BADANIA KLINICZNE I DOŚWIADCZALNE W CHOROBACH SERCA, PŁUC I NACZYŃ
The impact of biofilm formation by Gram-positive bacteria on patient outcome following cardiac surgery

Wstęp

Zdolność do tworzenia biofilmu jest powszechnie występującą cechą patogenności bakterii. Biofilm jest wspólnotą komórek bakteryjnych, charakteryzującą się określoną strukturą zewnętrzną zatopioną w macierzy zewnątrzkomórkowej, wytworzonej przez elementy należące do tej wspólnoty i przytwierdzoną do powierzchni ożywionych lub nieożywionych [1]. Zapewnia budującym go bakteriom optymalne środowisko wzrostu i rozwoju, dostępność składników pokarmowych, łatwą wymianę materiału genetycznego oraz chroni przed układem immunologicznym gospodarza – utrudnia fagocytozę i opsonizację [2]. Komórki bakterii budujących biofilm są ponadto bardziej oporne na działanie antybiotyków niż formy planktoniczne tego samego gatunku [3–7]. Biofilm jest w stanie równowagi dynamicznej. Pod wpływem czynników zewnętrznych fragmenty błony biologicznej, składające się z dużych agregatów bakteryjnych, odrywają się i mogą przemieszczać się na znaczne odległości [8–10]. Jeśli odbywa się to w ciele człowieka, dochodzi do indukcji zakażeń o różnej lokalizacji.

U pacjentów leczonych kardiochirurgicznie występuje potencjalnie większe ryzyko rozwinięcia infekcji szpitalnej niż u innych chorych. Wynika to z posiadania dużej liczby ran chirurgicznych (po sternotomii, po pobraniu żyły odpiszczelowej, tętnicy promieniowej), inwazyjnego monitorowania hemodynamicznego oraz częstego stosowania kontrapulsacji wewnątrzaortalnej. Zakażeniu może sprzyjać również nieodpowiednia antybiotykoterapia w okresie okołooperacyjnym [11]. Przyczynia się ona do selekcji wysokoopornych patogenów, które wywołują infekcje o znacznie cięższym przebiegu i wyższej śmiertelności.

Zastosowanie sztucznych materiałów, takich jak: zastawkowe protezy mechaniczne, grafty naczyniowe, urządzenia wspomagające prace niewydolnego serca, szwów metalowych rutynowo stosowanych w kardiochirurgii również zwiększa ryzyko rozwoju zakażenia wywołanego przez patogeny produkujące biofilm.

Cel pracy

Głównym celem podjętych badań było przeanalizowanie, czy istnieje związek pomiędzy produkcją biofilmu przez wybrane szczepy ziarenkowców Gram-dodatnich wyizolowanych od pacjentów leczonych kardiochirurgicznie a niekorzystnym przebiegiem okresu pooperacyjnego rozumianym jako wystąpienie zgonu, zakażenia tkanki podskórnej, zakażenia układu oddechowego, bakteriemii czy konieczności wykonania resternotomii.

Materiał i metody

Pacjenci

Grupę objętą analizą stanowiło 84 pacjentów leczonych kardiochirurgicznie w okresie od sierpnia 2008 do września 2009 r. W skład badanej populacji wchodziło 59 mężczyzn i 25 kobiet w wieku 15–83 lat (średnia wieku 60,79 ±11,70 roku). Warunkiem kwalifikacji do grupy badanej było stwierdzenie zakażenia szczepem Gram-

-dodatnim. Od każdego pacjenta w toku hospitalizacji wyizolowano 1–7 szczepów bakteryjnych różnych gatunków. Chorzy zostali poddani 24 operacjom wieńcowym, 36 operacjom zastawkowym (w tym operacjom wymiany kilku zastawek serca), 6 operacjom wieńcowym z jednoczesną wymianą zastawki oraz 15 innym zabiegom, w tym 7 transplantacjom serca.

Izolaty bakteryjne

Od pacjentów uzyskano 147 szczepów bakterii Gram-dodatnich. Najliczniejszą grupę stanowiły izolaty Staphylococcus epidermidis (29,93%), w dalszej kolejności były to izolaty Staphylococcus aureus (25,17%), gronkowce

koagulazo-ujemne (ang. coagulase-negative staphylococci – CNS), których nie charakteryzowano do gatunku

(19,05%), Enterococcus spp. (18,37%) oraz inne (7,48%).

Szczegółowej analizie mikrobiologicznej poddano szczepy Staphylococcus epidermidis oraz Enterococcus faecalis,

Enterococcus faecium i Enterococcus gallinarum.

Materiały do badań mikrobiologicznych uzyskiwano od badanej grupy zarówno w bezpośrednim, jak i odległym okresie pooperacyjnym. Bakterie najczęściej izolowano z krwi oraz z ran klatki piersiowej.

Identyfikacja bakterii Gram-dodatnich

Identyfikacja gronkowców była prowadzona przy użyciu testów ID 32 Staph (bioMérieux, Francja) oraz testu lateksowego Slidex Staph Plus (bioMérieux, Francja). Enterokoki identyfikowano na podstawie testów Api 20 Strept, rozkładu eskuliny, wzrostu w 6,5-procentowym chlorku sodu oraz wykrywania L-pyrolidonylo-aryloamidazy.

Przechowywanie izolatów bakteryjnych

Wszystkie uzyskane szczepy bakterii Gram-dodatnich, po ich wcześniejszej identyfikacji, przechowywano do dalszych analiz w głębokim zamrożeniu w temperaturze –70°C w podłożu z wyciągu mózgowo-sercowego (ang. brain

heart infusion – BHI). Do dalszych badań wyżej wymienione szczepy ożywiano poprzez dwukrotny pasaż na podłożu Columbia Agar i inkubację w warunkach tlenowych w temperaturze 35°C przez 24 godz.

Zmodyfikowana metoda Freemana oceniająca ekspresję śluzu zewnątrzkomórkowego

Wszystkie szczepy Staphylococcus epidermidis oraz Enterococcus spp. przebadano metodą Freemana [12]. Szczep wzorcowy Staphylococcus epidermidis ATCC 3598, o udowodnionej zdolności do produkcji biofilmu, stanowił kontrolę dodatnią. Czystą hodowlę poszczególnych badanych szczepów, uzyskaną po wcześniejszej inkubacji na podłożu Columbia Agar, posiewano na podłoże z dodatkiem czerwieni kongo (ang. congo red agar – CRA). Skład tego podłoża przygotowano zgodnie ze zmodyfikowaną metodą Freemana, na bazie TSA (bioMérieux, Francja), z dodatkiem sacharozy w ilości 36 g/l oraz czerwieni kongo w ilości 0,8 g/l. Następnie inkubowano je w temperaturze 35°C w warunkach tlenowych przez 24 godz. Po pierwszej dobie inkubację przedłużano o kolejne 24 godz. w temperaturze pokojowej. Po 2 dobach oceniano morfologię kolonii. Dodatni wynik doświadczenia (+) uzyskano, gdy badane szczepy rosły w postaci czarnych kolonii (tak jak szczep wzorcowy). Pojawienie się czarnych kolonii oznaczało

ekspresję biofilmu na poziomie fenotypu. Za wynik negatywny (–) uznawano wzrost w postaci czerwonych kolonii – takie szczepy nie produkowały śluzu zewnątrzkomórkowego. Wzrost w postaci czarnych i czerwonych kolonii jednocześnie charakteryzował heterogenną populację, oznaczoną jako ±.

Zmodyfikowana metoda według Christensena

Zdolność do tworzenia biofilmu przez Staphylococcus epidermidis i Enterococcus spp. oceniano w metodzie półilościowej z fioletem krystalicznym [13]. Po uzyskaniu czystej hodowli badanego szczepu na podłożu z krwawym agarem przesiewano ją do 5 ml podłoża płynnego – TSB (bioMérieux, Francja) z 0,25-procentową glukozą i inkubowano ją w warunkach tlenowych, w temperaturze 35°C przez 18 godz. Następnie płynną hodowlę rozcieńczano w TSB z 0,25-procentową glukozą w stosunku 1 : 40. Na sterylne mikropłytki nanoszono po 200 µl rozcieńczonej hodowli szczepu i inkubowano przez 9 godz. w warunkach tlenowych, w temperaturze 35°C. Po inkubacji studzienki płukano trzykrotnie sterylnym PSB w temperaturze pokojowej (po 200 µl na pojedyncze płukanie do każdej studzienki). Utworzony na dnie biofilm wybarwiono fioletem krystalicznym przez 15 min, po czym trzykrotnie płukano wodą destylowaną. Po osuszeniu studzienek i wypełnieniu ich 200 µl 96-procentowego sterylnego etanolu odczytywano gęstość optyczną za pomocą Microplate Manager 4.0, Bio-Rad Laboratories Inc. model 550 przy długości fali 550 nm. Kontrolą dodatnią w opisanej metodzie był szczep wzorcowy Staphylococcus epidermidis ATCC 3598. Kontrolę ujemną stanowiła pusta studzienka.

Analiza wpływu zdolności do tworzenia biofilmu przez szczepy Staphylococcus epidermidis i Enterococcus spp. na niekorzystny przebieg okresu pooperacyjnego

W celu zbadania ewentualnego wpływu zdolności do tworzenia biofilmu przez wybrane bakterie na niekorzystny przebieg okresu pooperacyjnego, rozumiany jako wystąpienie zgonu, zakażenie tkanki podskórnej, zakażenie układu oddechowego, bakteriemii lub konieczność wykonania resternotomii, utworzono następujące grupy pacjentów: I grupę stanowili pacjenci, od których wyizolowano Staphylococcus epidermidis wykazujący ekspresję śluzu zewnątrzkomórkowego (opisanego konkretną wartością liczbową); II grupa objęła chorych, od których izolowano Enterococcus spp. produkujący biofilm (opisany konkretną wartością liczbową); III grupa to pacjenci, od których hodowano Staphylococcus epidermidis, a IV – Enterococcus spp. niewykazujący ekspresji śluzu; w grupie V umieszczono chorych, od których wyizolowano Staphylococcus epidermidis, a w VI – Enterococcus spp. wykazujący fenotypowo cechę zdolności do tworzenia biofilmu; grupa VII powstała w wyniku połączenia grup V i VI. Skontrastowano ze sobą następujące grupy: I i III, II i IV, V i III, VI i IV, VII i III + IV.

Analiza statystyczna

Wpływ zdolności do tworzenia biofilmu na parametry niekorzystnego przebiegu okresu pooperacyjnego badano za pomocą analizy regresji logistycznej. Wyniki prezentowane są jako iloraz szans (ang. odds ratio – OR) wystąpienia niekorzystnego zdarzenia wraz z jego 95-procentowym przedziałem ufności (ang. 95% confidence interval – 95% CI) i poziomem istotności (p < 0,05).

Obliczenia przeprowadzono przy użyciu pakietu statystycznego R 2.9.1 (R Development Core Team, 2009.

R: A language and environment for statistical computing.

R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org).

Wyniki

W populacji Staphylococcus epidermidis 61% szczepów wykazywało zdolność do produkcji śluzu zewnątrzkomórkowego, rosnąc w postaci czarnych kolonii na podłożu z czerwienią kongo; 22,7% szczepów wykazywało heterogenny wzrost w postaci jednocześnie czarnych i czerwonych kolonii; 15,9% badanych szczepów nie wykazywało fenotypowo zdolności do tworzenia śluzu, rosnąc jako czerwone kolonie. Wśród Enterococcus spp. mniej niż 41% charakteryzowało się zdolnością do produkcji śluzu, 55% dało wynik (–) (czerwone kolonie), a 3,7% wykazywało heterogenny wzrost (jednoczasowy wzrost na czarno i czerwono).

Wszystkie szczepy, które w powyższej metodzie dały wynik (+) lub wykazywały heterogenny typ wzrostu, przebadano metodą ilościową. Zestawienie gęstości utworzonego biofilmu przez Staphylococcus epidermidis i Enterococcus spp. przedstawiają tabele I i II.

Wszystkie wartości utworzonego biofilmu w nich podane mają charakter względny, powstały w wyniku odjęcia od wartości bezwzględnej wielkości charakteryzującej kontrolę ujemną i wynoszącą dla Staphylococcus epidermidis średnio 0,23, a dla Enterococcus spp. 0,056. Kontrolę dodatnią stanowił szczep wzorcowy Staphylococcus epidermidis ATCC 35984, o udowodnionej zdolności do produkcji biofilmu. Wartość utworzonego biofilmu dla wspomnianego szczepu wzorcowego wyniosła 1,328. Maksymalna gęstość optyczna roztworu powstałego po wybarwieniu fioletem krystalicznym utworzonego biofilmu przez szczepy Staphylococcus epidermidis i odczytywana przy długości fali 550 nm wyniosła 3,5. Wartość minimalna sięgnęła 0,272 (średnio 1,013 ±0,74). Dla enterokoków największą gęstość optyczną roztworu uzyskano na poziomie 0,386, a najmniejszą na poziomie 0,133 (średnio 0,233 ±0,075).

Wyniki analizy wpływu zdolności do tworzenia biofilmu na wystąpienie zgonu, zakażenia tkanki podskórnej, zakażenia układu oddechowego, bakteriemii lub konieczności wykonania resternotomii przedstawia tabela III.

Dla chorych, od których wyizolowano Staphylococcus epidermidis produkujący biofilm, OR wystąpienia zakażenia tkanki podskórnej był równy 6,8 (p = 0,105).

Pacjenci, którzy byli zakażeni Staphylococcus epidermidis lub Enterococcus spp. produkującymi biofilm, mieli OR wystąpienia zakażenia tkanki podskórnej równy 2,364

(p = 0,209).

Dyskusja

Zdolność do tworzenia biofilmu jest powszechnie znaną cechą patogenności bakterii. Ma ona istotne znaczenie – zwłaszcza w przypadku słabych patogenów, takich jak gronkowiec skórny, u którego jest to jedyny czynnik patogenności. Rosnąc na standardowych podłożach, wykorzystywanych w procesie identyfikacji, gronkowce nie mają śluzowej morfologii. Żeby scharakteryzować je pod kątem możliwości formowania biofilmu, konieczne jest zastosowanie zmodyfikowanej metody Freemana. Bakterie, rosnąc na podłożu wzbogaconym, produkują śluz, który tworzy barwne (czarne) kompleksy z polisacharydowymi komponentami śluzu [12]. Zaletą wspomnianej metody jest nie tylko jej prostota, ale również ogromna powtarzalność. W wyniku przeprowadzenia powyższego testu (CRA) ustalono, że w badanej populacji szczepów Staphylococcus epidermidis 61,36% charakteryzowało się zdolnością do tworzenia śluzu zewnątrzkomórkowego, a 22,75% rosnąc na podłożu CRA, ujawniło heterogenny typ kolonii. W grupie enterokoków odsetek szczepów rosnących w postaci czarnych kolonii wyniósł 40,74%; 55,56% badanych szczepów nie wytwarzało śluzu. Dane z piśmiennictwa odnoszące się do szczepów pochodzących od chorych leczonych kardiochirurgicznie i produkujących biofilm są nieliczne. Jedyna dostępna na ten temat publikacja pochodzi ze Szwecji z 2007 r. i podaje, że 52% izolatów Staphylococcus epidermidis uzyskanych od chorych reoperowanych wykazywało dodatnią reakcję w teście z czerwienią kongo [14]. Inne doniesienia pokazują, że średnio 36,8–57,5% szczepów gronkowca skórnego wykazuje śluzową morfologię na podłożu CRA [15–19]. Należy jednak odnotować, że powyższe wyniki dotyczą bakterii wyizolowanych od pacjentów poddawanych reoperacjom ortopedycznym lub pochodzą od chorych, u których stwierdzono zakażenie krwi związane z długim utrzymywaniem cewników naczyniowych. W opinii autorów powyższa metoda powinna zostać włączona do algorytmu diagnostyki zakażeń wywołanych przez słabe patogeny, takie jak CNS, w tym Staphylococcus epidermidis. Dotyczy to zwłaszcza sytuacji, w których na wyniku posiewu z rany pooperacyjnej widnieje sugestia, że otrzymany gronkowiec skórny jest wynikiem zanieczyszczenia powstałego podczas pobierania materiału. Rozszerzenie diagnostyki o test z czerwienią kongo pozwoli odpowiedzieć na pytanie, czy dany Staphylococcus epidermidis tworzy biofilm, co jest równoznaczne z jego silną patogennością. Spowoduje to również wdrożenie leczenia antybiotykami w celu uniknięcia poważnych powikłań infekcyjnych stanowiących zagrożenie życia dla pacjentów po operacjach kardiochirurgicznych.

Głównym celem pracy była próba ustalenia związku pomiędzy zdolnością do tworzenia biofilmu przez szczepy bakterii wyhodowane od chorych zakażonych, tj. szczepy Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, a niekorzystnym przebiegiem okresu pooperacyjnego rozumianego jako wystąpienie jednego z pięciu punktów końcowych (zgonu, resternotomii, zakażenia tkanki podskórnej, zakażenia układu oddechowego i bakteriemii).

W grupie pacjentów, od których wyizolowano Staphylococcus epidermidis tworzący biofilm, zauważono skłonność do częstszego występowania zakażenia tkanki podskórnej (OR = 6,8) w stosunku do chorych, których Staphylococcus epidermidis nie wykazywał ekspresji śluzu zewnątrzkomórkowego. Stosunkowo niski poziom istotności (p = 0,1) może świadczyć o sile tej tendencji, bowiem prawdopodobieństwo, że wynik ten jest przypadkiem, wynosi tylko 10%. Podobna skłonność cechowała grupę, w której mieścili się pacjenci zarówno z gronkowcem skórnym, jak i enterokokami o fenotypie biofilm (+). Ponad dwukrotnie częściej (OR = 2,36) stwierdzano u nich zakażenie tkanki podskórnej w porównaniu z populacją chorych, których bakterie nie wykazywały zdolności do tworzenia biofilmu. Brak istotności statystycznej w wyżej opisanych przypadkach najprawdopodobniej wynika z faktu, że poszczególne porównywane ze sobą grupy były stosunkowo nieliczne. Jak do tej pory, nie ma żadnych danych w piśmiennictwie dotyczących wpływu występowania biofilmu na wystąpienie powikłań pooperacyjnych w kardiochirurgii, w związku z czym trudno dyskutować nad otrzymanymi wynikami. Aby udowodnić ponad wszelką wątpliwość prawdziwość zaobserwowanych tendencji, zaplanowano rozszerzenie badania o kolejne szczepy Staphylococcus epidermidis i Enterococcus spp. Wypływające z takiego badania wnioski mogłyby mieć kluczowe znaczenie dla praktyki nie tylko kardiochirurgicznej.

Wnioski

Większość szczepów Staphylococcus epidermidis i mniej niż połowę enterokoków charakteryzowała zdolność do produkcji biofilmu, co mogło stanowić o ich zwiększonej patogenności i umożliwiać zakażenie materiałów stosowanych w kardiochirurgii – zarówno pochodzenia sztucznego, jak i naturalnego.

Diagnostyka zakażeń spowodowanych przez CNS powinna zostać rozszerzona o test wykrywający zdolność do produkcji śluzu zewnątrzkomórkowego.

Stwierdzenie zakażenia Staphylococcus epidermidis lub Enterococcus spp. wykazującym ekspresję śluzu zewnątrzkomórkowego może zwiększać prawdopodobieństwo wystąpienia zakażenia tkanki podskórnej po zabiegu kardiochirurgicznym.

Piśmiennictwo

1. Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science 1999; 284: 1318-1322.

2. Jefferson KK. What drives bacteria to produce a biofilm? FEMS Microbiol Lett 2004; 236: 163-173.

3. Farber BF, Kaplan MH, Clogston AG. Staphylococcus epidermidis extracted slime inhibits the antimicrobial action of glycopeptide antibiotics. J Infect Dis 1990; 161: 37-40.

4. Darouiche RO, Dhir A, Miller AJ, Landon GC, Raad II, Musher DM. Vancomycin penetration into biofilm covering infected prostheses and effect on bac­te­ria. J Infect Dis 1994; 170: 720-723.

5. Anwar H, Strap JL, Costerton JW. Eradication of biofilm cells of Staphylococcus aureus with tobramycin and cephalexin. Can J Microbiol 1992; 38: 618-625.

6. Anwar H, Strap JL, Costerton JW. Establishment of aging biofilms: possible mechanism of bacterial resistance to antimicrobial therapy. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36: 1347-1351.

7. Gilbert P, Brown M. Mechanisms of the protection of bacterial biofilms from antimicrobial agents. P 118-130 In: Lappin-Scott HM, Costerton J (eds). Microbial biofilms. 1st ed. Cambridge University Press, New York.

8. Donlan RM, Costerton JW. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev 2002; 15: 167-193.

9. Dunne WM Jr. Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately? Clin Microbiol Rev 2002; 15: 155-166.

10. Costerton JW, Lewandowski Z, DeBeer D, Caldwell D, Korber D, James G. Biofilms, the customized microniche. J Bacteriol 1994; 176: 2137-2142.

11. Dunagan WC, Woodward RS, Medoff G, Gray JL, Casabar E, Lawrenz C, Spitznagel E, Smith MD. Antibiotic misuse in two clinical situations: positive blood culture and administration of aminoglycosides. Rev Infect Dis 1991; 13: 405-412.

12. Freeman DJ, Falkiner FR, Keane CT. New method for detecting slime pro­duction by coagulase negative staphylococci. J Clin Pathol 1989; 42: 872-874.

13. Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ, Baddour LM, Barrett FF, Melton DM, Beachey EH. Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices. J Clin Microbiol 1985; 22: 996-1006.

14. Soderquist B. Surgical site infections in cardiac surgery: microbiology. APMIS 2007; 115: 1008-1011.

15. Arciola CR, Campoccia D, Gamberini S, Cervellati M, Donati E, Montanaro L.

Detection of slime production by means of an optimised Congo red agar plate test based on a colourimetric scale in Staphylococcus epidermidis clinical isolates genotyped for ica locus. Biomaterials 2002; 23: 4233-4239.

16. Arciola CR, Campoccia D, Montanaro L. Detection of biofilm-forming strains of Staphylococcus epidermidis and S. aureus. Expert Rev Mol Diagn 2002; 2: 478-484.

17. Arciola CR, Campoccia D, Gamberini S, Donati ME, Baldassarri L, Monta­naro L. Occurrence of ica genes for slime synthesis in a collection of Sta­phylococcus epidermidis strains from orthopedic prosthesis infections. Acta Orthop Scand 2003; 74: 617-621.

18. Arciola CR, Baldassarri L, Montanaro L. Presence of icaA and icaD genes and slime production in a collection of staphylococcal strains from catheter-associated infections. J Clin Microbiol 2001; 39: 2151-2156.

19. Arciola CR, Campoccia D, Gamberini S, Donati ME, Pirini V, Visai L, Speziale P,

Montanaro L. Antibiotic resistance in exopolysaccharide-forming Staphy­lo­coccus epidermidis clinical isolates from orthopaedic implant infections. Biomaterials 2005; 26: 6530-6535.