organizmu, to ekspresja Flk-1 i Flt-1 jest ściśle ograniczona do śródbłonka naczyniowego [3]. Nadekspresję tych receptorów obserwowano przede wszystkim w chorobach nowotworowych i procesach patologicznych z towarzyszącym niedotlenieniem tkanek [4], jakkolwiek relatywnie niską ekspresję obserwuje się także w śródbłonku prawidłowych naczyń [1].
Wczesne badania Petersa i wsp. dobrze opisały lokalizację i właściwości receptora Flt-1, potwierdzając jego udział w procesie neowaskularyzacji, gojeniu się ran i wczesnych etapów organogenezy, stwierdzając jego obecność w pęcherzyku żółtkowym embrionów mysich; potwierdzili rolę Flt-1 w procesie wzrostu, różnicowania się śródbłonka i mechanizmach naprawczych naczyń [5]. Istnieje podobieństwo w pozytywnej regulacji ekspresji Flt-1 i VEGF w patologii z towarzyszącym niedotlenieniem tkanek; oba czynniki posiadają w regionie transkrypcyjnym, w pozycji 976 do 937, miejsce wiążące HIF-1, którego nie stwierdzono w genomie Flk-1 [6]. Obserwacja ta sugeruje, że niedotlenienie nie tylko wpływa na ekspresję VEGF, ale także parakrynnie wpływa na indukcję Flt-1 poprzez mechanizm VEGF-zależny [7].
Flk-1/KDR jest głównym regulatorem waskulogenezy w okre-
sie embriogenezy i angiogenezy w stanach patofizjologicznych organizmu dojrzałego [8]. Badania hybrydyzacji in situ mRNA Flk-1 mysich embrionów wykazały obecność tego receptora w komórkach endotelialnych we wszystkich etapach procesu embrio- i organogenezy, poczynając od momentu pojawienia się wysepek krwiotwórczych w pęcherzyku żółtkowym 8,5-dniowego zarodka [8]. Ekspresja receptora towarzyszy proliferacji komórek śródbłonka, tworzeniu się nowych naczyń i całego drzewa naczyniowego oraz drastycznie spada w tkance mózgowej po uzyskaniu jej pełnej dojrzałości [8]. Sygnał mitogenny przenoszony na drodze VEGF-Flk-1 spełnia osiową rolę w angiogenezie nowotworowej, jakkolwiek badania eksperymentalne wskazują zróżnicowane rozmieszczenie tego sygnału w tkance nowotworowej. W badaniach eksperymentalnych centrum zmiany charakteryzowało się mniejszą liczbą naczyń w porównaniu z bogatym unaczynieniem na obwodzie [9].
Rozpuszczalna forma receptora Flt-1 (sFlt-1) została wykryta w medium hodowlanym komórek HUVEC i w surowicy pacjentów chorujących na różne nowotwory; nie wykryto natywnej formy rozpuszczalnego receptora Flk-1 (sFlk-1) [10]. sFlt-1 jest kodowany przez gen Flt-1, pozbawiony jest jedynie szóstej i siódmej domeny immunoglobulinopodobnej, podczas gdy pierwsza, druga i trzecia są niezbędne dla prawidłowego wiązania się VEGF [11]. Ponadto receptor pozbawiony jest domeny śródbłonowej i wewnątrzkomórkowej kinazy tyrozynowej. Ta specyficzna budowa powoduje, że sFlt-1 łącząc się z wybranymi izoformami VEGF zachowuje się jak czynnik antyangiogenny, zmniejszając efekt biologiczny VEGF [10].
Celem pracy było zbadanie aktywności transkrypcyjnej genów receptorów VEGF – VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (Flk-1) oraz występowanie form alternatywnego składania mRNA Flt-1 – sFlt-1 w ocenie progresji zmian śródnabłonkowych i raka szyjki macicy.



MATERIAŁ I METODY

Bezpośrednim materiałem badawczym przeznaczonym do analizy molekularnej było 119 wycinków tkankowych zakwalifikowanych do następujących grup morfologicznych:
I. Grupa kontrolna (K) – 43 wycinki tkankowe pochodzące z prawidłowej szyjki macicy,
II. Grupa LSIL – 38 wycinków,
III. Grupa HSIL – 17 wycinków,
IV. Grupa raka płaskonabłonkowego w stopniu klinicznego zaawansowania IB-IIB (RAK) – 21 wycinków.

Wycinki do badania molekularnego były pobrane w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca bioptatu do badania histopatologicznego, w celu uzyskania jak największej zgodności patologii molekularnej i morfologicznej w badanych grupach. Materiał tkankowy przeznaczony do oceny ekspresji genów, bezpośrednio po pobraniu, zamrażano do -70^oC.


Ekstrakcja RNA

Po wstępnym kruszeniu komórek w ciekłym azocie z homogenatu ekstrahowano DNA i RNA przy zastosowaniu zmodyfikowanej metody wg Chomczyńskiego i Sachi [17], a następnie wyznaczano stężenie kwasu nukleinowego w ekstrakcie techniką spektrofotometryczną z zastosowaniem RNA/DNA kalkulator Gene Quant LKB – Pharmacia Biotech.



Analiza aktywności
transkrypcyjnej genu Flt-1 i Flk-1

Aktywność transkrypcyjną badanych genów wyznaczano na podstawie analizy kinetyki reakcji QRT--PCR, w której matrycą były ekstrakty całkowitego RNA otrzymywane z wycinków tkanek. W pierwszej części badań projektowano reakcję QRT-PCR dla badanych transkryptów i produktów ich modyfikacji potranskrypcyjnej. Sprawdzano empirycznie i optymalizowano zaprojektowane reakcje oraz potwierdzano specyficzność amplimerów techniką elektroforezy w żelu polakrylamidowym barwionym srebrem i metodą sekwencjonowania enzymatycznego. Dla wszystkich zaprojektowanych reakcji QRT-PCR przyjęto identyczne warunki termiczne oraz mieszaninę reakcyjną różniącą się tylko zestawem oligonukleotydów – starterów i sond wyznakowanych fluorochromami FAM i TAMRA. W drugim etapie wyznaczono liczby kopii mRNA badanych traskryptów w 1 μg całkowitego mRNA badanego wycinka.


Projektowanie specyficznych
starterów i sond stosowanych
w reakcji QRT-PCR
dla mRNA Flt-1, Flk-1 i sFlt-1

Sekwencję nukleotydów starterów oraz sond dla reakcji
RT-QPCR zaprojektowano przy użyciu programu komputerowego Primer ExpressTM Version 1.0 ABI PRISM, na podstawie sekwencji badanych genów pochodzących z bazy danych Gen Bank (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/irx/genbank). Korzystając z bazy danych BLAST 2 SEQUENCES RESULTS VERSION BLASTN 2.0.11 porównano kolejność nukleotydów genu VEGF, znalezione pod numerem dostępu – accession – NM_003376 (266), M63978.


Sekwencjonowanie amplimerów

Ostatnim etapem sprawdzenia specyficzności zaprojektowanych reakcji QRT-PCR umożliwiających detekcję produktów modyfikacji potranskrypcyjnej mRNA Flt-1 i Flk-1 było sekwencjonowanie produktów amplifikacji prowadzone metodą Sangera [18]. Amplifikację sekwencyjną prowadzono z zastosowaniem dideoksynukleotydów wyznakowanych odpowiednio: ddATP barwnikiem dichloro[R6G], ddCTP barwnikiem dichloro[ROX], ddGTP barwnikiem dichloro[R110] i ddTTP barwnikiem dichloro[TAMRA] w termocyklerze GeneAmp PCR System 9600 firmy Perkin Elmer. Następnie otrzymane produkty rozdzielono przy użyciu automatycznego analizatora sekwencji ABI PRISMTM 310. i zanalizowano stosując program DNA Sequencing Analysis SoftwareTM Version 3.7. Kolejne etapy sekwencjonowania przeprowadzano zgodnie z zaleceniem protokołu dołączonego do zestawu odczynników sekwencyjnych zalecanych przez firmę Perkin Elmer.


Wyznaczanie liczby kopii mRNA techniką QRT – PCR

Otrzymany w ekstrakcji RNA stanowił matrycę w reakcji Q-RT-PCR prowadzonej jednostopniowo z zastosowaniem termostabilnego enzymu Tth. Wprowadzenie jonów Mg2+ i Mn2+ do mieszaniny reakcyjnej w odpowiednich proporcjach umożliwiło wykonanie reakcji QRT-PCR w jednej probówce, w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 1 x Tth PCR Buffor zawierający fluorochrom zapewniający odpowiednie tło dla pomiaru fluorescencji po każdym cyklu termicznym QRT-PCR, 3mM MgCl₂, 400 μM. dATP, 400 mM. dTTP. 400 mM. dGTP, 400 μM. dCTP, 1 x wzmacniacz reakcji PCR, 0,5 µM MnSO₄, 0,3 μM starter 1 i starter 2, 0,2 μM sondy wyznakowanej fluorochromami FAM i TAMRA, 1–10 μg całkowitego RNA, 2.5 U polimerazy DNA Tth. Reakcję Q-RT-PCR wykonywano z zastosowaniem detektora sekwencji ABI PRISM^TM 7700.


WYNIKI

Aktywność transkrypcyjna i formy alternatywnego składania mRNA Flt-1 i Flk-1 w grupie kontrolnej
W 65,12 proc. badanych wycinków nie zarejestrowano aktywności transkrypcyjnej jakiegokolwiek genu receptorów VEGF, podczas gdy w 34,88 proc. jedynym zaobserwowanym typem mRNA była rozpuszczalna forma receptora Flt-1 – sFlt1. Aktywność transkrypcyjna tego genu charakteryzowała się zróżnicowanymi wartościami nie przekraczając jednak liczby 3,2x10⁴ kopii mRNA/1 mg całkowitego RNA. W 2,32 proc. przypadków zarejestrowano wysoką aktywność transkrypcyjną powyżej 10 000 kopii mRNA w 1 μg całkowitego RNA badanego wycinka przy 25,58 proc. niskiej ekspresji poniżej 1 000 kopii mRNA (rycina).


Aktywność transkrypcyjna i formy alternatywnego składania mRNA Flt-1 i Flk-1 w grupie LSIL

W grupie LSIL, poza obecnością mRNA sFlt-1 występującego w grupie kontrolnej (p>0,05; Chi²_Pearsona=1,26), zarejestrowano aktywność transkrypcyjną genów receptorów VEGF i stwierdzono obecność mRNA Flt-1 w 11 proc. (p<0,05; Chi²_Pearsona=28,7) i Flk-1 w 16 proc. (p<0,05; Chi ^2Pearsona=12,5) badanych wycinkach tkankowych (tabela). W wycinkach tkankowych wykazujących aktywność transkrypcyjną Flt-1 procentowy rozkład przypadków w przedziałach niskiej, średniej, wysokiej ekspresji był identyczny, mieścił się w zakresie 3–5 proc. i różnił się znamiennie od grupy kontrolnej (p<0,02; Chi² _Pearsona=4,6) (rycina).
W przypadku Flk-1 8 proc. było poniżej 1 000, 5 proc. w przedziale średnich wartości, i tylko 3 proc. powyżej 10 000 kopii mRNA w 1 mg całkowitego mRNA badanego wycinka różniąc się znamiennie od grupy kontrolnej (p<0,001; Chi²_Pearsona=58,9).
Aktywność transkrypcyjna sFlt-1 w LSIL była identyczna jak w grupie kontrolnej i nie zaobserwowano znamiennych różnic (p>0,05; Chi²_Pearsona=0,66).
Pojawienie się mRNA sFlt-1 nie wpływa znamiennie na wzrost ryzyka względnego progresji LSIL (RW=1,17±0,54; 95 proc.=012-2,23). W przypadku stwierdzenia obecności mRNA genu Flt-1 w zmianie śródnabłonkowej powoduje wzrost względnego ryzyka progresji – RW=2,26±1,24; (95 proc. =0,14–4,66). Podobne wartości zaobserwowano dla receptora Flk-1, którego współczynnik RW wynosił 2,41±1,13; (95 proc. =0,2–4,62).


Aktywność transkrypcyjna i formy alternatywnego składania mRNA Flt-1 i Flk-1 w grupie HSIL

mRNA receptora Flt-1 zaobserwowano w 47,06 proc. badanych wycinkach i było statystycznie znamiennie częściej wykrywane niż w grupie kontrolnej i LSIL (p<0,05; Chi²_Pearsona=9,189) (tabela).
W grupie HSIL zarejestrowana aktywność transkrypcyjna genu Flt-1 była znamiennie wyższa od grupy kontrolnej (p<0,001;
Chi²_Pearsona=23,35) i LSIL (p<0,05; Chi²_Pearsona=9,19) i tylko w
12 proc. przypadków charakteryzowała się niską ekspresją poniżej 1 000, przy jednoczesnych 24 proc. wysokiej ekspresji powyżej 10 000 kopii mRNA w 1 μg całkowitego mRNA badanego wycinka tkankowego (rycina).
Obecność mRNA receptora Flk-1 stwierdzono w 58,82 proc. wszystkich badanych wycinków i była znamiennie wyższa (p<0,05, Chi²_Pearsona=10,16) w porównaniu z grupą kontrolną (tabela). Aktywność transkrypcyjna genu Flk-1 była również znamiennie wyższa od występującej w grupie kontrolnej (p<0,001; Chi²_Pearsona=21,63) i LSIL (p<0,01; Chi²_Pearsona=14,15) (tabela), charakteryzując się większa liczbą przypadków mieszczących się w przedziałach średniej (29 proc.) i wysokiej (24 proc.) ekspresji tego genu.

Rozpuszczalną izoformę receptora Flt-1 (sFlt-1) stwierdzono w 70,59 proc. wszystkich badanych wycinkach tkankowych nie obserwując jednocześnie cech znamiennej statystycznie różnicy częstości występowania w porównaniu do grupy kontrolnej (p>0,05; Chi²_Pearsona=6,28) i LSIL (p>0,05; Chi²_Pearsona=3,81) (tabela). Obecność mRNA sFlt-1 w 18 proc. rejestrowano poniżej 1 000, w
24 proc. w przedziale średniej ekspresji i w 29 proc. powyżej
10 000 kopii mRNA w 1 μg całkowitego mRNA badanego wycinka bez wyraźnej różnicy w stosunku do grupy kontrolnej (p>0,05; Chi²_Pearsona=2,65) i z wyższą ekspresją w porównaniu z LSIL (p<0,05; Chi²_Pearsona=10,17) – rycina.
W sposób bezpośredni, w badaniu prospektywnym, ocena ryzyka względnego progresji zmian morfologicznych w zależności od wystąpienia mRNA Flk-1 wykazały 5-krotnie wyższe ryzyko progresji zmiany w stosunku do wycinka tkankowego bez potranskrypcyjnej obecności mRNA tego genu (RW=5,16±2,65; 95 proc.=0,04–10,36). W przypadku stwierdzenia w badanym wycinku tkankowym obecności mRNA Flt-1 ryzyko progresji będzie podobne, jak w przypadku genu poprzedniego receptora i wynosi RW=5,78±2,94; 95 proc.=0,08–11,48. Obecność mRNA sFlt-1 w ocenianym fragmencie tkankowym w grupie HSIL wskazał na niewielki wzrost względnego ryzyka progresji zmiany (RW=2,93±1,82; 95 proc.=0,64–6,5) – tabela.


Aktywność transkrypcyjna
i formy alternatywnego składania mRNA Flt-1 i Flk-1
w grupie raka szyjki macicy

W grupie raka płaskonabłonkowego zarejestrowana aktywność transkrypcyjna genu Flt-1 była znamiennie wyższa od grupy kontrolnej (p<0,001; Chi²_Pearsona=21,44), LSIL (p<0,01; Chi²_Pearsona=11,34) i nie zaobserwowano różnicy w porównaniu z grupą HSIL (p>0,05; Chi²_Pearsona=4,2) – rycina.
Aktywność transkrypcyjna genu Flk-1 również była znamiennie wyższa od występującej w grupie kontrolnej (p<0,001;Chi²_Pearsona=32,02) i LSIL (p<0,001; Chi²_Pearsona=22,92) i w 5 proc. przypadków zarejestrowano niską ekspresję poniżej 1 000, w 48 proc. mieściła się w przedziale średnich wartości i w 19 proc. było powyżej 10000 kopii mRNA w 1 μg całkowitego mRNA badanego wycinka tkankowego (rycina). Nie stwierdzono różnic w aktywności transkrypcyjnej tego receptora w porównaniu z grupą HSIL (p>0,05; Chi²_Pearsona=1,34).
Obecność mRNA sFlt-1 w 48 proc. rejestrowano poniżej 1 000, w 38 proc. w przedziale średnich wartości i w 14 proc. powyżej 10 000 kopii mRNA w 1 μg całkowitego mRNA badanego wycinka z wyraźną różnicą w stosunku do grupy kontrolnej (p<0,001; Chi²_Pearsona=26,94) i LSIL (p<0,001; Chi²_Pearsona=21,39), oraz HSIL (p<0,05; Chi²_Pearsona=10,3) – rycina.
Ocena ryzyka względnego progresji zmian morfologicznych w zależności od występowania mRNA poszczególnych receptorów zaobserwowano, że rozpuszczalna forma receptora Flt-1 (sFlt-1) nie wpływa na wzrost ryzyka progresji zmiany. Występowanie mRNA Flk-1 w tkance raka szyjki macicy powoduje sześciokrotny wzrost względnego ryzyka progresji (RW=5,16±4,91; 95 proc. =3,24–16,02). W przypadku mRNA Flt-1 względne ryzyko progresji jest nieco niższe (RW=4,58) – tabela.


OMÓWIENIE

W przeprowadzonych badaniach w tej pracy nie zarejestrowano obecności mRNA Flt-1 i Flk-1/KDR we wszystkich wycinkach tkankowych prawidłowej strefy regeneracji szyjki macicy, a jedynym typem receptora obecnym w badanym materiale była rozpuszczalna forma Flt-1 – sFlt-1, której mRNA występowało w 34,88 proc. wszystkich wycinków w przeciwieństwie do doniesienia Guidi i wsp. [13], którzy wykazali obecność mRNA receptorów VEGF – Flt-1 i KDR w 66,7 proc. prawidłowych wycinkach szyjki macicy. Obserwacje te mogą potwierdzać udział tej izoformy receptora Flt-1 w fizjologicznym procesie metaplazji i prawidłowym formowaniu podnabłonkowej sieci naczyń.
Funkcja, jaką pełni sFlt-1 w procesie angiogenezy czeka na pełne wyjaśnienie, ale można przyjąć jej hipotetyczną rolę jako fizjologicznego stabilizatora jednowarstwowego śródbłonka naczyniowego uczestniczenia na zasadzie sprzężenia zwrotnego w końcowych etapach angiogenezy i przepuszczalności naczyń, oraz fizjologicznego hamulca wzrostu naczyń w tkance prawidłowej [10]. Mechanizmem biologicznej regulacji, leżącym u podstaw takiego działania, jest możliwość tworzenia heterodimerycznych połączeń z VEGF i jego receptorami na powierzchni błony komórkowej endotelium.
W przeciwieństwie do badań hybrydyzacyjnych Guidi i wsp. [13], w których wykazano obecność mRNA Flt-1 w 66,7 proc. i KDR w 100 proc. przypadków zmian śródnabłonkowych małego stopnia, w prezentowanej pracy nie zaobserwowano tak częstej ekspresji wymienionych receptorów i obecność mRNA pierwszego receptora stwierdzono tylko w 11 proc., a Flk-1 w 16 proc. wycinkach w grupie kobiet ze zmianami śródnabłonkowymi małego stopnia. Pojawienie się ekspresji receptorów VEGF – Flt-1 i Flk-1, nieobserwowanej w grupie kontrolnej jest zrozumiałe na podstawie zdobytej wiedzy o sposobie przenoszenia sygnału mitogennego i chemotaktycznego, inicjowanego ekspresją VEGF [14], a zwłaszcza znaczący udział Flk-1/KDR w progresji zmian nowotworowych. Wymienieni autorzy wskazują jednocześnie, że pomimo obserwowania mRNA prawie we wszystkich badanych preparatach to wysoka ekspresja była obserwowana tylko w przypadku zmian śródnabłonkowych dużego stopnia i raku szyjki macicy [13].
W przeprowadzonych w tej pracy obserwacjach aktywności transkrypcyjnej poszczególnych przypadków zmian śródnabłonkowych małego stopnia zwraca uwagę fakt występowania tej samej ilości mRNA sFlt-1, jak w grupie kontrolnej oraz w kilku tylko procentach wartości ekspresji Flt-1 i Flk-1 przekraczały 104 kopii w 1 mg całkowitego mRNA badanego wycinka tkankowego, co wskazuje na niewielki wzrost aktywności angiogennej tych przypadków, zwracając zasadniczą uwagę na rolę tych receptorów w przenoszeniu sygnału mitogennego i proliferacyjnego VEGF [14].
Porównawczo obserwacje dokonane w trakcie badania ekspresji genów VEGF, Flt-1 i Flk-1 w raku piersi stwierdziły jej obecność tak w komórkach nabłonkowych zmiany nowotworowej, jak i komórkach podścieliska poza błoną naczyniową [15]. Dane te sugerują, że VEGF i jego receptory mogą odgrywać znaczącą rolę nie tylko w parakrynnej regulacji progresji zmiany, ale także w mniej poznawanych wzajemnych zależnościach autokrynnych [15].
Zaobserwowanie w tej pracy aktywności transkrypcyjnej receptorów Flt-1 i Flk-1 w badanych przypadkach zmian śródnabłonkowych szyjki macicy sugeruje, że pojawienie się tej aktywności powinno być wyraźnym wskaźnikiem wiążącym się z ryzykiem progresji zmiany, aczkolwiek prowadzona dalsza ocena względnego ryzyka progresji zmiany śródnabłonkowej w porównaniu z grupą kontrolną nie wskazała na znaczny jego wzrost; RW dla Flt-1 =2,26±1,24 (95 proc. =0,14–4,66) i RW dla Flk-1 =2,41±1,13 (95 proc.=0,2–4,62). Obserwacja ta potwierdza fakt nie w pełni poznanej drogi przenoszenia sygnału oraz autokrynnej i parakrynnej regulacji ekspresji genów VEGF, Flt-1 i Flk-1 w patologii śródnabłonkowej i raku szyjki macicy. Wątpliwości te potwierdzają liczne badania eksperymentalne, w których obserwowano ekspresję wymienionych genów w różnych liniach komórkowych i różnych modelach badawczych [16–24].

Przeprowadzona w tej pracy analiza ryzyka względnego progresji zmiany śródnabłonkowej dużego stopnia do bardziej zaawansowanej zmiany morfologicznej w zależności od pojawienia się form alternatywnego składanie mRNA receptorów VEGF, wykazała niewielki jego wzrost przy obecności sFlt-1, chociaż brak znamiennych różnic w aktywności transkrypcyjnej i występowaniu mRNA tej formy receptora w badanej tkance pomiędzy HSIL i grupą kontrolną, podczas gdy obecność mRNA pozostałych receptorów powoduje wzrost ryzyka względnego progresji; w przypadku Flt-1 – prawie
6-krotnie i Flk-1 – 5-krotnie. Wysokie znamienne różnice aktywności transkrypcyjnej tych receptorów pomiędzy HSIL, grupą kontrolną oraz LSIL wskazują na możliwość zastosowania oceny aktywności transkrypcyjnej wymienionych czynników angiogennych, jako czułych markerów progresji zmiany śródnabłonkowej i raka szyjki macicy.
Wbrew oczekiwaniom, wraz ze wzrostem patologii morfologicznej, nie zaobserwowano wzrostu aktywności transkrypcyjnej Flt-1 i Flk-1 w badanych wycinkach tkankowych raka szyjki macicy, a w niektórych przypadkach była niższa od grupy HSIL.
Prezentowane w tej pracy obserwacje aktywności transkrypcyjnej Flt-1 i Flk-1 zwracają uwagę na 2 interesujące zjawiska – występowanie mRNA sFlt-1 we wszystkich badanych wycinkach tkankowych raka płaskonabłonkowego szyjki macicy oraz znamiennie wyższej liczby kopii tej izoformy w porównaniu z grupą kontrolną, LSIL i HSIL.
Rola rozpuszczalnej formy receptora Flt-1 – sFlt-1 nie jest w pełni poznana, jakkolwiek przypuszcza się, że poprzez duże powinowactwo do wszystkich izoform VEGF stabilizuje te czynniki w przestrzeni międzykomórkowej, chroniąc je przed działaniem znajdujących się w niej proteaz i tym samym przedłużając czas półtrwania cytokin angiogennych w środowisku zewnątrzkomórkowym [25]. W badaniu eksperymentalnym ekspresji genu Flt-1 pozbawionego domeny tyrozynowo-tymidynowej w łożyskach mysich zaobserwowano prawidłowy proces angiogenezy i jedynie supresję chemotaksji monocytów, niejako w odpowiedzi na VEGF [26]. Przeprowadzony eksperyment in vivo wskazał także na funkcję sFlt-1, polegającą na wyłapywaniu izoform VEGF ze środowiska międzykomórkowego, zmniejszenie ich dostępności do śródbłonka naczyniowego i tym samym zmniejszanie efektu mitogennego wywołanego przez VEGF [26].

Po zakończeniu badań wycinków pochodzących z raka płaskonabłonkowego szyjki macicy najwyższą wartość ryzyka względnego progresji w zależności od występowania form mRNA Flk-1 i Flt-1 zaobserwowano w przypadku Flk-1, który powoduje wzrost ryzyka 5-krotnie w stosunku do przypadku braku obecności mRNA tego receptora. W przypadku mRNA Flt-1 względne ryzyko progresji jest tylko nieco niższe (RW=4,58).
Udokumentowanie zasadniczej roli receptorów Flt-1, sFlt-1 i Flk-1 w angiogenezie nowotworów sprawia, że są poszukiwane różne biologiczne czynniki przerywające przenoszenie sygnału mitogennego do komórek śródbłonka poprzez supresję receptora, stając się celem poszukiwania nowych metod terapeutycznych w onkologii. Jedną z nich jest zastosowanie rekombinowanej rozpuszczalnej formy Flk-1 (sFlk-1) silnie wiążącą się z receptorem, a wiązanie to nie wymaga obecności heparyny [27]; inną zastosowanie specyficznego przeciwciała (scFv anty-
-KDR) całkowicie blokujące drogę przenoszącą sygnał angiogenezy VEGF/KDR/Flk-1 [28].
P
IŚMIENNICTWO

1. Klagsbrun M, D’Amore P. Vascular endothelial growth factor and its receptors. Cytokine Growth Factor Rev 1996; 7: 259-70.
2. Fuh G, Li B, Crowley C, Cunningham B, Wells JA. Requirement for binding and signaling of the kinase domain receptor for vascular endothelial growth factor. J Biol Chem 1998; 273: 11197-204.
3. Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis. Kidney Int 2001; 56: 794-814.
4. Ferrara N, Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocrin Rev 1997; 18: 4-25.
5. Peters KG, De Vries C, Williams LT. Vascular endothelial growth factor receptor expression during embryogenesis and tissue repair suggests a role in endothelial differentiation and blood vesel growth. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 8915-9.
6. Shen B-Q, Lee DY, Gerber H-P, Keyt BA, Ferrara N, Zioncheck TF. Homologous up-regulation of KDR/Flk-1 receptor expression by vascular endothelial growth factor in vitro. J Biol Chem 1998; 273: 29979-85.
7. Suzuki H, Seto K, Shinoda Y, Mori M, Ishimura Y, Suematsu M, Ishii H. Paracrine upregulation of VEGF receptor mRNA in endothelial cells by hypoxia-exposed Hep G2 cells. Am J Physiol 1999; 276: G92-G97.
8. Millauer B, Wizigmann-Voos S, Schnürch H, Martinez R, Moller NPH, Risau W, Ullrich A. High affinity VEGF binding and developmental expression sugest flk-1 as a major regulator of vasculogenesis and angiogenesis. Cell 1993; 72: 835-46.
9. Vajkoczy P, Thurnher A, Hirth KP, Schilling L, Schmiedek P, Ullrich A, Menger MD. Measuring VEGF-flk-1 activity and consequences of VEGF-flk-1 targeting in vivo using intravital microscopy: clinical applications. Oncologist 2000; 5 suppl 1: 16-9.
10. Chen H, Ikeda U, Shimpo M, Maeda Y, Shibuya M, Ozawa K, Shimada K. Inhibition of vascular endothelial growth factor activity by transfection with the soluble flt-1 gene. J Cardiovasc Pharmacol 2000; 36: 496-502.
11. Neufeld G, Cohen T, Gengrinovitch S, Poltorak Z. Vascular endothelial growth factor (VEGF) ond its receptors. FASEB J 1999; 13: 9-22.
12. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987 Apr; 162 (1): 156-9.
13. Guidi AJ, Abu-Jawdeh G, Berse B, Jackman RW, Tognazzi K, Dvorak HF, Brown LF. Vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) expression and angiogenesis in cervical neoplasia. J Natl Cancer Inst 1995; 87: 1237-45.
14. Ortéga N, Hutchings H, Plouët J. Signal relays in the VEGF system. Frontiers in Bioscience 1999; 4: d141-152.
15. Speirs V, Atkin SL. Preduction of VEGF and expression of the VEGF receptors flt-1 and KDR in primary cultures of epithelial and stromal cells derived from breast tumours. Brit J Cancer 1999; 80: 898-903.
16. Backer MV, Backer JM. Targeting endothelial cells overexpressing VEGFR-2: selective toxicity of Shiga-like toxin – VEGF fusion proteins. Bioconjugate Chem 2001; 12: 1066-73.
17. Bhatt AJ, Pryhuber GS, Huyck H, Watkins RH, Metlay LA, Maniscalco WM. Disrupted pulmonary vasculature and decreased vascular endothelial growth factor, Flt-1, and TIE-2 in human infants dying with bronchopulmonary dysplasia. Am J Respir Crit Care Med 2001; 164: 1971-80.
18. Kearney JB, Ambler CA, Monaco K-A, Johnson N, Rapoport RG, Bautch VL. Vascular endothelial growth factor receptor Flt-1 negatively regulates developmental blood vessel formation by modulating endothelial cell division. Blood 2002; 99: 2397-407.
19. Koolwijk P, Peters E, van der Vacht B, et al. Involvement of VEGFR-2 (kdr/flk-1) but not VEGFR-1 (flt-1) in VEGF-A and VEGF-C-induced tube formation by human microvascular endothelial cells in fibrin matrices in vitro. Angiogenesis 2001; 4: 53-60.
20. Lu D, Jimenez X, Zhang H, Bohlen P, Witte L, Zhu Z. Selection of high affinity human neutralizing antibodies to VEGFR2 from a large antibody phage display library for antiangiogenesis therapy. Int J Cancer 2002; 97: 393-9.
21. McLeod DS., Taomoto M, Cao J, Zhu Z, Witte L, Lutty GA. Localization of VEGF receptor-2 (KDR/Flk-1) and effects of blocking it in oxygen-induced retinopathy. Invest Ophtalmol Vis Science 2002; 43: 474-82.
22. Masood R, Gordon EM, Whitley MD, et al. Retroviral vectors bearing IgG-binding motifs for antibody-mediated targeting of vascular endothelial growth factor receptors. Int J Mol Med 2001; 8: 335-43.
23. Thuringer D, Maulon L, Frelin C. Rapid transactivation of the vascular endothelial growth factor receptor KDR/Flk-1 by the bradykinin B2 receptor contributes to endothelial nitric-
-oxide synthase activation in cardiac capillary endothelial cells. J Biol Chem 2002; 277: 2028-32.
24. Zeng H, Zhao D, Mukhopadhyay D. Flt-1-mediated down-regulation of endothelial cell proliferation through pertussis toxin-sensitive G proteins, bg subunits, small GTPase CDC42 and partly by Rac-1. J Biol Chem 2002; 277: 4003-9.
25. Hornig C, Weich HA. Soluble VEGF receptors. Angiogenesis 1999; 3: 33-9.
26. Hiratsuka S, Minowa O, Kuno J, Noda T, Shibuya M. Flt-1 lacking the tyrosine kinase domain is sufficient for normal development and angiogenesis in mice. Proc Natl Acad Sci 1998; 95: 9349-54.
27. Huang X, Gottstein C, Brekken RA, Thorpe PE. Expression of soluble VEGF receptor 2 and characterisation of its binding by surface plasmon resonance. Biochem Biophys Res Comm 1998; 252: 643-8.
28. Zhu Z, Rockwell P, Lu D, Kotanides H, Pytowski B, Hicklin DJ, Bohlen P, Witte L. Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced receptor activation with anti-kinase insert domain-containing receptor single-chain antybodies from a display library. Cancer Res 1998; 58: 3209-14.

ADRES DO KORESPONDENCJI

dr med. Bogdan Michalski
ul. Graniczna 63/36
40-018 Katowice
bogdan@proloc.com.pl