BADANIA KLINICZNE I DOŚWIADCZALNE W CHOROBACH SERCA, PŁUC I NACZYŃ
Preliminary ultrastructural investigations of cardiomyocytes from children with different types of congenital heart malformations

Wstęp
W populacji światowej rodzi się rocznie około 1% dzieci z różnego rodzaju wrodzonymi wadami serca. Rocznie, w Klinice Kardiochirurgii Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi z powodu różnego rodzaju wrodzonych wad serca operowanych jest około 250 dzieci. Wrodzone wady serca powstają pomiędzy 6. a 8. tygodniem życia płodowego, w okresie formowania się układu sercowo-naczyniowego. W zależności od rodzaju wady, jej manifestacja kliniczna może pojawiać się bezpośrednio po urodzeniu, w okresie dziecięcym lub, jeśli pacjent przeżyje, po osiągnięciu dojrzałości. Wady wrodzone, ze względu na występowanie zaburzeń hemodynamicznych, mogą w sposób istotny wpływać na prenatalny i pourodzeniowy rozwój dziecka.
Badania ultrastruktury mięśnia sercowego są prowadzone od wielu lat. Jednak w bazie MEDLINE na 3169 publikacji z lat 1965–2005 dotyczących ultrastrukturalnych badań serca u ludzi zarejestrowano jedynie 23 odnoszące się do pacjentów z tetralogią Fallota i ani jednej hipoplazji lewego serca. Większość prac zajmujących się problematyką molekularnych i komórkowych mechanizmów powstawania wrodzonych wad serca opiera się na badaniach modelu zwierzęcego lub komórek pochodzących z hodowli tkankowych.


Cel pracy
Celem podjętych badań jest określenie charakteru morfologicznych zmian w kardiomiocytach dzieci z wrodzonymi wadami serca.

Materiał i metody
Badania przeprowadzono na fragmentach mięśnia sercowego, przeznaczonych do rutynowej diagnostyki patomorfologicznej, uzyskanych śródoperacyjnie w trakcie kardiochirurgicznej korekcji wrodzonych wad serca. Do badań kwalifikowano pacjentów z wadami niesiniczymi i siniczymi. Przebadano materiał pochodzący od 5 dzieci operowanych z powodu tetralogii Fallota (ang. tetralogy of Fallot – TOF), 6 dzieci operowanych z powodu zespołu niedorozwoju lewego serca (ang. hypoplastic left heart syndrome – HLHS) i 4 dzieci operowanych z powodu ubytku międzykomorowego (ang. ventricual septal defect – VSD). Wiek dzieci wahał się w granicach 11 dni – 6,5 roku. Fragmenty tkanek były niezwłocznie po pobraniu utrwalane przez 2 godziny w temperaturze 4°C, w 5-procentowym aldehydzie glutarowym z dodatkiem formaldehydu, następnie dotrwalane czterotlenkiem osmu. Po zatopieniu w Eponie krojono je na skrawki półcienkie o grubości 1 µm i cienkie o grubości 60 nm. Skrawki cienkie kontrastowano automatycznie w aparacie Ultrastainer LKB octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Następnie oglądano je w transmisyjnym mikroskopie elektronowym Philips EM301. Analizie morfologicznej poddano przede wszystkim te fragmenty preparatów, w których widoczne były podłużne przekroje włókien mięśniowych. W przekrojach poprzecznych badano jedynie, czy zachowany jest regularny układ włókien w poszczególnych częściach sarkomerów.
Zgodę na przeprowadzenie badań wydała Komisja Bioetyki Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi.

Wyniki
Ultrastruktura kardiomiocytów w badanych grupach różniła się w zależności od rodzaju wady. W przypadku ubytków międzykomorowych (VSD) w kardiomiocytach nie stwierdzono istotnych odchyleń od prawidłowego obrazu. Układ morfologiczny włókien oraz innych organelli komórkowych był typowy (ryc. 1.).
W przypadku kardiomiocytów pochodzących z dwóch pozostałych grup (TOF, HLHS) obserwowano zmiany zarówno w obrębie cytoplazmy, jak i przestrzeni pozakomórkowej.
W obrębie cytoplazmy odchylenia od stanu prawidłowego dotyczyły przede wszystkim mitochondriów. Obserwowano ogniska hipertrofii mitochondriów, w obrębie których dochodziło do znacznego zwiększenia ich liczby. W ogniskach uszkodzenia profile mitochondrialne były kształtu owalnego. Ich przedział wewnętrzny był poszerzony. Macierz mitochondrialna miała niewielką gęstość elektronową w porównaniu z grupą VSD. W ogniskach zmian była najczęściej jasna, niekiedy częściowo zwakuolizowana. Grzebienie mitochondrialne były wąskie i nieliczne. Błona wewnętrzna mitochondriów wykazywała różny stopień uszkodzenia. W niektórych organellach widoczne było punktowe przerwanie jej ciągłości, w innych natomiast obserwowano formowanie struktur mielinowych, co świadczy o całkowitym zatrzymaniu ich czynności. Nie były natomiast widoczne uszkodzenia w obrębie błony zewnętrznej. Przestrzeń międzybłonowa była najczęściej wąska w porównaniu z mitochondriami kardiomiocytów grupy VSD (ryc. 2.).
Miofilamenty w komórkach grup TOF i HLHS miały sporadycznie niespecyficzny układ. Były one równolegle ułożone, jednak nie wykazywały charakterystycznego dla sarkomerów uporządkowania. Włókna w tych miejscach nie posiadały również kontaktu z prążkami Z. W grupach TOF i HLHS obserwowano zróżnicowanie wyglądu wstawek w porównaniu z VSD. W przypadku wad siniczych były poszerzone ze względu na obecność elektronowo gęstego materiału, którego wygląd ze względu na wielkość zdecydowanie odbiegał od wyglądu płytek cytoplazmatycznych desmosomów (ryc. 3.).
W grupach TOF i HLHS obserwowano jądra komórkowe wykazujące cechy apoptozy. Miały one mocno pofałdowaną otoczkę jądrową, co wskazywało na obkurczenie jądra. Pod otoczką znajdował się elektronowo gęsty, szeroki rąbek heterochromatyny.
Jądra komórkowe w grupie VSD nie wykazywały cech uszkodzenia. Miały typowy dla komórek mięśnia sercowego pałeczkowaty kształt. Rąbek heterochromatyny rozmieszczony pod otoczką jądrową miał typową gęstość elektronową we wszystkich komórkach (ryc. 4.). W obrębie euchromatyny widoczne było najczęściej jedno jąderko typu gąbczastego.

Dyskusja
Brak wyraźnych cech uszkodzenia włókien mięśniowych w grupie VSD wymaga dokładniejszej weryfikacji badaniami morfometrycznymi. Ze względu na ograniczenia etyczne, zabraniające pobierania zdrowych tkanek, może jednak stanowić w dalszych badaniach grupę odniesienia [1].
W przypadkach TOF i HLHS dominującymi zmianami morfologicznymi są zmiany w jądrach komórkowych, mitochondriach i wstawkach.
Widoczne w jądrach komórkowych cechy apoptozy obserwowano w komórkach mięśnia sercowego w różnych stanach, zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych [2–5]. Apoptoza jest czynnikiem niezbędnym w procesie prawidłowego rozwoju prenatalnego układu sercowo-naczyniowego [6–9]. Obecność jej morfologicznych wykładników w badanych preparatach może być, zwłaszcza w przypadku dzieci do 1. tygodnia życia, pozostałością procesów rozwojowych. Z drugiej strony, brak morfologicznych wykładników apoptozy w grupie VSD wskazuje, że jej przyczyną są innego rodzaju czynniki indukujące. Rozpatrzenia wymaga również brak w badanych preparatach morfologicznych cech zaawansowanej apoptozy, takich jak: fragmentacja jąder czy cytoplazmy, a elementy aparatu kurczliwego nie wykazują uszkodzeń.
Zaburzenia procesu apoptozy są od kilku lat uznawane za jeden z kluczowych czynników rozwoju różnego rodzaju patologii mięśnia sercowego [10–13]. Jednocześnie podkreśla się, że w mięśniu sercowym jest ona aktywowana przede wszystkim w wyniku uszkodzenia mitochondriów na skutek stresu oksydacyjnego lub niedotlenienia wywołanych różnego rodzaju czynnikami. Powoduje to przemieszczenie białek Bcl-2, uwolnienie cytochromu c i aktywcję kaskady kaspaz [6, 10]. Z naszych obserwacji wynika, że mitochondria były strukturą kardiomiocytów uszkodzoną w największym stopniu. Występujący ogniskowo obrzęk macierzy mitochondrialnej, jej wakuolizacja oraz uszkodzenia błony wewnętrznej wskazują na częściowe lub całkowite zahamowanie procesów oksydacyjnych, za których prawidłowy przebieg struktury te odpowiadają.
Stres oksydacyjny może być wywołany również czynnikami występującymi w trakcie zabiegu kardiochirurgicznego. Schmitt i wsp. [14] wykazali obecność apoptozy w kardiomiocytach pacjentów po kardiochirurgicznym wstawieniu bypassów. Po zatrzymaniu serca i reperfuzji obserwowali oni brzeżną kondensację chromatyny i cechy uszkodzenia mitochondriów, podobne do prezentowanych w naszej pracy. Obserwacje morfologiczne potwierdzili metodą TUNEL in situ oraz biochemicznym oznaczeniem poziomu cytochromu c – kluczowego induktora apoptozy w ścieżce mitochondrialnej. Autorzy stwierdzają, że apoptoza jest kluczowym zjawiskiem występującym w kardiomiocytach po zabiegach na otwartym sercu. Nie można więc wykluczyć, że obserwowane przez nas jądrowe wykładniki apoptozy mogą być wynikiem hipotermii i zaburzeń perfuzji w trakcie zabiegu kardiochirurgicznego. Z drugiej strony stosunkowo niewielka liczba uszkodzonych mitochondriów w grupie VSD zmusza do szukania innych wyjaśnień tego zjawiska, takich jak mutacje mitochondrialnego lub jądrowego DNA wpływające na syntezę białek łańcucha oddechowego czy też przewlekłe mechaniczne przeciążenie miocytów prowadzące do upośledzenia ich czynności skurczowej.
Jednym z istotnych czynników wpływających na prawidłowy przebieg organogenezy mięśnia sercowego jest prawidłowe wykształcenie połączeń międzykomórkowych. W przeprowadzonych badaniach zauważyliśmy, że w przypadku wad siniczych wstawki mają strukturę inną niż w preparatach z grupy VSD. Występująca w ich obrębie elektronowo gęsta substancja, podobna gęstością do płytek desmosomów, niewystępująca punktowo, lecz na całej długości wstawki, sugerować może nieprawidłowości w obrębie kompleksu białek kotwiczących miofilamenty. Nieprawidłowy rozwój połączeń międzykomórkowych w okresie embriogenezy może prowadzić do zaburzeń cytoarchitektoniki tkanek i powstania strukturalnych wad wrodzonych. Za prawidłowe formowanie połączeń międzykomórkowych odpowiadają adhezyjne białka transbłonowe (ang. cell adhesion molecules – CAM), których podstawową funkcją jest rozpoznawanie innych komórek i cząsteczek substancji międzykomórkowej oraz tworzenie z nimi mniej lub bardziej trwałych połączeń. Białka CAM obejmują kilka grup o różnej funkcji i lokalizacji. Do najważniejszych należą: selektyny, integryny i kadheryny [15].
Kadheryny są zależnymi od wapnia białkami transbłonowymi, tworzącymi homofilowe połączenia międzykomórkowe, szczególnie w tkankach nabłonkowej i nerwowej. Zdolność do tworzenia ścisłych połączeń międzykomórkowych przez kadheryny zależy od ich połączenia z innymi białkami – kateninami, poprzez które łączą się one z włóknami aktynowymi cytoszkieletu [16–18]. Cząsteczki kadheryn zbudowane są z trzech części: domeny cytoplazmatycznej, domeny transbłonowej i domeny zewnątrzkomórkowej. Domena cytoplazmatyczna posiada dwa miejsca łączenia się z kateninami oraz białkiem p120ctn [19] regulującymi zdolności adhezyjne kadheryn. Uszkodzenie cytoplazmatycznych domen kadheryn prowadzi do znacznego zmniejszenia adhezji komórek [20].
Kluczową rolą w prawidłowym rozwoju serca odgrywa kadheryna N [21–24]. Jest ona obecna w zarodku już od wczesnego okresu poimplantacyjnego w obrębie mezodermalnych pól sercotwórczych [25] i utrzymuje silną ekspresję w mięśniu sercowym, zarówno w okresie płodowym, jak i pourodzeniowym [26]. W dojrzałym mięśniu sercowym kadheryna N jest zlokalizowana w obrębie obwódek zwierających (ang. gap junctions) wstawek, łącząc się poprzez kateninę z miofibrylami kardiomiocytów [27].
Nie jest do końca jasna rola kadheryn w procesie indukcji apoptozy. Wiadomo, że kadheryny VE hamują apoptozę w komórkach nabłonkowych [28, 29], wchodząc w skład kompleksu kadheryna VE/b-katenina/kinaza P13/VEGFR2 (ang. vascular endothelial growth factor). Z drugiej strony niedobór N-kadheryny nasila apoptozę u myszy transgenicznych N-cadherin-null w obrębie neuroepitelium i w somitach, przy jednoczesnym jej braku w kardiomiocytach. Świadczy to o istnieniu niezależnego od kadheryn mechanizmu hamującego apoptozę w mięśniu sercowym [30]. W opisywanym przypadku nie można jednak wykluczyć, że początkowe stadia apoptozy widoczne w elektronogramach mają związek z nieprawidłową budową białkową wstawek.


Praca finansowana z funduszy grantu KBN nr 0714/P05/ 2005/28.


Piśmiennictwo
1. Gregory MA, Whitton ID. A morphological control for ventricular pathology
in man: a morphometric and morphologic assessment of LV myofibres in secundum ASD. Int J Exp Pathol 1990; 71: 771-783.
2. Dispersyn GD, Ausma J, Thoné F, Flameng W, Vanoverschelde JL, Allessie MA, Ramaekers FC, Borgers M. Cardiomyocyte remodelling during myocardial hibernation and atrial fibrillation: prelude to apoptosis. Cardiovasc Res 1999; 43: 947-957.
3. Narula J, Pandey P, Arbustini E, Haider N, Narula N, Kolodgie FD, Dal Bello B, Semigran MJ, Bielsa-Masdeu A, Dec GW, Israels S, Ballester M, Virmani R, Saxena S, Kharbanda S. Apoptosis in heart failure: release of cytochrome c from mitochondria and activation of caspase-3 in human cardiomyopathy. Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96: 8144-8149.
4. Saraste A. Morphologic criteria and detection of apoptosis. Herz 1999; 24: 189-195.
5. Takemura G, Fujiwara H. Role of apoptosis in remodeling after myocardial infarction. Pharmacol Ther 2004; 104: 1-16.
˙6. Cook SA, Sugden PH, Clerk A. Regulation of bcl-2 family proteins during development and in response to oxidative stress in cardiac myocytes: association with changes in mitochondrial membrane potential. Circ Res 1999; 85: 940-949.
7. Fiorina P, Corradi D, Pinelli S, Maestri R, Lagrasta C, Buscaglia M, Davalli A, Folli F, Astorri E. Apoptotic/mytogenic pathways during human heart development. Int J Cardiol 2004; 96: 409-417.
8. Hong JR, Lin GH, Lin CJ, Wang WP, Lee CC, Lin TL, Wu JL. Phosphatidylserine receptor is required for the engulfment of dead apoptotic cells and for normal embryonic development in zebrafish. Development 2004; 131: 5417-5427.
9. Suzuki YJ, Evans T. Regulation of cardiac myocyte apoptosis by the GATA-4 transcription factor. Life Sci 2004; 74: 1829-1838.
10. Kumar D, Jugdutt BI. Apoptosis and oxidants in the heart. J Lab Clin Med 2003; 142: 288-297.
11. Mirkes PE, Little SA. Cytochrome c release from mitochondria of early postimplantation murine embryos exposed to 4-hydroperoxycyclophosphamide,
heat shock, and staurosporine. Toxicol Appl Pharmacol 2000; 162: 197-206.
12. Nicol RL, Frey N, Olson EN. From the sarcomere to the nucleus: role of genetics and signaling in structural heart disease. Annu Rev Genomics Hum Genet 2000; 1: 179-223.
13. Roucou X, Antonsson B, Martinou JC. Involvement of mitochondria in apoptosis. Cardiol Clin 2001; 19: 45-55.
14. Schmitt JP, Schröder J, Schunkert H, Birnbaum DE, Aebert H. Role of apoptosis in myocardial stunning after open heart surgery. Ann Thorac Surg 2002; 73: 1229-1235.
15. Kitlińska J, Wojcierowski J. Cząsteczki adhezyjne w nowotworach jelita grubego. Post Biol Kom 1996; 23: 705-716.
16. Gumbiner BM. Regulation of cadherin adhesive activity. J Cell Biol 2000; 148: 399-403.
17. Kemler R. From cadherins to catenins: cytoplasmic protein interactions and regulation of cell adhesion. Trends Genet 1993; 9: 317-321.
18. Takeichi M. Morphogenetic roles of classic cadherins. Curr Opin Cell Biol 1995; 7: 619-627.
19. Anastasiadis PZ, Reynolds AB. The p120 catenin family: complex roles in adhesion, signaling and cancer. J Cell Sci 2000; 113: 1319-1334.
20. Nagafuchi A, Takeichi M, Tsukita S. The 102 kd cadherin-associated protein: similarity to vinculin and posttranscriptional regulation of expression. Cell 1991; 65: 849-857.
21. García-Castro MI, Vielmetter E, Bronner-Fraser M. N-Cadherin, a cell adhesion molecule involved in establishment of embryonic left-right asymmetry. Science 2000; 288: 1047-1051.
22. Linask KK, Knudsen KA, Gui YH. N-cadherin-catenin interaction: necessary component of cardiac cell compartmentalization during early vertebrate heart development. Dev Biol 1997; 185: 148-164.
23. Ong LL, Kim N, Mima T, Cohen-Gould L, Mikawa T. Trabecular myocytes of the embryonic heart require N-cadherin for migratory unit identity. Dev Biol 1998; 193: 1-9.
24. Shiraishi I, Takamatsu T, Fujita S. 3-D observation of N-cadherin expression during cardiac myofibrillogenesis of the chick embryo using a confocal laser scanning microscope. Anat Embryol 1993; 187: 115-120.
25. Radice GL, Rayburn H, Matsunami H, Knudsen KA, Takeichi M, Hynes RO.
Developmental defects in mouse embryos lacking N-cadherin. Dev Biol 1997; 181: 64-78.
26. Angst BD, Khan LU, Severs NJ, Whitely K, Rothery S, Thompson RP, Magee AI, Gourdie RG. Dissociated spatial patterning of gap junctions and cell adhesion junctions during postnatal differentiation of ventricular myocardium. Circ Res 1997; 80: 88-94.
27. Ferreira-Cornwell MC, Luo Y, Narula N, Lenox JM, Lieberman M, Radice GL.
Remodeling the intercalated disc leads to cardiomyopathy in mice misexpressing cadherins in the heart. J Cell Sci 2002; 115: 1623-1634.
28. Carmeliet P, Lampugnani MG, Moons L, Breviario F, Compernolle V, Bono F, Balconi G, Spagnuolo R, Oosthuyse B, Dewerchin M, Zanetti A, Angellilo A, Mattot V, Nuyens D, Lutgens E, Clotman F, de Ruiter MC, Gittenberger-de Groot A, Poelmann R, Lupu F, Herbert JM, Collen D, Dejana E. Targeted deficiency or cytosolic truncation of the VE-cadherin gene in mice impairs VEGF-mediated endothelial survival and angiogenesis. Cell 1999; 98: 147-157.
29. Herren B, Levkau B, Raines EW, Ross R. Cleavage of beta-catenin and plakoglobin and shedding of VE-cadherin during endothelial apoptosis: evidence for a role for caspases and metalloproteinases. Mol Biol Cell 1998; 9: 1589-1601.
30. Luo Y, Ferreira-Cornwell M, Baldwin H, Kostetskii I, Lenox J, Lieberman M,
Radice G.: Rescuing the N-cadherin knockout by cardiac-specific expression of N- or E-cadherin. Development 2001; 128: 459-469.