Badania kliniczne i doświadczalne w chorobach serca, płuc i naczyń
Tissue engineering methods as a potential instrument used in treatment of circulatory system diseases

Terapie komórkowe
Transplantacja komórek może być ważnym czynnikiem terapeutycznym w leczeniu choroby niedokrwiennej serca. Istnieją doniesienia, świadczące o znacznej poprawie kurczliwości lewej komory serca po terapii komórkowej. Do pionierskich należą badania Soonpaa i wsp. [1, 2], którzy transplantowali komórki AT-1 i płodowe kardiomiocyty zdrowym myszom oraz psom. Wszczepione kardiomiocyty tworzyły struktury dyskowe i wytwarzały jednocześnie połączenia z komórkami gospodarza. W badaniach przeprowadzonych przez innych autorów [3, 4] obserwowano, że zabieg rekonstrukcji lewej komory serca z jednoczesnym wszczepieniem komórek mięśniowych i pooperacyjnym zastosowaniem ACE-inhibitorów istotnie poprawia funkcję skurczową lewej komory serca. Ciekawych informacji na ten temat dostarczyły także badania na chomikach szczepu BIO 53.58, którym wszczepiano allogenne komórki mięśnia sercowego oraz autologiczne komórki mięśniówki gładkiej [5, 6]. W obu wypadkach zaobserwowano, że wszczepione komórki zaczęły formować się w tkankę mięśniową, przy czym następowała też poprawa funkcji mięśnia sercowego. Wielu badaczy podtrzymuje tezę, że komórki mięśnia sercowego mogą być z dobrym efektem przeszczepiane do zmienionego niedokrwiennie serca [7–10]. W niektórych badaniach zaobserwowano jednak, że embrionalne ludzkie kardiomiocyty wszczepione do uszkodzonego serca szczura nie mają zdolności różnicowania się w komórki dojrzałe, co wykazano w kilkumiesięcznej obserwacji [7]. Podobne wnioski wysnuwają się z badań Watanabe i wsp. [11]. Wszczepienie komórek mięśniowych mysich linii AT-1 do zdrowego i uszkodzonego mięśnia sercowego świni wykazało, że o ile zdrowy mięsień sercowy cechowało normalne przeżycie przeszczepionych komórek, o tyle w wypadku mięśnia uszkodzonego żadne z komórek nie przeżywały. W pewnym kontraście do tego są badania Connold i wsp. [9]. Autorzy stwierdzili, że embrionalne kardiomiocyty przeszczepione do uszkodzonego mięśnia sercowego szczurów wytwarzają połączenia międzykomórkowe (gap junction) z innymi przeszczepionymi komórkami, co może świadczyć o ich częściowym różnicowaniu. W żadnym wypadku nie odnotowano zaś wytworzenia się połączeń elektromechanicznych między przeszczepianymi komórkami a komórkami uszkodzonego mięśnia sercowego gospodarza.
Interesujące były również wyniki badań Reinecke i wsp. [12], którzy przeszczepiali płodowe, neonatalne i dojrzałe kardiomiocyty do zdrowego mięśnia sercowego, do mięśnia sercowego uszkodzonego w fazie ostrej i do mięśnia uszkodzonego w okresie odległym (6 dni) po uszkodzeniu. Dojrzałe kardiomiocyty nie przeżywały w żadnych warunkach, natomiast płodowe i neonatalne komórki mięśnia sercowego formułowały żywe przeszczepy w każdej z wymienionych grup badanych. Zaobserwowano też tworzenie połączeń funkcjonalnych między przeszczepianymi komórkami, a w kilku wypadkach powstały połączenia między komórkami gospodarza i przeszczepionymi, co może sugerować wytworzenie się funkcjonalnych połączeń elektromechanicznych.
W terapii uszkodzonego mięśnia sercowego oprócz kardiomiocytów mogą mieć również zastosowanie komórki mięśniówki gładkiej, mają one bowiem zdolność do utrzymania długotrwałego skurczu tonicznego przy relatywnie niskim zapotrzebowaniu energetycznym, a ponadto wykazują wysoką maksymalną siłę skurczu w porównaniu z mięśniami szkieletowymi [13]. Eksperymenty, związane z zastosowaniem komórek mięśniówki gładkiej, zostały przeprowadzone przez Yoo i wsp. [14]. Przeszczepili oni te komórki do mięśnia sercowego, a dodatkowo, w innej grupie badanej, przeprowadzili transplantację kardiomiocytów. Wykazano, że w obu grupach eksperymentalnych następowało formowanie się tkanki mięśniowej. Obserwowano również poprawę funkcji rozkurczowej serca. W grupie, w której dokonano przeszczepu komórek mięśniówki gładkiej, odnotowano wyższe szczytowe ciśnienia skurczowe. Funkcja skurczowa serca w grupie, w której zastosowano komórki mięśniówki gładkiej, była porównywalna z wartościami obserwowanymi u zdrowych osobników. Autorzy stwierdzili również, że zastosowanie komórek mięśniówki gładkiej daje lepsze rezultaty niż zastosowanie terapii kardiomiocytów. Badania te były prowadzone na chomikach, z tego względu autorzy podkreślają konieczność weryfikacji wyników na dużych zwierzętach. W innych badaniach [15] zastosowano komórki mięśniówki gładkiej izolowane z aorty. Były one przenoszone na materiał syntetyczny – polimer polilaktamowy (PCLA). Hodowano je na syntetycznej matrycy w warunkach in vitro mniej więcej przez 2 tyg., aż do uformowania się tkanki. Następnie matryce z komórkami wszczepiano szczurom, u których stymulowano wcześniej epizod niedokrwienia. W grupie kontrolnej autorzy zastosowali polimer niepokrywany komórkami. W konkluzji stwierdzono, że łata pokryta komórkami mięśniówki gładkiej w istotny sposób przyczynia się do poprawy funkcji skurczowej zmienionego zawałowo mięśnia sercowego. Jak widać z przedstawionego opisu, zastosowanie terapii komórkowej może być czynnikiem, który w istotny sposób pozwala na poprawę kurczliwości mięśnia sercowego, jednak zastosowanie zawiesiny komórek ma istotne ograniczenia, a czynnikiem limitującym jest głównie wielkość obszaru blizny pozawałowej. Ponadto komórki, by zachować właściwą aktywność proliferacyjną i różnicowanie, wymagają stymulacji w postaci kontaktu z powierzchnią macierzy zewnątrzkomórkowej. Komórki o fenotypie komórek adhezyjnych, pozbawione tego rodzaju stymulacji uruchamiają program apoptozy. Może to częściowo tłumaczyć niepowodzenia związane ze stosowaniem w terapii zawiesiny pojedynczych komórek [11].
Bioprotezy sercowe oparte na matrycach z polimeru biodegradowalnego
Idea tworzenia takich bioprotez polega na nasiewaniu komórek autologicznych na szkielet z polimerów bioegradowalnych. Osadzone w syntetycznym szkielecie komórki rosną, różnicują się i syntetyzują macierz zewnątrzkomórkową. Równolegle z syntezą matrix zewnątrzkomórkowej następuje powolna degradacja polimeru, aby w efekcie mógł on być całkowicie zastąpiony przez wzrastającą tkankę. W ten sposób powstaje tkanka w pełni autologiczna. Jednym z pierwszych materiałów wykorzystywanych do modelowania tego typu protez był kwas poliglikolowy – PGA (polyglicolic acid). Wykorzystali go, m.in. Hoerstrup i wsp. do konstrukcji zastawki trójpłatkowej [16]. Zastawka ta była następnie pokrywana funkcjonalną warstwą komórek autologicznych, którymi były komórki szpiku HMSC (human marrow stromal cell). Wzrastały one na powierzchni materiału w warunkach in vitro w bioreaktorze z przepływem pulsacyjnym. Wnioski, jakie nasuwały się z przeprowadzonych in vitro badań wskazywały, że zastosowanie PGA jako materiału biodegradowalnego, z nahodowanymi na jego powierzchni komórkami szpiku, pozwala na uzyskanie bioprotezy o właściwościach morfologicznych i mechanicznych podobnych do tkanki własnej. Obiecujące wyniki otrzymano też w eksperymentach na zwierzętach, którym wszczepiano bioprotezy zastawkowe, konstruowane na bazie PGA [17]. W tym wypadku materiał biodegradowalny pokrywano najpierw fibroblastami, a następnie na takie podłoże nahodowywano komórki endotelialne. Tak przygotowane zastawki wszczepiano zwierzętom. Analiza zawartości 4-hydroksyproliny, badania immunohistochemiczne na obecność włókien fibrynowych oraz czynnika VIII na powierzchni tkanki świadczyły o istnieniu aktywnych procesów remodelowania tkanki i wzrostu komórek. W konstrukcji bioprotez zastosowanie znajdują też połączenia biodegradowalnych polimerów, takie jak PGA, np. z kwasem polilaktamowym – PLA. Ciekawych wyników dostarczyły eksperymenty, w których porównywano zdolność komórek do wzrostu i różnicowania w zależności od metody nahodowywania komórek. Na szkielet z kwasów poliglikolowego i polilaktamowego nasiewano fibroblasty i komórki śródbłonka w następujący sposób: codzienne zasiedlanie fibroblastami przez 10 dni, jednokrotne zasiedlenie fibroblastami, a następnie hodowla polimeru z komórkami przez 14 dni. W tym drugim wypadku w jednej grupie użyto standardowego medium, w drugiej natomiast zastosowano medium z kolagenem. Wyniki w sposób jednoznaczny wykazały, że stosując medium suplementowane kolagenem, udało się najskuteczniej zasiedlić polimer, można więc przypuszczać, że w tym wypadku również synteza macierzy zewnątrzkomórkowej będzie efektywna [18]. Znacznie gorsze rezultaty uzyskano natomiast po zastosowaniu w układzie in vivo konstruktów złożonych z kwasów PGA łącznie z PLA. Bioprotezy tego rodzaju charakteryzowała znaczna trombogenność. Zwierzęta, którym wszczepiano zastawki z tych materiałów, ginęły w krótkim okresie po operacji (12, 24, 36 godz.), a przyczyną śmierci był zawał mięśnia sercowego w przebiegu niewydolności oddechowej [19]. Zastosowanie w konstrukcji bioprotez mają również rusztowania złożone z PGA i kwasu poli-4-hydroksymasłowego P4HB (poly-4-hydroksybutyrate) lub kwasu polihydroksyoctowego-PHO (polyhydroksyoctanoate). Zastosowanie tego rodzaju polimerów istotnie poprawia właściwości biomechaniczne protez, istotnie jednak wydłuża się czas biodegradacji polimeru [20]. Znacznie bardziej obiecującym materiałem są rusztowania, w których PGA pokrywany jest cienką warstwą kwasu polihydroksymasłowego – P4HB. Materiał tego rodzaju łączy porowatość PGA z elastycznością i wytrzymałością P4HB. Ponadto polimer ten charakteryzuje się szybszym czasem biodegradacji w porównaniu z PHO. Termoplastyczność P4HB powoduje, że stosunkowo łatwe jest uformowanie bioprotezy [21]. W badaniach Hoerstrup i wsp. [21] na uformowane z PGA i P4HB zastawki nasiewano komórki endotelialne i miofibroblasty. Następnie bioprotezy wszczepiano owcom. Mniej więcej po 20 tyg. odnotowano w badaniach echokardiograficznych obecność w pełni funkcjonalnej zastawki. Można zatem przypuszczać, że charakterystyka wzrostu i remodelowania tego rodzaju bioprotez, opartych na polimerach biodegradowalnych jest zbliżona do tkanek własnych [22]. Często zwraca się uwagę na konieczność mechanicznego kondycjonowania bioprotez sercowych na etapie ich tworzenia w warunkach in vitro, co jest możliwe dzięki zastosowaniu konstrukcji bioreaktorów z przepływem pulsacyjnym. Jak się wydaje, niewystarczająca wytrzymałość mechaniczna bioprotez z materiałów biodegradowalnych może być spowodowana brakiem stymulacji mechanicznej na etapie ich powstawania. Zastosowanie bioreaktorów z przepływem pulsacyjnym istotnie poprawia biomechaniczne właściwości protez [23]. Wadą materiałów biodegradowalnych jest brak na ich powierzchni ligandów białkowych, które w normalnych warunkach są w zastawkach biologicznych i odpowiadają za właściwą adhezję pomiędzy komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową [24]. Znacznie bardziej obiecujące wydaje się wykorzystanie w konstrukcji bioprotez rusztowań acellularnych.
Wykorzystanie matryc acellularnych w technikach inżynierii tkankowej
Acellularne bioprotezy, pokrywane komórkami autologicznymi powstały jako alternatywa, m.in. wobec protez ksenogennych konserwowanych chemicznie oraz opartych na materiałach syntetycznych. Konserwacja chemiczna może pozytywnie oddziaływać na właściwości mechaniczne tkanki, gdyż redukuje jej immunogenność. Wadą tego rodzaju konserwacji jest jednak relatywnie szybko postępujący proces degradacji oraz kalcyfikacji tkanek [25, 26]. Bioprotezy, w których są żywe komórki, zachowują z kolei na swojej powierzchni komórki endotelialne, wykazujące wysoką ekspresję antygenów HLA zarówno klasy I, jak i II, co może stanowić potencjalne źródło indukcji reakcji immunologicznej, a w konsekwencji być czynnikiem decydującym o zmianach degradacyjnych bioprotezy w okresie odległym po implantacji [27]. W tym wypadku grupą szczególnie narażoną na wczesną dysfunkcję są dzieci, co wynika z dużej reaktywności ich układu immunologicznego [28, 29]. Udowodniono, że proces acellularyzacji przyczynia się z kolei do istotnego obniżenia liczby antygenów MHC klasy I i II [30], ponadto nie narusza stabilności i funkcjonalności bioprotez [31]. Najprostszą metodą acellularyzacji jest cykliczne zamrażanie i rozmrażanie tkanki [32, 33]. Takie postępowanie sprawia jednak, że duża część komórek pozostaje niewyizolowana [34], obserwowane są też zmiany struktury kolagenu w obrębie traktowanych tkanek i mało skuteczne jest nahodowywanie komórek endotelialnych na tak przygotowane tkanki [34]. Inną metodą usuwania komórek jest inkubacja tkanki w roztworze NaCl, a następnie w detergencie, którym jest SDS [34, 35]. Wykazano, że płatki zastawek, inkubowane w roztworach NaCl-SDS mogą być całkowicie pozbawione komórek i wykazują zdolność do zasiedlania ich komórkami śródbłonka [34].
Jedną z najczęściej stosowanych metod usuwania komórek jest inkubacja tkanek w roztworze trypsyna/EDTA. Dane literaturowe wskazują, że pozwala to na całkowite usunięcie komórek bez widocznych zmian w macierzy zewnątrzkomórkowej [36–38]. Do acellularyzacji stosowane są też detergenty. Jednym z nich jest Triton-X 100, który – zdaniem niektórych autorów – pozwala zachować natywną strukturę białek macierzy, a jednocześnie skutecznie usuwa komórki [39]. Dla kontrastu badania Kim i wsp. [34] wskazują, że stosując Triton-X 100, trudno uzyskać powtarzalny efektywny poziom acellularyzacji tkanek. Innym powszechnie stosowanym detergentem jest SDS, którego działanie pozwala uzyskać acellularną tkankę o właściwoścach mechanicznych zbliżonych do tkanki własnej [40]. Inne badania wykazały natomiast, że SDS jest czynnikiem powodującym denaturację białek kolagenowych i ich destabilizację [41]. SDS może prowadzić do fragmentacji i obrzęków w obrębie kolagenu i do istotnej utraty jego stabilności hydrotermalnej [42]. Skuteczność acellularyzacji powinna być oceniana nie tylko poprzez efektywność usuwania komórek z tkanek przy zachowaniu integralności i stabilności macierzy zewnątrzkomórkowej, ważnym kryterium jest też zdolność do ponownego zasiedlania przygotowanych rusztowań bezkomórkowych przez komórki. W wypadku tkanek ksenogennych zastosowanie może mieć chemiczna konserwacja bioprotezy. Próby endotelializacji tkanek konserwowanych chemicznie prowadzono m.in. na tkankach zastawek, wykorzystując jako czynnik konserwujący aldehyd glutarowy. Badania wykonywano zarówno na pojedynczych płatkach, jak i całych zastawkach [43]. Przed nahodowaniem komórek endotelialnych zastawki poddawane były detoksyfikacji. Jednak pomimo dużej gęstości komórek użytych do hodowli, prowadzenia jej w bioreaktorze w warunkach dynamicznych, po 7 dniach hodowli na zastawkach uwidoczniło jedynie nieopłaszczone lub martwe komórki. Wydaje się zatem, że bardziej obiecujące jest zastosowanie jako rusztowań tkanek allogennych. W badaniach Cebotari i wsp. [44] użyto zastawek ludzkich, z których usunięto komórki poprzez inkubację w roztworze trypsyna/EDTA. Zastawki te przed acellularyzacją umieszczano w sterylnych warunkach w roztworze antybiotyku penicylina/streptomycyna, w takiej formie mogły być przechowywane ok. miesiąca bez widocznej utraty integralności macierzy zewnątrzkomórkowej. Następnie acellularne rusztowania pokrywano ludzkimi komórkami endotelialnymi. Komórki te tworzyły na powierzchni tkanki regularną monowarstwę, pozytywnie reagującą z PECAM-1, Flk-1, VE-kadherynami. Zdolność do zasiedlania przez komórki tkanek bezkomórkowych zależeć może również od sposobu konserwacji tkanki. Z badań Eberl i wsp. [45], w których porównywano różnice w zdolności do wzrostu, proliferacji oraz adhezji komórek na płatkach świeżych i konserwowanych w sposób właściwy dla zastawek dostępnych komercyjnie wynika, że na świeżych, niekonserwowanych tkankach komórki wykazywały prawidłową adhezję i proliferację, tworząc pomiędzy 6. a 10. dniem hodowli tzw. monowarstwę na powierzchni tkanki. Nie obserwowano natomiast tworzenia się monowarstwy komórek i ich proliferacji na powierzchni tkanek konserwowanych. W innych doświadczeniach z płatków zastawek usuwano komórki poprzez inkubację w roztworze SDS, a dodatkowo pierścienie aorty inkubowano wcześniej w roztworze trypsyna/EDTA [46]. Na tak przygotowaną tkankę nasiewano zastawkowe komórki interstycjalne (VIC), komórki mięśniówki gładkiej (SMC) oraz fibroblasty. W przypadku wszystkich tkanek odnotowano ich prawidłowe zasiedlanie przez komórki. VIC i SMC migrowały w głąb tkanki, natomiast fibroblasty zasiedlały jedynie jej powierzchnię. Tkanki acellularne są często wykorzystywane w technikach inżynierii tkankowej. Prace koncentrują się na uzyskaniu matryc kolagenowych o różnej porowatości, które mogłyby być zasiedlane komórkami. Mimo że w procedurach pozyskiwania tkanek acellularnych zwraca się uwagę, by wykazywały one właściwości biomechaniczne zbliżone do tkanek natywnych, to jednak część z tych matryc cechują słabe właściwości mechaniczne [47–49].

Doświadczenia własne
W ramach wspólnego projektu Śląskiego Centrum Chorób Serca w Zabrzu i Pracowni Biotechnologii Fundacji Rozwoju Kardiochirurgii w Zabrzu prowadzone są prace, mające na celu stworzenie łaty biologicznej, pokrywanej komórkami pacjenta. Taka łata mogłaby być wykorzystywana w zabiegach chirurgicznej rekonstrukcji lewej komory serca. Celem metody jest przywrócenie właściwego eliptycznego kształtu komory i likwidacja niekorzystnych naprężeń. Trwałość tego efektu możliwa jest, m.in. dzięki wszyciu łaty, pozwalającej na utrzymanie zadanego kształtu. Do tej pory łaty wykorzystywane w praktyce klinicznej tworzone były z materiałów syntetycznych typu Dacron. Materiał tego rodzaju ma dobre właściwości mechaniczne, nie ma jednak zdolności do wzrostu, remodelowania czy samonaprawy. Dlatego prowadzone są prace, mające na celu wykonanie łaty biologicznej, która pokrywana byłaby komórkami pacjenta. Pełniłaby ona nie tylko funkcję mechaniczną, ale i w aktywny sposób pozwalałaby na przywrócenie kurczliwości lewej komory serca. Łata składałaby się z dwóch komponentów: komponenty komórkowej oraz elementu rusztowania, na którym osadzane byłyby komórki autologiczne. Jako rusztowanie wykorzystuje się osierdzie pacjenta, tkankę, która poddana byłaby procesowi usuwania komórek. Wydaje się, że dobrym materiałem, relatywnie łatwo dostępnym, może być osierdzie pozyskiwane z serc eksplantowanych. Ten rodzaj tkanki ma dobre właściwości mechaniczne, a jednocześnie pozwala na nahodowanie na nim warstwy żywych komórek. W celu poprawy właściwości mechanicznych możliwe jest dodatkowe usieciowanie struktury przy użyciu czynników nietoksycznych, które nie wpływałyby niekorzystnie na żywotność nahodowanych komórek. Jako materiał komórkowy wykorzystywane mogą być komórki mięśniówki gładkiej izolowane z naczynia żylnego (ryc. 1.). Mają one cechy funkcjonalne zbliżone do kardiomiocytów, natomiast ich dodatkową zaletą jest większy w porównaniu z kardiomiocytami potencjał prolifracyjny oraz ich łatwiejsze pozyskanie. Do tej pory zakończony został pierwszy etap prac, w którym: • opracowano metodę izolowania i hodowli komórek mięśniówki gładkiej (VSMC), wykorzystywanych następnie do pokrywania łaty, • wykonano wstępne badania efektywności wzrostu tych komórek, • wykonano wstępne badania morfologiczne i histologiczne VSMC, • opierając się na doświadczeniu własnym i danych literaturowych, przygotowano rusztowania bezkomórkowe, na których osadzane będą komórki, • wyizolowane i hodowane komórki nasiewano na rusztowania bezkomórkowe. Wstępne wyniki badań wydają się obiecujące. Izolowane komórki wykazują prawidłową morfologię komórek mięśniówki gładkiej (ryc. 2.). Cechuje je również duży potencjał proliferacyjny, co pozwala przypuszczać, że liczba izolowanych komórek będzie wystarczająca do pokrycia łaty (ryc. 3.). Wstępne badania wykazały też, że izolowane komórki po nasianiu na rusztowanie bezkomórkowe tworzyły mniej więcej po tygodniu hodowli konfluentną mono- lub dwuwarstwę (ryc. 4.). Ponadto obserwacja komórek w hodowli wykazała, że są one w pełni funkcjonalne, o czym świadczy ich zdolność do syntezy i reorganizowania macierzy zewnątrzkomórkowej. Zbadano również właściwości biomechaniczne tkanki po acellularyzacji wykazując, że właściwości te nie różnią się istotnie od cech tkanki własnej. Dotychczasowe wyniki skłaniają do podjęcia dalszych prac, mających na celu stworzeniu łaty biologicznej, która mogłaby być wykorzystywana podczas zabiegów chirurgicznej rekonstrukcji pozawałowo uszkodzonej lewej komory serca.

Piśmiennictwo
1. Soonpaa MH, Koh GY, Klug MG, Field LJ. Formation of nascent intercalated disks between grafted fetal cardiomyocytes and host myocardium. Science 1994; 264: 98-101. 2. Koh GY, Soonpaa MH, Klug MG, Pride HP, Cooper BJ, Zipes DP, Field LJ. Stable fetal cardiomyocyte grafts in the hearts of dystrophic mice and dogs. J Clin Invest 1995; 96: 2034-2042. 3. Sakakibara Y, Tambara K, Lu F. Combined procedure of surgical repair and cell transplantation for left ventricular aneurysm: an experimental study. Circulation 2002; 106 (12 suppl): I193-I197. 4. Nomoto T, Nishina T, Miwa S. Agiotensin-converting enzyme inhibitors helps prevent late remodeling after left ventricular aneurysm repair in rats. Circulation 2002; 106 (12 suppl): I115-I119. 5. Yoo K-J, Li R-K, Weis RD, Mickle DAG, Li G, Yau TM. Autologous smooth muscle cell transplantation improved heart function in dilated cardiomyopathy. Ann Thorac Sur 2000; 70: 859-65. 6. Yoo K-J, Li R-K, Weis RD, Mickle DAG, Jia ZQ, Kim EJ. Heart cell transplantation improves heart function in dilated cardiomyopathic hamster. Circulation 2000; 102: III51-55. 7. Leor J, Patterson M, Quinones MJ, Kedes LH, Kloner RA. Transplantation of fetal myocardial tissue into the infarcted myocardium of rat: a potential method for repair of infarcted myocardium? Circulation 1996; 94 (suppl 9): II-332–II-336. 8. Scorsin M, Marotte F, Sabri A, Le Dref O, Demirag M, Samuel JL, Rappaport L, Menasche P. Can grafted cardiomyocytes colonize peri-infarct myocardial areas? Circulation 1996; 94 (suppl9): II-337–II-340. 9. Connold AL, Frischknecht R, Dimitrakos M, Vrbová G. The survival of embryonic cardiomyocytes transplanted into damaged host rat myocardium. J Muscle Res Cell Motil.1997; 18: 63-70. 10. Li RK, Jia ZQ, Weisel RD, Mickle DA, Zhang J, Mohabeer MK, Rao V, Ivanov J. Cardiomyocyte transplantation improves heart function. Ann Thorac Surg 1996; 62: 654-661. 11. Watanabe E, Smith DM, Delcarpio JB, Sun J, Smart FW, van Meter CH, Claycomb WC. Cardiomyocyte transplantation in a porcine myocardial infarction model. Cell Transplant- 1998; 7: 239–246. 12. Reinecke H, Zhang M, Bartosek T, Murry CE, MD. Survival, Integration, and Differentiation of Cardiomyocyte Grafts A Study in Normal and Injured Rat Hearts. Circulation 1999; 100: 193-202. 13. Guyton AC, Contraction and excitation of smooth muscle. Textbook of Medical Physiology. 8th ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co.; 1991. 87-95. 14. Yoo KJ, Li RK, Weisel RD, Mickle DA, Tomita S, Ohno N, Fujii T. Smooth muscle cell transplantation is better than heart cells transplantation for improvement of heart function in dilated cardiomyopathy. Yonsei Med J 2002; 43: 296-303 15. Matsubayashi K, Fedak PMW, Mickle DAG, Weisel RD, Ozawa T, Li R-K. Improved left ventricular aneurysm repair with bioengineered vascular smooth muscle grafts. Circulation 2003; 108 [S II]: II-219-II-225. 16. Hoerstrup SP, Kadner A, Melnitchouk S, Trojan A, Eid K, Tracy J, Sodian R, Visjager JF, Kolb SA, Grunenfelder J, Zund G, Turina MI. Tissue engineering of functional trileaflet heart valves from human marrow stromal cells. Circulation 2002, 106: I143-50. 17. Shinoka T. Tissue engineered heart valves: autologius cell seeding on biodegradable polymer scaffold. Artif Organs 2002; 26: 402-406. 18. Kim WG, Park JK, Park YN, Hwang CM, Jo YH, Min BG, Yoon CJ, Lee TY. Tissue engineered heart valve leaflets: an effective method for seeding autologous cells on scaffolds. Int J Artif Organs 2000; 23: 624-628 19. Kim WG, Cho SK, Kang MC, Lee TY, Park JK. Tissue engineered heart valve leaflets-animal study. Int J Artif Organs 2001; 24: 642-648. 20. Sodian R, Hoerstrup SP, Sperling JS. Early in vivo experience with TE trileaflet jeart valves. Circulation 1999; 100: I-211. 21. Hoerstrup SP, Sodian R, Daebritz S, Wang J, Bacha EA, Martin DP, Moran AM, Guleserian KJ, Sperling JS, Kaushal S, Vacanti JP, Schoen FJ, Mayer JE. Functional Living Trileaflet Heart Valves Grown In Vitro. Circulation 2000; 102: III-44-III-49. 22. Schoen FJ. Aortic valve structure-function correlations: role of elastic fibers no longer a stretch of the imagination. J Heart Valve Dis 1997; 6: 1- 6. 23. Niklason LE, Gao J, Abbott WM. Functional arteries grown in vitro. Science 1999; 284: 489-493. 24. LeBaron RG, Athanasiou KA. Extracellular matrix cell adhesion peptides: functional aplication in orthopedic materials. Tissue Eng. 2000; 6: 85-103. 25. Simionescu TD, Lovekamp JJ, Vyavahare RN. Degeneration of bioprosthetic heart valve cusp and wall tissue is initiated during tissue preparation: an ultrastructural study. J Heart Valve Dis. 2003; 12: 226-234. 26. Simionescu TD, Lovekamp JJ, Vyavahare RN. Glycosaminoglycan-degrading enzymes in porcine aortic heart valves: Implication for bioprosthetic heart valve degeneration. J Heart Valve Dis 2003; 12: 217-225.
27. Yamkach AC, Wottge HU, Muller-Hermelink HK. Transplantation of aortic and pulmonary allografts, enhanced viability of endothelial cells by cryopreservation, importance of histocompatibility. J Card Surg 1987; 2: 209-220. 28. den Hammer I, Hepkema B, Ebles T. HLA antibodies specific for cryopreserved heart valves homografts in children. J Thorac Cardiovasc Surg 1997; 113: 417-419. 29. Clarke DR, Campbel DN, Hayward AR. Degeneration of aortic valve allografts in young recipients. J Thorac Cardiovasc Surg 1993; 105: 934-941. 30. Elkins RC, Dawson PE, Goldstein S. Decellularized human valve allografts. Ann Thorac Surg 2001; 71: S428-S432. 31. Goldstein S, Clarke DR, O’Brien MF. Transpecies heart valve transplant: advanced studies of bioengineered xeno-autografts. Ann Thorac Surg 2000; 70: 1962-1969. 32. Grillo HC, McKhann CF. The acceptance and evolution of dermal homografts freed of viable cells. Transplantation 1964; 2: 48-59. 33. Fang CH, Robb EC, Yu GS, Alexander JW, Wadden GD. Observation on stability and contraction of composite skin grafts: xenodermis or allodermis with an isograft onlay. J Burn Care Rehab 1990; 11: 538-542. 34. Kim WG, Park JK, Lee WY. Tissue engineered heart valve leaflets: an effective method of obtaining acellularized valve xenografts. Int J Artif Organs 2002; 25: 791-797. 35. Walter RJ, Matsuda T, Reyes HM, Walter JM, Hanumadass M. Characterization of acellular dermal matrices (ADMs) prepared by two different methods. Burns 1998; 24: 104-113. 36. Teebken OE, Bader A, Steinhoff G, Haverich A. Tissue engineering of vascular grafts: Human cell seeding of decellularized porcine matrix. Eur J Vasc Endovasc Surg 2000, 19: 381-386. 37. Steinhoff G, Stock U, Karim N, et.al. Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits. Circulation 2000, 102 (S III): 50-55. 38. Bader A, Steinhoff G, Strobl K. Engineering of human vascular aortic tissue based on xenogenic starter matrix. Transplantation 2000, 70: 4-14. 39. Kasimir M-T, Rieder E, Seebacher G, Silberhumer G, Wolner E, Simon P. Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves. Int J Artif Organs 2003; 26: 421-427.
40. Korossis SA, Booth C, Wilcox HE, Watterson KG, Kearney JN, Fisher J, Ingham E. Tissue engineering of cardiac valve prostheses II: biomechanical characterization of decellularized aortic heart valve. J Heart Valve Dis 2002; 11: 463-471. 41. Samouillan V, Dandurand-Lods J, Lamure A, Maurel E, Lacabanne C, Gerosa G, Venturini A, Casarotto D, Gherardini L, Spina M. Thermal analysis characterization of aortic tissue for cardiac valve bioprostheses. J. Biomed Mater Res 1999; 46: 531-538. 42. Bodnar E, Olsen EGJ, Florio R, Dobrin J. Damage of porcine aortic valve tissue by the surfactant sodium dodecylsulfate. Thorac Cardiovasc Surg 1986, 34: 82-85. 43. Bengston L, Radegran K, Haegerstrand A. In vitro endothelialization of commercialy available heart valve bioprostheses with cultured adult human cells. Eur J Cardiothorac Surg 1993; 8: 393-398. 44. Cebotari S, Mertsching H, Kallenbach K, Kostin S, Repin O, Bartinac A, Kleczka C, Ciubotaru A, Haverich A. Construction of autologous human heart valves based on an acellular allograft matrix. Circulation 2002, 106: I 63-I 68. 45. Eberl T, Siedler S, Schumacher B, Zilla P, Schlaudraff K, Fasol R. In vitro experimental endothelialization of cardiac valve leaflets. Ann Thorac Surg 1992; 53: 487-492. 46. Wilcox WE, Korossis SA, Booth C, Wattersen KG, Kearney JN, Fisher J, Ingham J. Tissue engineering of living heart valve: biological and biomechanical assesment of an acellelar, porcine valve matrix. European Cells and Materials 2003; 6 (suppl. 2): 8 47. Park SN, Park JC, Kim HO, Song MJ, Suh H. Characterization of porous collagen/hyaluronic acid scaffold modified by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide cross-linking. Biomaterials 2002; 23: 1205-1212. 48. Feng Z, Yamato M, Akutsu T, Nakamura T, Okano T, Umezu M. Investigation on mechanical properties of contracted collagen gels as scaffold for tissue engineering. Artif Organs 2003; 27: 84-91. 49. Pei M, Solchaga LA, Seidel J, Zeng L, Vunjak-Novakovic G, Caplan AI, Freed LE. Bioreactors mediated the efectivensess of tissue engineering scaffolds. FASEB J 2002; 16: 1691-1694.