Introduction
Chronic heart failure is usually attributed to the loss of cardiomyocytes, with subsequent adverse remodelling of the cardiac muscle. Despite major therapeutic advances, heart failure continues to be a major cause of hospitalizations for patients above 65 years of age. Pharmacological treatment based on drugs with proven therapeutic benefits including -blockers, ACE inhibitors and aldosterone antagonist diuretics has vastly increased the survival of patients suffering from heart failure. However, even the most perfectly tailored pharmacotherapy is not able to prevent mortality from heart disease which currently stands at 20% per year [1]. Advanced techniques for the treatment of heart failure, such as orthotopic heart transplant, mechanical left ventricular assist devices (LVAD) or artificial heart, are not commonly available and their application is limited to a small number of patients.
Consequently, there is an intense effort to find new better methods of treatment that would improve or possibly even completely restore the mechanical function of the heart, particularly among patients in advanced stages of heart disease who are not eligible for surgical treatment due to contraindications. During the last decade, the attention of scientists and physicians has been drawn towards the concept of cardiomyocyte renewal from stem cell populations. It is notable that no other area of medicine has recently been experiencing such rapid growth of regenerative therapy as cardiology.
Experimental animal studies and first-generation clinical trials conducted so far have investigated a variety of cell types including embryonic stem cells (ESC) [2], induced pluripotent stem cells (iPSC) [3], fetal cardiomyocytes [4], skeletal myoblasts (SKM) [5], bone marrow mononuclear cells (BMMNC) and peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) [6], mesenchymal stem cells (MSC), endothelial progenitor cells (EPC) [7], and cardiac stem cells (CSC) [8]. The search for the perfect drug for patients with acute and chronic heart failure is ongoing and in the context of cellular therapy the main focus is on defining a population which:
1) is safe to the patient, i.e. carries no risk of cancer and does not increase the incidence of cardiac arrhythmia;
2) is effective, i.e. improves the mechanical performance of the heart by means of developing a new healthy cardiac muscle and blood vessels that are functionally integrated with the patient’s tissues;
3) is available as a standardized product and relatively inexpensive to administer;
4) can be applied in the clinical setting using minimally invasive methods;
5) is tolerated by the patient’s immune system;
6) gives rise to no legal or ethical dilemmas.
The present article includes a summary of first-generation clinical trials and a discussion of prospects for the development of regenerative therapy in the foreseeable future.Endogenous mechanisms of cardiac regeneration
It has been known for quite a long time that the human heart has a limited regenerative potential compared to other tissues and organs such as the liver, skeletal muscles, intestine, bones or skin. The left cardiac ventricle has been shown to consist of ca. 2-4 billion cardiomyocytes [9]. Physiological ageing is associated with the process of natural death of cardiac muscle cells. A healthy heart is assumed to lose ca. 1 γ of the myocardium (i.e. ca. 20 millions of cardiomyocytes) during 1 year [10]. Myocardial infarction, however, can destroy up to 25% of the cardiac muscle in the course of a few hours. Chronic cardiovascular diseases including arterial hypertension and valve defects of the heart result in a gradual but steadily escalating loss of cardiomyocytes [11]. The majority of cells in the adult cardiac muscle are mononuclear and polyploid [12]. They seem to preserve their proliferative capacity for the first couple of months of life. The final cycles of DNA synthesis usually do not involve a division of the nucleus and cytoplasm. The process leads to the formation of mononuclear cells with a multiplied DNA content (4n and more) [13]. Following the proliferation phase, cardiomyocytes enter the stage of physiological growth and increase their volume up to 30-40 times. In response to pathological stimuli such as arterial hypertension valvular heart disease, or following myocardial infarction, cardiomyocytes reinitiate DNA synthesis, however ultimately no divisions of the nucleus and cytoplasm take place [14]. Accordingly, the ploidy of cardiomyocytes increases, even up to 64n. The process makes it significantly more difficult to interpret the results of examinations aimed at assessing the proliferative capacity of the human myocardium. Such assessments were published in the respected medical journal Lancet in 2009 [15].
In their experimental study, Bergmann et al. took advantage of the release of the radioactive isotope of carbon (14C) into the atmosphere during the Cold War period, followed by a rapid decline in 14C content after the entry into force of the Limited Nuclear Test Ban Treaty in 1963. Since 14C was absorbed into the digestive tract, it was possible to establish the age of cardiomyocytes by correlating 14C concentrations in the air and amounts incorporated into the cellular DNA. The renewal potential of cardiomyocytes was found to be dependent on individual age. In humans at 20 years of age ca. 1% of cardiomyocytes are renewed per year, however in 75-year-olds the rate drops to 0.4%, which means that ca. 45% of heart muscle cells are renewed during a normal human life span. Even though this endogenous mechanism underlying cardiomyocyte regeneration is able to keep up with the physiological loss of cells taking place on an ongoing basis, it is not sufficiently effective to make up for the loss of cells arising, for example, during myocardial infarction. Skeletal myoblasts
Attempts to reinforce the regenerative potential of the heart have been undertaken for more than a decade. Repair activities focus on the one hand on the activation of endogenous mechanisms by supplying the damaged area with signals inducing proliferation and neoangiogenesis, and producing antiapoptotic and antioxidative effects. On the other hand, the goal is to increase the absolute number of cardiomyocyte progenitor cells in the risk zone.
The first cells to be used in the regenerative therapy of the heart were skeletal myoblasts due to their contractile properties, relatively high resistance to ischaemia and ease of accessibility for autologous procedures. In 2000, Menasche used skeletal myoblasts in patients with ischaemic heart disease undergoing surgical revascularization [16]. The follow-up period of several months revealed improved viability and contractility within the grafted tissue, confirmed with echocardiography and positron emission tomography (PET). At the same time, however, the study – as well as other research – showed an increase in the incidence of sustained ventricular arrhythmias, especially in the early postoperative phase [17]. Myoblasts are now known not to integrate electrically with the host tissues because their cellular membranes lack the protein connexin 43 which is a structural element of gap-junction intercellular communication. Consequently, grafted myoblasts hinder the transmission of active potentials in the muscle fibre and thus promote re-entry arrhythmia [18]. After grafting into the heart, skeletal myoblasts are transformed into multinucleated myotubes rather than cardiomyocytes.
Preclinical trials are currently under way to investigate populations of stem cells isolated from the blood vessels of skeletal muscle, the so-called myoendothelial cells, which are proposed to have a potential for differentiation into cardiomyocytes and endothelial cells. However, they do not express connexin 43 either, so complications in the form of cardiac arrhythmia disorders are to be expected [18]. Bone marrow stem cells
Concurrently with Menasche’s publication the first report was published on the application of bone marrow stem cells in the regenerative therapy of the heart [19].
The concept of using bone marrow emerged on the basis of extensive clinical experience with transplantation procedures, and the relatively easy access to significant amounts of autologous cells. Bone marrow is composed of at least several different populations of stem cells including haematopoietic stem cells (HSC) [20], MSC [21] and EPC [22]. Bone marrow mononuclear cells are the most common type of stem cells used for clinical applications. The population is very heterogeneous, consisting largely of cells representing all lines of the haematopoietic system at different stages of maturation. There are relatively few stem cells among them, with the proportion of HSC/EPC estimated at ca. 2-4% and MSC at ca. 0.01% [23]. The therapy uses both unselected BMMNC population and a subset of cells enriched with progenitor fractions. So far, they have been used mainly in patients after acute myocardial infarction and, to a lesser extent, in the treatment of resistant angina pectoris and chronic heart failure [24-26]. Unfortunately, haematopoietic cells have not been definitely proved to possess the capacity of transforming into cardiomyocytes in vivo [26]. Their effects are more commonly attributed to paracrine mechanisms (related to the secretion of cytokines and growth factors) and to the direct cytoprotective action (based on intercellular interactions and adhesive molecules) [9]. The analysis of available findings gives rise to a number of conclusions:
1) Intracoronary injection of bone marrow cells is a safe and relatively easy procedure.
2) The therapy produces a moderate clinical improvement, though study endpoints are not always achieved; furthermore doubts are raised over the sustainability of the therapeutic effect.
3) So far, the treatment has been practised predominantly among patients hospitalized due to the first myocardial infarction, treated by primary angioplasty, with a mild contraction deficit in the left ventricular muscle (EF ca. 50%), who fail to show significant improvement in response to therapy.
An interesting cell population among BMMNC are mesenchymal stem cells (stromal cells of bone marrow) [28]. They are unique in that they do not express of the major histocompatibility complex (MHC) class II molecules (HLA DR, DQ, DP) and adhesion molecules, which gives them low immunogenicity. As a result, they can be a source of cells for use in allogeneic therapy. This fact is all the more important because the process of ageing, just like advanced circulatory failure, significantly compromises the quality and the regeneration potential of haematopoietic cells. Consequently, the application of standardized allogeneic mesenchymal cells might be of value in terms of providing a more uniform therapeutic effect. Mesenchymal cells can be multiplied under in vitro conditions fairly easily. In addition, they are resistant to DNA-damaging factors and preserve the integrity of the genetic material in culture for up to several months. It is worthwhile to note that the most spectacular effect of regeneration therapy reported to date concerns patients with acute myocardial infarction who received mesenchymal stem cells during angioplasty treatment. The patients had a 14% improvement in the ejection fraction of the left ventricle [29]. In view of their properties, mesenchymal stem cells seem an attractive target for research also from the viewpoint of the pharmaceutical industry.Cardiac stem cells
The search for natural progenitor cells for cardiomyocytes led, at the beginning of the present century, to the discovery and identification of CSC [30]. Cardiac stem cells are known to have the properties of self-renewal, clonal proliferation and differentiation into cardiac muscle, smooth muscle and endothelial cells. Cardiac stem cells are localized in the so-called cardiac niche, i.e. clusters of stem and stromal cells, which enables mutual associations and interactions with the extracellular matrix structures. Messina was the first to isolate CSC from fragments of the myocardium sourced from patients during cardiac surgery in 2004 [31]. Cardiac stem cells were sustained in culture in the form of spherical cellular conglomerates called cardiospheres (CSp). Despite encouraging results obtained in animal studies, cardiospheres have not found application in clinical trials because of fairly large molecule size (50-200 μm). Routine administration of molecules of this size through coronary vessels could turn out to be a risky procedure. Consequently, 3 years later Marban’s team modified the isolation protocol and developed a method for acquiring a suspension of individual progenitor cells from cardiospheres (cardiosphere-derived cells – CDC) [32]. The starting material for isolation was tissue obtained from the patient by percutaneous endomyocardial biopsy. Cells cultured in vitro can be proliferated to obtain an appropriate amount (in the range of tens of millions) for clinical applications. The entire procedure takes ca. 4-6 weeks to perform despite a small amount of starting material. Cardiac stem cells are a morphologically heterogeneous population of cells, rich both in stem and stromal cells. No proarrhythmic effect or cancers associated with CDC administration have been noted in over 1,000 animal experiments conducted to date. More recently, the phase I/II clinical trial CADUCEUS (Cardiosphere-Derived aUtologous stem CElls to reverse ventricUlar dySfunction) was launched [33]. The trial involved patients after myocardial infarction, with left ventricular contractile dysfunction and the ejection fraction (EF) of ca. 25-45%. The patients received autologous cells 2-3 months after the ischaemic episode. One-year follow-up period showed reduced scarring after myocardial infarction as well as improved contractility and increased viable heart muscle mass compared to the control group receiving traditional treatment. Another phase I trial which is currently in progress (SCIPIO – Stem Cell Infusion in Patients with Ischaemic cardiOmyopathy) has already established the safety of intracoronary infusion of stem cells isolated from the heart [34].Pluripotent stem cells
In general terms, stem cells can be described and divided on the basis of their renewal potential. Cardiac stem cells, similarly to HSC, are multipotent stem cells (i.e. have an ability to differentiate into one specialized group of cells, e.g. cardiomyocytes and endothelial cells or haematopoietic cells), whereas the greatest regeneration potential lies in pluripotent stem cells. These comprise ESC and iPSC. The latter originate from somatic cells (e.g. fibro-blasts, lymphocytes) which in the course of molecular manipulations acquire the morphological and functional properties of stem cells [35] (Fig. 1). Notably, authors of this discovery, Gurdon and Yamanaka, were awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 2012.
Embryonic stem cells, on the other hand, are derived from the inner cell mass of the embryo at the blastocyst stage [36]. Pluripotent stem cells have a capacity for unlimited proliferation and self-renewal; they can be differentiated into tissues of the three germ layers: the ectoderm, endoderm and mesoderm, including cardiomyocytes [37] (Fig. 2). Pluripotent stem cells are relatively easy to culture in vitro. Since they divide efficiently, it is not difficult to obtain an appropriate amount for therapeutic purposes. Unfortunately, in view of a range of major obstacles, the cells have not found a prominent place in the clinical setting as yet [38]. Firstly, unlimited division capacity of undifferentiated cells carries the risk of cancer development. Usually, these are benign tumours called teratomas. Nevertheless, the risk of contaminating material with cells exhibiting malignant transformation potential cannot be ruled out. Secondly, the use of allogeneic cells entails the risk of rejection by the host’s immune system. Consequently, immunosuppressive therapy would be necessary to maintain the effect of treatment. What is more, the sourcing of embryonic stem cells for therapeutic purposes is fraught with ethical and legal controversies [39]. An attempt to circumvent the issue was generation of induced pluripotent stem cells. For the time being, however, the efficiency of the process of reprogramming somatic cells is very low, ranging between 0.001% and 0.01% depending on cell type and on the initial cell number [40]. Further concerns are also raised regarding the methodology of cell preparation. Typically, genetic modifications are performed with viral vectors, whose integration within the genetic material may induce oncogenic transformation of cells. In order to find a way round this problem, works are currently under way to determine the suitability of episomal vectors, protein molecules and short-stranded RNAs [41]. The reprogramming of somatic cells takes ca. 4 months. A comprehensive assessment of the method must also take due account of high costs of therapy which must each time be customized to an individual patient [42].
Despite all the limitations, however, the regeneration potential of pluripotent cells is the main reason behind the scientific community’s unwavering commitment to research focused on the application of the therapeutic capabilities of these cells in clinical practice. No resolution to these problems should be expected in the near future, though.Tasks for the future
First-generation clinical trials have not yielded unambiguous findings. While they have established without a doubt that cell therapy is possible and relatively safe in patients with advanced heart disease and using invasive methods, the trials conducted to date suffer from a number of weak points including:
1) Lack of uniform and standardized procedures governing cell preparation (unselected cell population vs. cells enriched with progenitor fractions, in vitro culturing), therapeutic doses (limited cell availability and their proliferative potential), routes of administration (direct – intravenous, intracoronary, epi- and endocardial injections; and indirect – mobilization of stem cells with growth factors), and the therapeutic window (administration during the coronary incident vs. in a remote period) [43].
2) Loss of cells between harvesting until implantation in the target tissue; estimates suggest that after 24 h, irrespective of the route of administration or cell type, the heart sustains less than 10% of the originally administered cells, of which further 90% die within a week; the process has been linked to cell washout via veins, mechanical ejection from the delivery site and apoptosis due to ischaemia, lack of contact with elements of the extracellular matrix and inflammation [44].
3) Uncertain cardiogenic potential of bone marrow stem cells; the formation of new blood vessels and the cardiac muscle occurs extremely rarely, if at all, in the circumstances; the disadvantages do not rule out the usefulness of these cell populations in regeneration therapy, e.g. in elderly patients, when the primary goal is not to reconstruct damaged cardiac muscle but to improve the quality of life; the considered mechanisms of action: through the production of cytokines and growth factors – cardioprotection, angiogenesis, inflammatory modulation, improved tissue metabolism; fusion of donor’s and recipient’s cells is also possible [45].
Another important issue concerns preclinical trials whose results have not translated into successful outcomes of regeneration therapy in humans. Based on the clinical experience gained so far, it is difficult to state with certainty which animal model is the best to use. Routinely, animals used for experiments are genetically uniform, young and healthy, not subjected to pharmacotherapy due to coexisting conditions and kept in strictly regulated environments. No natural animal model of ischaemic heart disease is known, either. Researchers customarily use mechanical closure of the coronary artery, which does not always reflect the essence of the clinical problem at hand [43].
While being aware of multiple imperfections associated in the method, one must not lose sight of the fact that stem cells are a powerful tool which, when properly applied, may turn out to be a major milestone in the treatment of some chronic illnesses. The discovery of CSC and efforts targeted at introducing pluripotent stem cells into the clinical setting are opening a new chapter in the regeneration therapy of the heart (see Table 1). However, further research in the field is necessary, with a special focus on large randomized clinical trials to clarify uncertainties, so that this form of treatment earns its permanent place in cardiac therapy. References
1. Roger VL, Go AS, Lloyd-Jones DM, et al. Heart disease and stroke statistics-2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation 2011; 123: e18-e209.
2. Caspi O, Huber I, Kehat I. Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts. J Am Coll Cardiol 2007; 50: 1884-1893.
3. Nelson TJ, Martinez-Fernandez A, Yamada S. Rapair of acute myocardial infarction by human stemness factors induced pluripotent stem cells. Circulation 2009; 120: 408-416.
4. Muller-Ehmsen J, Peterson KL, Kedes L. Rebuilding a damaged heart: long-term survival of transplanted neonatal rat cardiomyocytes after myocardial infarction and effect on cardiac function. Circulation 2002; 105: 1720-1726.
5. Menasche P, Alfieri O, Janssens S. The Myoblast Autologous grafting in Ischemic Cardiomyopathy (MAGIC) trial: first randomized placebo-controlled study of myoblast transplantation. Circulation 2008; 117: 1189-1200.
6. Lunde K, Solheim S, Aakhus S. Intracoronary injection of mononuclear bone-marrow cells in acute myocardial infarction. N Engl J Med 2006; 355: 1199-1209.
7. Katritsis DG, Sotiropoulou PA, Karvouni E. Transcoronary transplantation of autologous mesenchymal stem cells and endothelial progenitors into infracted human myocardium. Catheter Cardiovasc Interv 2005; 65: 321-329.
8. Smith RR, Barile L, Cho HC. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens. Circulation 2007; 115: 896-908.
9. Murry CE, Reinecke H, Pabon LM. Regeneration gaps: observations on stem cells and cardiac repair. J Am Coll Cardiol 2006; 47: 1777-1785.
10. Olivetti G, Melissari M, Capasso JM. Cardiomyopathy of the aging human heart. Circ Res 1991; 68: 1560-1568.
11. Whelan RS, Kaplinskiy V, Kitsis RN. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol 2010; 72: 19-44.
12. Olivetti G, Cigola E, Maestri R. Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart. J Mol Cell Cardiol 1996; 28: 1463-1477.
13. Adler CP, Costabel U. Cell number in human heart atrophy, hypertrophy and under the influence of cytostatics. Recent Adv Stud Cardiac Struct Metab 1975; 6: 343-355.
14. Adler CP. Relationship between deoxyribonucleic acid content and nucleoli in human heart muscle cells and estimation of cell number during cardiac growth and hyperfunction. Recent Adv Stud Cardiac Struct Metab 1975; 8: 373-386.
15. Bergmann O, Bhardwaj RD, Bernard S. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science 2009; 324: 98-102.
16. Menasche P, Hagege AA, Scorsin M. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet 2001; 357: 279-280.
17. Menasche P, Alfieri O, Janssens S. The Myoblast Autologous Grafting in Ischemic Cardiomyopathy (MAGIC) trial: first randomized placebo-controlled study of myoblast transplantation. Circulation 2008; 117: 1189-1200.
18. Menasche P. Skeletal myoblasts for cardiac repair: act II? J Am Coll Cardiol 2008; 52: 1881-1883.
19. Strauer BE, Brehm M, Zeus T. Intracoronary, human autologous stem cell transplantation for myocardial regeneration following myocardial infarction. Dtsch Med Wochenschr 2001; 126: 932-938.
20. Civin CI, Gore SD. Antigenic analysis of hematopoiesis: a review. J Hematother 1993; 2: 137-144.
21. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for cellular therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8: 315-317.
22. Crosby JR, Kaminski WE, Schatteman G. Endothelial cells of hematopoietic origin make a significant contribution to adult blood vessel formation. Circ Res 2000; 87: 728-730.
23. Dimmeler S, Zeiher AM. Cell therapy of acute myocardial infarction: open questions. Cardiology 2009; 113: 155-160.
24. Martin-Rendon E, Brunskill SJ, Hyde CJ. Autologous bone marrow stem cells to treat acute myocardial infarction: a systematic review. Eur Heart J 2008; 29: 1807-1818.
25. Losardo DW, Schatz RA, White CJ. Intramyocardial transplantation of autologous CD34+ stem cells for intractable angina: a phase I/IIa double-blind, randomized controlled trial. Circulation 2007; 115: 3165-3172.
26. van Ramshorst J, Bax JJ, Jeroen J. Intramyocardial bone marrow cell injection for chronic myocardial ischemia: a randomized controlled trial. JAMA 2009; 301: 1997-2004.
27. Murry CE, Soonpaa MH, Reinecke H. Hematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts. Nature 2004; 428: 664-668.
28. Williams AR, Hare JM. Mesenchymal stem cells: biology, pathophysiology, translational findings, and therapeutic implications for cardiac disease. Circ Res 2011; 109: 923-940.
29. Chen SL, Fang WW, Ye F. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. Am J Cardiol 2004; 94: 92-95.
30. Beltrami AP, Barlucchi L, Torella D. Adult cardiac stem cells are multipotent and suport myocardial regeneration. Cell 2003; 114: 763-776.
31. Messina E, De Angelis L, Frati G. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res 2004; 95: 911-921.
32. Smith RR, Barile I, Cho HC. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens. Circulation 2007; 115: 896-908.
33. CADUCEUS. Cardiosphere-Derived aUtologous stem CElls to reverse ventricUlar dySfunction (NCT00893360) www.clinicaltrials.gov
34. SCIPIO. Stem Cell Infusion in Patients with Ischemic cardiOmyopathy (NCT00474461) www.clinicaltrials.gov
35. Park IH, Zhao R, West JA. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008; 451: 141-146.
36. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282: 1145-1147.
37. Murry CE, Keller G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell 2008; 132: 660-680.
38. Nussbaum J, Minami E, Laflamme MA. Transplantation of undifferentiated murine embryonic stem cells in the heart: teratoma formation and immune response. Faseb J 2007; 21: 1345-1357.
39. Passier R, van Laake LW, Mummery CL. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature 2008; 453: 322-329.
40. Yoshida Y, Yamanaka S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol 2011; 50: 327-332.
41. Shi Y, Do JT, Desponts C. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 2008; 2: 525-528.
42. Freund C, Mummery CL. Prospects for pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in cardiac cell therapy and as disease models.
J Cell Biochem 2009; 107: 592-599.
43. Lovell MJ, Mathur A. Cardiac stem cell therapy: progress from bench to bedside. Heart 2010; 96: 1531-1537.
44. Pagani FD, DerSimonian H, Zawadzka A. Autologous skeletal myoblasts transplanted to ischemia-damaged myocardium In humans: histological analysis of cell survival and differentiation. J Am Coll Cardiol 2003; 41: 879-888.
45. Gnecchi M, Zhang Z, Ni A. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res 2008; 103: 1204-1219.
Wprowadzenie
Przewlekła niewydolność serca jest najczęściej wynikiem utraty kardiomiocytów i w konsekwencji niekorzystnego remodelingu mięśnia serca. Pomimo znacznego postępu w terapii, niewydolność serca jest główną przyczyną hospitalizacji wśród pacjentów po 65. roku życia. Zastosowanie leków o udowodnionym efekcie terapeutycznym, takich jak -adrenolityki, inhibitory konwertazy angiotensyny oraz leki moczopędne z grupy antagonistów aldosteronu znacznie wydłużyło przeżycie pacjentów z niewydolnością serca. Jednak nawet idealnie dobrana farmakoterapia nie zapobiega śmiertelności z powodu choroby serca, która wynosi do 20% na rok [1]. Zaawansowane techniki leczenia niewydolności serca, takie jak ortotopowy przeszczep serca, mechaniczne urządzenia wspomagające pracę lewej komory czy sztuczne serce, nie są powszechnie dostępne, a ich użycie jest ograniczone do nielicznej grupy chorych.
Duży nacisk kładzie się w związku z tym na poszukiwanie nowych, doskonalszych metod leczenia pozwalających na poprawę bądź nawet przywrócenie mechanicznej funkcji serca, szczególnie u pacjentów w zaawansowanych stadiach choroby, niekwalifikowanych do leczenia zabiegowego. W ostatniej dekadzie zainteresowanie naukowców i lekarzy wzbudziła koncepcja zdolności kardiomiocytów do odnowy z populacji komórek macierzystych. Warto podkreślić, że obecnie w żadnej innej dziedzinie medycyny terapia regeneracyjna nie rozwija się tak prężnie jak w kardiologii.
W doświadczeniach eksperymentalnych na zwierzętach oraz próbach klinicznych I generacji wykorzystano dotychczas wiele różnych typów komórek. Należą do nich: zarodkowe komórki macierzyste (embryonic stem cells – ESC) [2], indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (induced pluripotent stem cells – iPSC) [3], kardiomiocyty płodowe [4], mioblasty (skeletal myoblasts – SKM) [5], komórki jednojądrzaste szpiku kostnego i krwi obwodowej (bone marrow mononuclear cells – BMMNC, peripheral blood mononuclear cells – PBMNC) [6], komórki mezenchymalne (mesenchymal stem cells – MSC), progenitory endotelialne (endothelial progenitor cells – EPC) [7] oraz komórki macierzyste serca (cardiac stem cells – CSC) [8]. Poszukiwania idealnego leku dla chorych z ostrą i przewlekłą niewydolnością serca ciągle trwają, a w kontekście terapii komórkowej ich celem jest zdefiniowanie populacji, która:
1) jest bezpieczna dla pacjenta, tzn. nie stanowi ryzyka powstania nowotworu ani nie zwiększa częstości występowania arytmii,
2) jest skuteczna, tzn. poprawia mechaniczną pracę serca poprzez wytworzenie nowego, zdrowego mięśnia serca i naczyń krwionośnych, które funkcjonalnie integrują się z tkankami pacjenta,
3) jest dostępna jako wystandaryzowany produkt i stosunkowo niedroga,
4) może być stosowana w klinice przy użyciu metod małoinwazyjnych,
5) jest tolerowana przez układ immunologiczny pacjenta,
6) nie rodzi wątpliwości natury prawno-etycznej.
W artykule zostaną pokrótce podsumowane wyniki badań klinicznych I generacji oraz omówione perspektywy rozwoju terapii regeneracyjnej w najbliższej przyszłości.Endogenne mechanizmy regeneracji w sercu
Od dawna wiadomo, że serce człowieka ma niewielki potencjał odtwórczy w porównaniu z innymi tkankami i narządami, takimi jak: wątroba, mięsień szkieletowy, jelito, kość czy skóra. Oszacowano, że lewa komora serca zbudowana jest z około 2–4 bilionów kardiomiocytów [9]. Fizjologiczne starzenie się organizmu wiąże się z naturalnym obumieraniem komórek mięśnia serca. W zdrowym narządzie zakłada się utratę około 1 γ miokardium (tj. około 20 milionów kardiomiocytów) w ciągu roku [10]. Zawał serca w kilka godzin może zniszczyć nawet 25% mięśnia. Choroby przewlekłe układu krążenia, w tym nadciśnienie tętnicze oraz wady zastawkowe serca, powodują stopniową, lecz systematyczną utratę kardiomiocytów [11]. Większość komórek mięśnia sercowego dorosłego człowieka jest jednojądrzasta i poliploidalna [12]. Wydaje się, że zachowują one zdolność do proliferacji przez kilka pierwszych miesięcy życia. Ostatnie cykle syntezy DNA przebiegają zazwyczaj bez podziału jądra komórkowego oraz cytoplazmy. Powstają wówczas komórki jednojądrzaste, o zwielokrotnionej zawartości DNA (4n i więcej) [13]. Po okresie proliferacji kardiomiocyty wchodzą w fazę fizjologicznego wzrostu i zwiększają swoją objętość nawet 30–40-krotnie. W odpowiedzi na patologiczne obciążenie, np. w nadciśnieniu tętniczym, wadach zastawkowych serca czy po zawale serca, kardiomiocyty ponownie inicjują syntezę DNA, ale ostatecznie nie dochodzi do podziału jądra komórkowego i cytokinezy [14]. To dodatkowo zwiększa ploidię komórek serca, nawet do 64n. Zjawisko to znacząco utrudnia interpretację badań, które zmierzają do oszacowania zdolności proliferacyjnych miokardium u człowieka. Wyniki takich obliczeń zostały opublikowane w 2009 roku w prestiżowym czasopiśmie Lancet [15].
Bergmann i wsp. wykorzystali w eksperymencie fakt uwolnienia do atmosfery radioaktywnego węgla (14C) w okresie zimnej wojny, a następnie gwałtowne zmniejszenie jego zawartości po wejściu w życie Traktatu o Zakazie Prób Broni Nuklearnej w 1963 roku. 14C został włączony do łańcucha pokarmowego, a poprzez korelowanie jego stężenia w powietrzu i ilości wbudowanej do DNA komórek oszacowano wiek kardiomiocytów. Wykazano, że zdolności regeneracyjne tych komórek zależą od wieku osobniczego. Około 1% nowych kardiomiocytów powstaje rokrocznie u człowieka w wieku 20 lat, ten odsetek zmniejsza się natomiast do 0,4% w wieku 75 lat. Znaczy to, że około 45% komórek mięśnia serca odnawia się w ciągu życia człowieka. Chociaż ten endogenny mechanizm regeneracji kardiomiocytów kompensuje na bieżąco fizjologiczną utratę komórek, to jest niewątpliwie mało wydajny i niewystarczający, żeby uzupełnić straty powstałe w przebiegu np. zawału serca. Mioblasty szkieletowe
Już od ponad 10 lat podejmowane są próby wzmocnienia potencjału regeneracyjnego serca. Działania naprawcze koncentrują się z jednej strony na aktywacji mechanizmów endogennych, poprzez dostarczanie w okolice miejsca uszkodzenia sygnałów sprzyjających proliferacji i neoangiogenezie, działających antyapoptotycznie i przeciwoksydacyjnie, z drugiej natomiast – na zwiększeniu bezwzględnej liczby komórek prekursorowych kardiomiocytów w strefie zagrożenia.
Pierwsze w terapii regeneracyjnej serca użyte zostały mioblasty szkieletowe ze względu na ich właściwości kurczliwe, możliwość pobrania do zabiegów autologicznych i znaczną odporność na niedokrwienie. W 2000 roku Menasche zastosował mioblasty szkieletowe u pacjentów z chorobą niedokrwienną serca poddawanych rewaskularyzacji chirurgicznej [16]. W kilkumiesięcznej obserwacji udało się wykazać poprawę żywotności i kurczliwości w obrębie przeszczepionej tkanki, ocenianą za pomocą badania echokardiograficznego i pozytonowej tomografii emisyjnej. Jednocześnie w tym i kolejnych badaniach obserwowano zwiększenie częstości występowania utrwalonych arytmii komorowych, zwłaszcza we wczesnym okresie pooperacyjnym [17]. Wiadomo już, że mioblasty nie integrują się elektrycznie z otaczającymi tkankami, w ich błonie komórkowej brak jest bowiem białka, koneksyny 43, która stanowi strukturalną część połączeń międzykomórkowych o typie gap junction. W związku z tym przeszczepione mioblasty stanowią przeszkodę dla rozprzestrzeniania się potencjału aktywacyjnego w mięśniu i sprzyjają powstawaniu arytmii w mechanizmie fali nawrotnej [18]. Po transplantacji do tkanki serca mioblasty szkieletowe przekształcają się w wielojądrzaste miotuby, a nie kardiomiocyty.
Prowadzone są obecnie badania przedkliniczne z wykorzystaniem populacji komórek macierzystych izolowanych ze ściany naczyń krwionośnych mięśni szkieletowych, tzw. komórek mioendotelialnych, o proponowanym potencjalnie do różnicowania się w kierunku kardiomiocytów i komórek śródbłonka. One jednak również nie wykazują ekspresji koneksyny 43, należy więc oczekiwać powikłań w postaci zaburzeń rytmu serca [18].Komórki macierzyste szpiku kostnego
Mniej więcej równolegle z pracą Menasche ukazało się pierwsze doniesienie o zastosowaniu komórek macierzystych szpiku kostnego w terapii regeneracyjnej serca [19]. Koncepcja wykorzystania szpiku kostnego wypływała z wieloletniego doświadczenia klinicznego z zabiegami transplantacji oraz stosunkowo łatwego dostępu do dużej ilości komórek autologicznych. Szpik kostny zawiera co najmniej kilka populacji komórek macierzystych, a wśród nich właściwe komórki krwiotwórcze (hematopoietic stem cells – HSC) [20], MSC [21] i prekursory śródbłonka (EPC) [22]. Do użytku klinicznego najczęściej stosuje się frakcję tzw. komórek jednojądrzastych szpiku kostnego (BMMNC). Jest to populacja bardzo heterogenna, której większość stanowią komórki wszystkich linii układu krwiotwórczego na różnych etapach dojrzewania. Właściwych komórek macierzystych jest wśród nich stosunkowo niewiele, ich ilość szacuje się na około 2–4% HSC/EPC oraz około 0,01% MSC [23]. W terapii wykorzystuje się zarówno nieselekcjonowaną populację BMMNC, jak i komórki wzbogacone we frakcje progenitorowe. Dotąd znalazły zastosowanie przede wszystkim u pacjentów w ostrym zawale serca, w mniejszym stopniu również w leczeniu opornej dławicy piersiowej oraz przewlekłej niewydolności serca [24–26]. Nie udało się niestety bezspornie wykazać, że w warunkach in vivo komórki krwiotwórcze mają zdolność do przekształcania się w kardiomiocyty [26]. Efekt ich działania przypisuje się raczej mechanizmom parakrynnym (poprzez wydzielane cytokiny i czynniki wzrostu) oraz bezpośredniej cytoprotekcji (poprzez oddziaływania międzykomórkowe i cząsteczki adhezyjne) [9]. Analiza zgromadzonych wyników pozwala na wyciągnięcie kilku wniosków:
1. Dowieńcowe podanie komórek szpiku kostnego jest bezpieczne i stosunkowo proste do wykonania.
2. Odnotowuje się umiarkowaną poprawę kliniczną w związku z zastosowaną terapią, chociaż nie zawsze osiągnięte są punkty końcowe badania; wątpliwości budzi też trwałość efektu takiego leczenia.
3. Dotychczas terapią objęci byli przede wszystkim chorzy przyjmowani do szpitala z powodu pierwszego w życiu zawału serca, poddawani zabiegowi pierwotnej angioplastyki, z niewielkim deficytem kurczliwości mięśnia lewej komory (EF około 50%), u których trudno wykazać istotną poprawę po leczeniu.
Interesującą populacją wśród BMMNC są komórki mezenchymalne (komórki zrębowe szpiku) [28]. Nie wykazują one bowiem ekspresji cząsteczek głównego układu zgodności tkankowej typu II (HLA DR, DQ, DP) oraz cząsteczek adhezyjnych, są więc niskoimmunogenne. Potencjalnie mogą być źródłem do wykorzystania w terapii allogenicznej. Ma to znaczenie, tym bardziej że wraz ze starzeniem się organizmu oraz w przebiegu zaawansowanej niewydolności krążenia znacząco obniża się jakość i potencjał regeneracyjny komórek krwiotwórczych. Zastosowanie wobec tego wystandaryzowanych, allogenicznych komórek mezenchymalnych może pomóc w ujednoliceniu efektów terapii. Komórki mezenchymalne stosunkowo łatwo mogą być namnażane w warunkach in vitro, są odporne na działanie czynników uszkadzających DNA i zachowują integralność materiału genetycznego nawet przez kilka miesięcy hodowli. Warto wspomnieć, że najbardziej spektakularny opisany dotąd efekt terapii regeneracyjnej dotyczył właśnie pacjentów z ostrym zawałem serca, którzy w trakcie angioplastyki otrzymali komórki mezenchymalne. U tych chorych zaobserwowano poprawę frakcji wyrzutowej lewej komory serca o 14% [29]. Komórki mezenchymalne ze względu na właściwości wydają się atrakcyjnym przedmiotem badań również z punktu widzenia przemysłu farmaceutycznego.Komórki macierzyste serca
Poszukiwania naturalnych prekursorów dla kardiomiocytów doprowadziły na początku tego wieku do odkrycia i zdefiniowania endogennych CSC [30]. Wiadomo, że komórki te mają zdolność do samoodnowy, proliferacji klonalnej oraz różnicowania w kierunku komórek mięśnia serca, mięśni gładkich i śródbłonka. Komórki macierzyste serca zlokalizowane są w sercu w obrębie tzw. niszy, czyli skupisk komórek macierzystych i zrębowych, co umożliwia wzajemne interakcje i oddziaływanie ze strukturami macierzy zewnątrzkomórkowej. W 2004 roku Messina pierwszy wyizolował CSC z fragmentów miokardium pobieranych od chorych w trakcie zabiegów kardiochirurgicznych [31]. Komórki te utrzymywano w hodowli w warunkach in vitro w postaci sferycznych konglomeratów komórkowych, zwanych kardiosferami (cardiospheres – CSp). Mimo zachęcających wyników uzyskanych w doświadczeniach na zwierzętach, kardiosfery nie znalazły zastosowania w badaniach klinicznych ze względu na znaczne rozmiary ich cząsteczek (50–200 µm). Rutynowe podawanie cząsteczek tej wielkości poprzez naczynia wieńcowe mogło się okazać mało bezpieczne. W związku z tym 3 lata później grupa Marbana zmodyfikowała protokół izolacji i opracowała metodę pozyskiwania zawiesiny pojedynczych komórek progenitorowych z kardiosfer (cardiosphere-derived cells – CDC) [32]. Materiałem wyjściowym do izolacji były biopsje endomiokardialne pobierane od pacjenta drogą przezskórną. Komórki uzyskane w trakcie hodowli in vitro można namnażać w celu przygotowania odpowiedniej ich ilości (dziesiątki milionów) do zastosowania w praktyce klinicznej. Cała procedura zajmuje około 4–6 tygodni, pomimo niewielkiej wyjściowej ilości materiału. Komórki CDC to morfologicznie heterogenna populacja, bogata zarówno w komórki macierzyste, jak i zrębowe serca. W ponad 1000 eksperymentach wykonanych dotąd na zwierzętach nie obserwowano działania proarytmicznego ani nowotworów w związku z podaniem CDC. Rozpoczęła się faza I/II badań klinicznych pod nazwą CADUCEUS (Cardiosphere-Derived aUtologous stem CElls to reverse ventricUlar dySfunction) [33]. Do badania włączono pacjentów po przebytym zawale serca, z uszkodzoną kurczliwością lewej komory i EF około 25–45%. Chorzy otrzymali autologiczne komórki 2–3 miesiące po epizodzie niedokrwienia. W rocznej obserwacji odnotowano zmniejszenie obszaru blizny pozawałowej oraz poprawę kurczliwości i wzrost masy żywego mięśnia w porównaniu z grupą kontrolną leczoną w tradycyjny sposób. Kolejne badanie I fazy w trakcie realizacji (SCIPIO trial – Stem Cell Infusion in Patients with Ischemic cardiOmyopathy) potwierdziło bezpieczeństwo dowieńcowego podawania komórek macierzystych izolowanych z serca [34].Pluripotencjalne komórki macierzyste
Komórki macierzyste można ogólnie scharakteryzować i podzielić na podstawie ich potencjału do odnowy. Chociaż populacja CDC, podobnie jak HSC, należy do multipotencjalnych komórek macierzystych (tzn. wykazuje zdolność do różnicowania tylko w określonym kierunku, np. kardiomiocytów i komórek śródbłonka czy komórek krwiotwórczych), to bezspornie największe możliwości regeneracyjne mają pluripotencjalne komórki macierzyste. Należą do nich ESC i iPSC. Źródłem tych ostatnich są komórki somatyczne (np. fibroblasty, limfocyty), które w wyniku manipulacji molekularnych nabywają morfologicznych i czynnościowych cech komórek macierzystych [35] (ryc. 1.). Warto nadmienić, że to odkrycie zostało wyróżnione w 2012 roku Nagrodą Nobla w dziedzinie medycyny i fizjologii dla J. Gurdona i S. Yamanaki. Zarodkowe komórki macierzyste otrzymuje się natomiast z węzła zarodkowego pobieranego na etapie blastocysty [36]. Pluripotencjalne komórki macierzyste wykazują zdolność do nieograniczonej proliferacji i samoodnowy, mogą różnicować się we wszystkie tkanki pochodzące z trzech listków zarodkowych: ektodermy, endodermy i mezodermy, w tym w kardiomiocyty [37] (ryc. 2.). Pluripotencjalne komórki macierzyste są stosunkowo łatwe do hodowli w warunkach in vitro, sprawnie się dzielą, w związku z czym nietrudno uzyskać odpowiednią ich ilość do zastosowania w terapii. Niestety, z powodu kilku poważnych przeszkód komórki te nie zyskały jeszcze powszechnego uznania w badaniach klinicznych [38]. Po pierwsze, nieograniczona zdolność do podziału w przypadku komórek niezróżnicowanych grozi powstaniem nowotworów. Są to najczęściej guzy o charakterze łagodnym, tzw. potworniaki. Nie można jednak wykluczyć
zanieczyszczenia materiału komórkami o potencjale do transformacji złośliwej. Po drugie, podawanie komórek allogenicznych wiąże się z ryzykiem ich odrzucenia przez układ odpornościowy gospodarza. Stąd zapewnienie trwałego efektu terapii będzie wymagać zastosowania jakiejś formy leczenia immunosupresyjnego. Dodatkowo sposób pozyskiwania zarodkowych komórek macierzystych budzi kontrowersje natury prawno-etycznej [39]. Próbą obejścia tego problemu było właśnie stworzenie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Obecnie wydajność procesu przeprogramowania komórek somatycznych jest jednak bardzo niska i mieści się w zakresie od 0,001% do 0,1%, w zależności od typu komórek i ich wyjściowej ilości [40]. Wątpliwości budzi również metodyka ich przygotowywania. Najczęściej w celu dokonania modyfikacji genetycznej stosuje się wektory wirusowe, których integracja w obręb materiału genetycznego może sprowokować transformację onkogenną komórek. Ten aspekt wymaga więc dopracowania, toczą się obecnie prace nad zastosowaniem nośników episomalnych, cząsteczek białka i krótkoniciowego RNA [41]. Czas potrzebny na przeprogramowanie komórek somatycznych wynosi około 4 miesięcy. Przy całościowej ocenie metody nie można również pominąć wysokich kosztów terapii przygotowywanej każdorazowo dla konkretnego pacjenta [42].
Mimo wszystkich ograniczeń, potencjał regeneracyjny komórek pluripotencjalnych stanowi o nieustającym zaangażowaniu środowiska naukowego w badania nad wykorzystaniem ich możliwości terapeutycznych w praktyce klinicznej. Nie jest to jednak kwestia do rozstrzygnięcia w ciągu najbliższych kilku lat.Zadania na przyszłość
Badania kliniczne I generacji nie przyniosły jednoznacznych rezultatów. Wykazały niewątpliwie, że terapia komórkowa jest możliwa i stosunkowo bezpieczna u pacjentów z zaawansowaną chorobą serca, przy użyciu inwazyjnych metod leczenia. Jednocześnie mamy świadomość słabych punktów dotychczasowych badań. Należą do nich:
1) brak ujednoliconych i wystandaryzowanych procedur dotyczących przygotowania komórek (populacja nieselekcjonowana vs komórki wzbogacane we frakcje progenitorowe, hodowla w warunkach in vitro), dawki terapii (ograniczona dostępność komórek i ich potencjał proliferacyjny), drogi podania (bezpośrednie – dożylna, dowieńcowa, iniekcje epi- i endokardialne, oraz pośrednie – mobilizacja komórek macierzystych za pomocą czynników wzrostu) oraz okna terapeutycznego (podanie w momencie incydentu wieńcowego vs w okresie odległym) [43];
2) utrata komórek od momentu ich pobrania do zagnieżdżenia w tkance docelowej; szacuje się, że po upływie doby w sercu pozostaje mniej niż 10% komórek, niezależnie od drogi podania ani rodzaju stosowanych komórek; z tego po tygodniu ginie kolejnych 90%; jest to wynikiem wymywania komórek drogą naczyń żylnych, mechanicznego wyrzucania z miejsca wstrzyknięcia oraz apoptozy związanej z niedokrwieniem, brakiem kontaktu z elementami macierzy pozakomórkowej i stanem zapalnym [44];
3) wątpliwy potencjał kardiogenny komórek macierzystych szpiku kostnego; tworzenie nowych naczyń krwionośnych i mięśnia sercowego zachodzi w tej sytuacji wyjątkowo rzadko, jeśli w ogóle jest możliwe; nie przekreśla to jednak miejsca tych populacji w terapii regeneracyjnej np. u pacjentów w wieku podeszłym, kiedy celem nadrzędnym może być nie tyle odtworzenie utraconego mięśnia sercowego, ile poprawa jakości życia; rozważany mechanizm działania: poprzez wydzielane cytokiny i czynniki wzrostu – kardioprotekcja, angiogeneza, modulacja zapalenia, poprawa metabolizmu tkankowego; możliwa jest również fuzja komórek dawcy i biorcy [45].
Niebagatelną sprawą jest również kwestia badań przedklinicznych, których wyniki nie przełożyły się na powodzenie terapii regeneracyjnej u ludzi. Na podstawie dotychczasowych doświadczeń trudno powiedzieć, jaki model zwierzęcy byłby idealny do wykorzystania. Zwyczajowo zwierzęta używane do eksperymentów są jednakowe pod względem genetycznym, młode, zdrowe, niepoddawane farmakoterapii z powodu chorób dodatkowych i utrzymywane w ściśle zdefiniowanych warunkach środowiska. Nie jest również znany naturalny zwierzęcy model choroby niedokrwiennej serca. Najczęściej korzysta się z mechanicznego zamknięcia tętnicy wieńcowej, co nie zawsze oddaje istotę problemu klinicznego [43].
Mając świadomość wielu niedoskonałości metody, nie można zapominać, że komórki macierzyste to potężne narzędzie, które optymalnie zastosowane może okazać się krokiem milowym w leczeniu niektórych chorób przewlekłych. Odkrycie CSC i prace nad wdrożeniem pluripotencjalnych komórek macierzystych do praktyki klinicznej otwierają nowy rozdział w terapii regeneracyjnej serca (tab. 1.). Konieczne są jednak dalsze badania, przede wszystkim duże próby kliniczne z randomizacją, aby rozstrzygnąć wątpliwości i zapewnić tej formie leczenia stałe miejsce w terapii. Piśmiennictwo
1. Roger VL, Go AS, Lloyd-Jones DM i wsp. Heart disease and stroke statistics-2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation 2011; 123: e18-e209.
2. Caspi O, Huber I, Kehat I i wsp. Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts. J Am Coll Cardiol 2007; 50: 1884-1893.
3. Nelson TJ, Martinez-Fernandez A, Yamada S i wsp. Rapair of acute myocardial infarction by human stemness factors induced pluripotent stem cells. Circulation 2009; 120: 408-416.
4. Muller-Ehmsen J, Peterson KL, Kedes L i wsp. Rebuilding a damaged heart: long-term survival of transplanted neonatal rat cardiomyocytes after myocardial infarction and effect on cardiac function. Circulation 2002; 105: 1720-1726.
5. Menasche P, Alfieri O, Janssens S i wsp. The Myoblast Autologous grafting in Ischemic Cardiomyopathy (MAGIC) trial: first randomized placebo-controlled study of myoblast transplantation. Circulation 2008; 117: 1189-1200.
6. Lunde K, Solheim S, Aakhus S i wsp. Intracoronary injection of mononuclear bone-marrow cells in acute myocardial infarction. N Engl J Med 2006; 355: 1199-1209.
7. Katritsis DG, Sotiropoulou PA, Karvouni E i wsp. Transcoronary transplantation of autologous mesenchymal stem cells and endothelial progenitors into infracted human myocardium. Catheter Cardiovasc Interv 2005; 65: 321-329.
8. Smith RR, Barile L, Cho HC i wsp. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens. Circulation 2007; 115: 896-908.
9. Murry CE, Reinecke H, Pabon LM. Regeneration gaps: observations on stem cells and cardiac repair. J Am Coll Cardiol 2006; 47: 1777-1785.
10. Olivetti G, Melissari M, Capasso JM i wsp. Cardiomyopathy of the aging human heart. Circ Res 1991; 68: 1560-1568.
11. Whelan RS, Kaplinskiy V, Kitsis RN. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol 2010; 72: 19-44.
12. Olivetti G, Cigola E, Maestri R i wsp. Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart. J Mol Cell Cardiol 1996; 28: 1463-1477.
13. Adler CP, Costabel U. Cell number in human heart atrophy, hypertrophy and under the influence of cytostatics. Recent Adv Stud Cardiac Struct Metab 1975; 6: 343-355.
14. Adler CP. Relationship between deoxyribonucleic acid content and nucleoli in human heart muscle cells and estimation of cell number during cardiac growth and hyperfunction. Recent Adv Stud Cardiac Struct Metab 1975; 8: 373-386.
15. Bergmann O, Bhardwaj RD, Bernard S i wsp. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science 2009; 324: 98-102.
16. Menasche P, Hagege AA, Scorsin M i wsp. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet 2001; 357: 279-280.
17. Menasche P, Alfieri O, Janssens S i wsp. The Myoblast Autologous Grafting in Ischemic Cardiomyopathy (MAGIC) trial: first randomized placebo-controlled study of myoblast transplantation. Circulation 2008; 117: 1189-1200.
18. Menasche P. Skeletal myoblasts for cardiac repair: act II? J Am Coll Cardiol 2008; 52: 1881-1883.
19. Strauer BE, Brehm M, Zeus T i wsp. Intracoronary, human autologous stem cell transplantation for myocardial regeneration following myocardial infarction. Dtsch Med Wochenschr 2001; 126: 932-938.
20. Civin CI, Gore SD. Antigenic analysis of hematopoiesis: a review. J Hematother 1993; 2: 137-144.
21. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I i wsp. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8: 315-317.
22. Crosby JR, Kaminski WE, Schatteman G i wsp. Endothelial cells of hematopoietic origin make a significant contribution to adult blood vessel formation. Circ Res 2000; 87: 728-730.
23. Dimmeler S, Zeiher AM. Cell therapy of acute myocardial infarction: open questions. Cardiology 2009; 113: 155-160.
24. Martin-Rendon E, Brunskill SJ, Hyde CJ i wsp. Autologous bone marrow stem cells to treat acute myocardial infarction: a systematic review. Eur Heart J 2008; 29: 1807-1818.
25. Losardo DW, Schatz RA, White CJ i wsp. Intramyocardial transplantation of autologous CD34+ stem cells for intractable angina: a phase I/IIa double-blind, randomized controlled trial. Circulation 2007; 115: 3165-3172.
26. van Ramshorst J, Bax JJ, Jeroen J i wsp. Intramyocardial bone marrow cell injection for chronic myocardial ischemia: a randomized controlled trial. JAMA 2009; 301: 1997-2004.
27. Murry CE, Soonpaa MH, Reinecke H i wsp. Hematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts. Nature 2004; 428: 664-668.
28. Williams AR, Hare JM. Mesenchymal stem cells: Biology, pathophysiology, translational findings, and therapeutic implications for cardiac disease. Circ Res 2011; 109: 923-940.
29. Chen SL, Fang WW, Ye F i wsp. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. Am J Cardiol 2004; 94: 92-95.
30. Beltrami AP, Barlucchi L, Torella D i wsp. Adult cardiac stem cells are multipotent and suport myocardial regeneration. Cell 2003; 114: 763-776.
31. Messina E, De Angelis L, Frati G i wsp. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res 2004; 95: 911-921.
32. Smith RR, Barile I, Cho HC i wsp. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens. Circulation 2007; 115: 896-908.
33. CADUCEUS. Cardiosphere-Derived aUtologous stem CElls to reverse ventricUlar dySfunction (NCT00893360) www.clinicaltrials.gov
34. SCIPIO. Stem Cell Infusion in Patients with Ischemic cardiOmyopathy (NCT00474461) www.clinicaltrials.gov
35. Park IH, Zhao R, West JA i wsp. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008; 451: 141-146.
36. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS i wsp. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282: 1145-1147.
37. Murry CE, Keller G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell 2008; 132: 660-680.
38. Nussbaum J, Minami E, Laflamme MA i wsp. Transplantation of undifferentiated murine embryonic stem cells in the heart: teratoma formation and immune response. Faseb J 2007; 21: 1345-1357.
39. Passier R, van Laake LW, Mummery CL. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature 2008; 453: 322-329.
40. Yoshida Y, Yamanaka S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol 2011; 50: 327-332.
41. Shi Y, Do JT, Desponts C i wsp. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 2008; 2: 525-528.
42. Freund C, Mummery CL. Prospects for pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in cardiac cell therapy and as disease models. J Cell Biochem 2009; 107: 592-599.
43. Lovell MJ, Mathur A. Cardiac stem cell therapy: progress from bench to bedside. Heart 2010; 96: 1531-1537.
44. Pagani FD, DerSimonian H, Zawadzka A i wsp. Autologous skeletal myoblasts transplanted to ischemia-damaged myocardium in humans: histological analysis of cell survival and differentiation. J Am Coll Cardiol 2003; 41: 879-888.
45. Gnecchi M, Zhang Z, Ni A i wsp. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res 2008; 103: 1204-1219.
