Badania kliniczne i doświadczalne w chorobach serca, słuc i naczyń
Leczenie przewlekłej pozawałowej niewydolności mięśnia serca poprzez implantację własnych jednojądrowych komórek szpikowych w region akinezy miokardium

Wstęp
Postęp kardiologii w ostatnich latach spowodował znaczący wzrost liczby pacjentów, którzy przeżyli zawał serca. Rozwinęła się u nich bądź rozwinie się pozawałowa niewydolność serca (HF). W Polsce obecnie żyje ok. 700 tys. chorych z HF, na świecie liczba ta sięga ok. 20 mln. Mimo wprowadzonego leczenia farmakologicznego beta-adrenolitykami, inhibitorami konwertazy płucnej i antagonistami aldosteronu prawie połowa chorych z niewydolnością serca po ostrym zespole wieńcowym nie przeżywa okresu 5 lat od zdarzenia. Oprócz metod nieinwazyjnych, w leczeniu niewydolności serca coraz większą rolę odgrywają metody inwazyjne: resynchronizacja skurczu serca czy też chirurgiczny remodeling lewej komory, które dają lepsze rokowanie odległe w porównaniu z farmakoterapią. W związku z rozwijającą się od kilku lat medycyną rekonstrukcyjną, co spowodowane było odkryciami związanymi z komórkami multipotencjalnymi, naturalne wydaje się sięgnięcie w leczeniu niewydolności mięśnia serca po sposób polegający na próbie odtworzenia funkcji uszkodzonej w wyniku niedokrwienia ściany lewej komory. Już Klug i wsp. dowiedli w swej pracy możliwości różnicowania embrionalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i ich skutecznej implantacji w ścianę lewej komory serca dorosłej myszy [1]. Dylematy etyczne związane z wykorzystaniem komórek embrionalnych zostały pokonane, kiedy Orlic i inni donieśli na łamach Nature o możliwości regeneracji uszkodzonego zawałem miokardium myszy poprzez implantację jednojądrowych komórek szpikowych pobranych od osobników dorosłych [2]. Zastosowanie autologicznych komórek multipotencjalnych jest metodą pozbawioną konieczności stosowania immunosupresji u biorcy, nie budzi zastrzeżeń etyczno-prawnych, uzyskanie i przygotowanie komórek do implantacji jest stosunkowo łatwe. Krążące komórki multipotencjalne krwi, komórki multipotencjalne szpikowe i mioblasty mięśni szkieletowych są obecnie komórkami najczęściej wykorzystywanymi do implantowania w mięsień serca [3]. Komórki multipotencjalne można implantować w miokardium drogą naczyń wieńcowych (zarówno żylnych, jak i tętniczych), transendokardialnie (kardiologia inwazyjna) bądź transepikardialnie (operacje kardiochirurgiczne) [4, 5]. W badaniu TOPCARE-AMI (ang. Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction) wykazano skuteczność dowieńcowej infuzji autologicznych komórek multipotencjalnych (zarówno szpikowych, jak i krążących we krwi) w 4. dobie od incydentu wieńcowego w leczeniu pozawałowego remodelingu lewej komory serca. Badanie przeprowadzono na grupie 20 chorych [4]. Na skuteczność zastosowania jednojądrowych szpikowych komórek macierzystych w leczeniu przewlekłej ischemicznej niewydolności serca zwrócili uwagę w swej pracy Perin i Dohmann. Implantowali oni zawiesinę komórek transendokardialnie (systemem mapingu elektromechanicznego NOGA) u pacjentów z ciężką niedokrwienną, przewlekłą niewydolnością serca, uzyskując znamienną poprawę frakcji wyrzutowej lewej komory serca i poprawę tolerancji wysiłku u leczonych pacjentów [6]. Implantacja zawiesiny komórek macierzystych wywiera znaczący wpływ na miokardium zarówno na poziomie komórkowym, jak i tkankowym. Wywołuje fuzję komórek implantowanych, somatycznych i rezydentnych komórek pnia, uwalnia czynniki wzrostu, cytokiny, chemokiny, pobudza wytwarzanie kolagenu, elastyny, proteoglikanów. Na poziomie tkankowym objawia się to stabilizacją zrębu pozakomórkowego, mobilizacją lokalnych komórek pnia i macierzystych komórek szpiku, pobudzeniem neoangiogenezy i transdyferencjacją do kardiomiocytów. Wszystko to daje w efekcie poprawę funkcji hemodynamicznej serca [7, 8]. Wszczepienie i różnicowanie do miocytów, uzyskanych ze szpiku komórek macierzystych, poprawia miejscową kurczliwość uszkodzonych obszarów mięśnia serca w podobnym stopniu co wszczepienie mioblastów uzyskanych z mięśni szkieletowych [9]. Własne komórki szpikowe, tak jak rozmnożone in vitro autologiczne komórki serca wszczepione w region zawału, poprawiają funkcję lewej komory poprzez zapobieganie pozawałowemu ścieńczeniu ściany serca [10]. Bardzo obiecujące efekty przynosi kombinowana implantacja autologicznych komórek szpikowych z rozmnożonymi mioblastami [11]. W kardiochirurgii zastosowano zarówno mioblasty, jak i autologiczne komórki szpikowe. Menasche z zespołem zapoczątkowali w Paryżu wszczepianie rozmnażanych autologicznych mioblastów chorym z niedokrwienną kardiomiopatią podczas operacji pomostowania tętnic wieńcowych w krążeniu pozaustrojowym (CABG). Obecnie prowadzony jest pod ich kierownictwem wieloośrodkowy program MAGIC, będący drugą fazą rozpoczętych przez nich badań klinicznych nad wszczepianiem mioblastów [12]. Równolegle do prac z mioblastami prowadzone są obecnie badania z zastosowaniem komórek szpikowych podczas CABG w celu regeneracji mięśnia serca. Stamm i inni badacze z ośrodka w Rostoku opublikowali artykuł omawiający skuteczne wszczepienie u dziewięciu chorych, podczas pomostowania naczyń wieńcowych w krążeniu pozaustrojowym, autologicznych komórek szpikowych linii AC133+ [13]. Galinanes i jego współpracownicy z Leicester zastosowali metodę implantacji komórek szpiku, pobranych śródoperacyjnie z mostka i zawieszonych w osoczu, w bliznę pozawałową miokardium, połączoną z rewaskularyzacją tego obszaru w krążeniu pozaustrojowym, uzyskując poprawę jego kurczliwości [14]. Wszczepianie komórek macierzystych zaczęto też kojarzyć z innymi metodami operacyjnego leczenia niewydolności serca. Oliveira z zespołem z Heart Institute w Sao Paulo połączyli implantację komórek szpikowych z przezmięśniową laserową rewaskularyzacją serca (TMLR) [15]. Medycyna rekonstrukcyjna serca wkracza odważnie w XXI wiek i z pewnością za kilka lat przyniesie odpowiedź na pytanie, czy potrafimy w pełni kontrolować i wykorzystać potencjał komórek macierzystych.
Cel
Celem pracy było wykazanie skuteczności i bezpieczeństwa leczenia pozawałowej niewydolności serca poprzez implantację własnych macierzystych komórek szpikowych (ABMCI), skojarzoną z pomostowaniem tętnic wieńcowych bez użycia krążenia pozaustrojowego (OPCAB).
Materiał i metody
Na prowadzenie pracy uzyskano zgodę Komisji Etycznej Wojskowego Instytutu Medycznego (WIM) w Warszawie. Do badania włączono od stycznia 2004 roku 10 pacjentów (dwie kobiety i ośmiu mężczyzn) ze średnią wieku 57,8 lat z pozawałową niewydolnością mięśnia serca, ze ścieńczeniem miokardium w obszarze ściany przedniej, zakwalifikowanych do pomostowania tętnic wieńcowych bez krążenia pozaustrojowego. U pacjentów nie stwierdzono schorzeń hematologicznych, nie chorowali oni na cukrzycę, poziom przedoperacyjny CRP wynosił poniżej 1 mg/dl, frakcja wyrzutowa lewej komory serca wynosiła średnio 21,26% (SD±11,88) w badaniu 64-rzędową spiralną tomografią komputerową (HCT), wykonywanym przedoperacyjnie (kilka do kilkunastu dni przed operacją). Wszystkich chorych poinformowano o rodzaju planowanego leczenia i uzyskano pisemną zgodę na proponowaną operację. W dniu operacji, w znieczuleniu ogólnym z intubacją, na sali operacyjnej pobierano chorym z obu talerzy kości biodrowych poprzez punkcję 150 ml szpiku kostnego na podłoże RPMI z dodatkiem heparyny i antybiotyku. Po pobraniu szpiku chorzy przenoszeni byli na oddział opieki pooperacyjnej, gdzie oczekiwali ok. 3 godziny na rozpoczęcie zabiegu pomostowania tętnic wieńcowych. W tym czasie pobrany szpik był poddawany procedurze izolacji komórek jednojądrowych metodą gradientów gęstości w Zakładzie Transfuzjologii i Transplantologii Centralnego Szpitala Klinicznego WIM. Izolacja odbywała się z zachowaniem warunków jałowości. W celu sprawdzenia poprawności metody oznaczano całkowitą liczbę komórek jednojądrowych i CD34+ w materiale metodą cytofluorometrii (aparat „FACS CALIBUR” Becton-Dickinson), uzyskując w badanych próbkach średnią liczbę komórek jednojądrowych 282,724 (SD±120,5344)x106, a komórek CD34+ 3,013905 (SD±2,109996)x106. Ostatecznie uzyskane komórki były zawieszane w soli fizjologicznej do objętości całkowitej zawiesiny około 7,5 ml. Tak przygotowana zawiesina była rozdzielana w sali operacyjnej do strzykawek w dawkach od 0,2 do 0,5 ml w celu implantacji w miokardium. W międzyczasie chory poddawany był operacji wszczepienia pomostów wieńcowych, z opóźnieniem od momentu pobrania szpiku, pozwalającym na przygotowanie zawiesiny komórek macierzystych. U wszystkich chorych w znieczuleniu ogólnym z intubacją, z dostępu przez sternotomię, wykonywano pomosty wieńcowe na bijącym sercu za pomocą stabilizatora Octopus (firmy Medtronic), bez użycia krążenia pozaustrojowego. Po wykonaniu pomostów i odwróceniu działania heparyny siarczanem protaminy w wybrane regiony ściany lewej komory implantowano zawiesinę komórek macierzystych w miokardium poprzez iniekcje (około 1 iniekcji na 1 cm²) igłą 0,5x25 mm. U chorych wykonano od 12 do 25 iniekcji zawiesiny komórek macierzystych (o sumarycznej objętości od 7,5 do 8,0 ml), średnio 19,4 iniekcji u jednego chorego (SD±3,2). Wykonano średnio 1,9 (SD±–0,9) pomostów wieńcowych u jednego chorego (tab. I). Po sprawdzeniu hemostazy zamykano klatkę piersiową w sposób typowy. W czasie operacji i w przebiegu wczesnopooperacyjnym monitorowano rzut serca metodą termodylucji oraz prowadzono obserwację ewentualnych zaburzeń rytmu serca, monitorowano ewentualny wzrost wybranych markerów uszkodzenia miokardium (troponina I, CPKMB) oraz postępowano z chorymi w sposób typowy dla leczenia pacjentów po operacjach kardiochirurgicznych. Od 3. miesiąca po zabiegu u chorych wykonywano kontrolne badania przy użyciu 64-rzędowej spiralnej tomografii komputerowej (aparat VCT LightSpeed firmy General Electric, dane opracowywano przy użyciu firmowego oprogramowania konsoli) w celu monitorowania zmian funkcji i geometrii lewej komory serca.
Wyniki
Wyniki wczesne
Wszyscy chorzy (n=10) przeżyli operację i pomyślnie przeszli okres pooperacyjny. U chorych nie obserwowano powikłań hematologicznych, miejscowych ani zwiększonego drenażu pooperacyjnego. Nie wykonano żadnej rewizji śródpiersia. U dziewięciu chorych (n=9) w przebiegu pooperacyjnym nie obserwowano wzrostu troponiny I, CKMB ani transaminaz. U żadnego z opisywanych pacjentów nie stwierdzono w 48-godzinnej obserwacji komorowych zaburzeń rytmu. Chorzy (n=9) w przebiegu pooperacyjnym wymagali jedynie stosowania dopaminy w dawce do 2 µg/kg/min. Między 6. a 24. godziną po zakończeniu operacji u opisywanych pacjentów występował znamienny wzrost CI, który utrzymywał się do 48. godziny po zabiegu i końca pomiarów (średni CI przed operacją 2,12 l/m² min, SD±0,48, średni CI 24 godz. po operacji 3,5 l/m² min, SD±0,92; p=0,002, test T) (ryc. 1.). Średni czas pobytu na oddziale pooperacyjnym wynosił dla dziewięciu chorych 2,5 doby. U jednego pacjenta (n=1), u którego w czasie indukcji znieczulenia do pomostowania tętnic wieńcowych wystąpiło nagłe zatrzymanie krążenia w mechanizmie migotania komór (po defibrylacji zabieg kontynuowano bez komplikacji), wystąpił w przebiegu pooperacyjnym niewielki wzrost poziomu troponiny I i CKMB. Zastosowano u niego w leczeniu kontrapulsację wewnątrzaortalną (do 2. doby po operacji) oraz przedłużono (do 5. doby od operacji) stosowanie amin katecholowych i pobyt na oddziale pooperacyjnym. Wszyscy chorzy zostali wypisani do domu w stanie dobrym.
Wyniki średnio odległe
W dalszym przebiegu pooperacyjnym monitorowano od 3 miesięcy po zabiegu ewentualny przyrost grubości ściany mięśnia serca i poprawę funkcji lewej komory przy użyciu 64-rzędowej spiralnej tomografii komputerowej. W badanej grupie osób wystąpił przyrost średniej frakcji wyrzutowej (przed operacją EF% śr. 21,26, SD±11,88, po operacji EF% śr. 29,06, SD±10,13, p=0,07, test T) (ryc. 2.). U chorych stwierdzono również istotny przyrost grubości ściany przedniej lewej komory (ryc. 3.). Średni przyrost ściany przedniej wynosił u opisywanych pacjentów 2,38 mm (SD±2,07, p=0,04, test T). Zaobserwowano również nieznamienny przyrost grubości ściany przednio-bocznej: 1,48 mm (SD±2,62, p=0,11, test T). Przyrost grubości ściany był zdecydowanie wyrażony u dwóch chorych, miejscami nawet dwukrotny (ryc. 4.). Wszyscy pacjenci deklarowali zdecydowanie lepszą tolerancję wysiłku po operacji i poprawę komfortu życia w stosunku do okresu przedoperacyjnego.
Wyniki odległe
Chorzy (n=8) obserwują dużo lepszą tolerancję wysiłku w stosunku do okresu przedoperacyjnego. Dwóch opisywanych pacjentów (n=2) w okresie pół roku od operacji wymagało tygodniowej hospitalizacji z powodu zaostrzenia niewydolności krążenia. Jeden chory (n=1) zmarł w domu w rok po operacji w niewyjaśnionych okolicznościach.
Dyskusja
Wykorzystanie komórek macierzystych do standardowego leczenia niewydolności mięśnia serca i do regeneracji ischemicznych jego uszkodzeń wymaga jeszcze wielu lat badań i opracowań skutecznych metod terapii. Wszystkie prowadzone do tej pory badania, za wyjątkiem wspomnianego już programu MAGIC, dotyczą małych grup chorych. Spodziewane korzyści wynikające z terapii rekonstrukcyjnej serca wydają się jednak warte poświęconego trudu, co skłania coraz większą liczbę badaczy do pracy nad tą metodą leczenia. Ważne wydaje się określenie, które komórki multipotencjalne okażą się najbardziej skuteczne w odbudowie miokardium: mioblasty rozmnażane z mięśni szkieletowych, macierzyste komórki szpiku czy może komórki multipotencjalne krążące we krwi. Zdecydowaliśmy się na wykorzystanie komórek szpikowych z racji stosunkowo łatwego ich pozyskiwania, krótkiego czasu preparowania, braku konieczności rozmnażania in vitro w celu uzyskania pożądanej ilości komórek (redukcja ryzyka infekcji czy nowotworzenia). Komórki szpikowe nie dają też po implantacji, jak to wykazaliśmy, zaburzeń rytmu serca, które to opisywane są po wszczepieniu mioblastów. Być może w przyszłości celowe okażą się jeszcze modyfikacje genetyczne przygotowywanych do wszczepienia komórek w celu zapewnienia ich różnicowania do pożądanej komórki docelowej bądź zapewnienia wytwarzania czynników wzrostu w miejscu implantacji (VEGF, HGF) [16–18]. W perspektywie jest również ewentualne wykorzystanie deponowanych obecnie autologicznych macierzystych komórek pępowinowych. Równie ważny jak rodzaj implantowanych komórek jest sposób ich implantacji: wewnątrznaczyniowo, transendokardiolnie lub transepikardialnie. Podawanie zawiesiny komórek do tętnic wieńcowych wiąże się z ryzykiem zatoru, a ponadto trudno jest określić, ile komórek pozostanie w pożądanym miejscu, a ile zostanie uniesionych z prądem krwi, czy nie dojdzie w przyszłości do zarastania światła naczynia. Bardzo interesujące wydaje się implantowanie komórek do miokardium przez przekłucie ściany żyły wieńcowej specjalnym cewnikiem. W naszej pracy zdecydowaliśmy się na implantację transepikardialną, gdyż naszym zdaniem daje ona możliwość pełnej kontroli miejsca i przebiegu implantacji. Liczyć się należy również z tym, iż potencjalni kandydaci do wszczepienia komórek wymagają wykonania pomostów wieńcowych w celu zapewnienia właściwego ukrwienia obszarów z implantami. Konieczne jest wieloletnie obserwowanie późnych następstw wszczepienia komórek macierzystych (infekcje, nowotworzenie), choć komórki autologiczne wydają się być bardzo bezpieczne w zastosowaniu.
Wnioski
W naszej pracy wykazaliśmy, iż bezpiecznie można implantować własne komórki macierzyste podczas pomostowania tętnic wieńcowych bez użycia krążenia pozaustrojowego. Wykazaliśmy również wzrost grubości ściany lewej komory po implantacji komórek multipotencjalnych (miejscami nawet dwukrotny przyrost grubości ściany), co zgodnie z prawem Laplace’a; naprężenie ścian lewej komory = (promień lewej komory) x (ciśnienie śródkomorowe) / 2 x grubość ściany lewej komory daje prawie czterokrotne zmniejszenie siły naprężenia ściany lewej komory i zahamowanie rozwoju dyskinezy. Zastosowana metoda leczenia poprawiła parametry hemodynamiczne serca, a co za tym idzie – komfort życia chorych. Pacjenci (n=8) w większości wrócili do czynnego życia rodzinnego, społecznego i zawodowego. Praca była prezentowana na 8. Gdańskich Spotkaniach Kardiochirurgicznych, 20–21 stycznia 2006 r., Gdańsk.

Piśmiennictwo:
1. Klug MG, Soonpaa MH, Koh GY, Field LJ. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts.
J Clin Invest 1996; 98: 216-224. 2. Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Jakoniuk I, Anderson SM, Li B, Pickel J, McKay R, Nadal-Ginard B, Bodine DM, Leri A, Anversa P. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 2001; 410: 701-705. 3. Menasche P. Cell transplantation in myocardium. Ann Thorac Surg 2003; 75 (6 Suppl): S20-S28. 4. Assmus B, Schachinger V, Teupe C, Britten M, Lehmann R, Dobert N, Grunwald F, Aicher A, Urbich C, Martin H, Hoelzer D, Dimmeler S, Zeiher AM. Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE-AMI). Circulation 2002; 106: 3009-3017. 5. Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R, Silva SA, Sousa AL, Mesquita CT, Rossi MI, Carvalho AC, Dutra HS, Dohmann HJ, Silva GV, Belém L, Vivacqua R, Rangel FO, Esporcatte R, Geng YJ, Vaughn WK, Assad JA, Mesquita ET, Willerson JT. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation 2003; 107: 2294-2302. 6. Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R, Silva SA, Sousa AL, Silva GV, Mesquita CT, Belém L, Vaughn WK, Rangel FO, Assad JA, Carvalho AC, Branco RV, Rossi MI, Dohmann HJ, Willerson JT. Improved exercise capacity and ischemia 6 and 12 months after transendocardial injection of autologous bone marrow mononuclear cells for ischemic cardiomyopathy. Circulation 2004; 110 (11 Suppl 1): II213-II218. 7. Fazel S, Tang GH, Angoulvant D, Cimini M, Weisel RD, Li RK, Yau TM. Current status of cellular therapy for ischemic heart disease. Ann Thorac Surg 2005; 79: S2238-S2247. 8. Nishida M, Li TS, Hirata K, Yano M, Matsuzaki M, Hamano K. Improvement of cardiac function by bone marrow cell implantation in a rat hypoperfusion heart model. Ann Thorac Surg 2003; 75: 768-773. 9. Thompson RB, Emani SM, Davis BH, van den Bos EJ, Morimoto Y, Craig D, Glower D, Taylor DA. Comparison of intracardiac cell transplantation: autologous skeletal myoblasts versus bone marrow cells. Circulation 2003; 108 Suppl 1: II264-II271. 10. Yau TM, Tomita S, Weisel RD, Jia ZQ, Tumiati LC, Mickle DA, Li RK. Beneficial effect of autologous cell transplantation on infarcted heart function: comparison between bone marrow stromal cells and heart cells. Ann Thorac Surg 2003; 75: 169-176. 11. Ott HC, Bonaros N, Marksteiner R, Wolf D, Margreiter E, Schachner T, Laufer G, Hering S. Combined transplantation of skeletal myoblasts and bone marrow stem cells for myocardial repair in rats. Eur J Cardiothorac Surg 2004; 25: 627-634. 12. Menasche P, Hagege AA, Vilquin JT, Desnos M, Abergel E, Pouzet B, Bel A, Sarateanu S, Scorsin M, Schwartz K, Bruneval P, Benbunan M, Marolleau JP, Duboc D. Autologous skeletal myoblast transplantation for severe postinfarction left ventricular dysfunction. J Am Coll Cardiol 2003; 41: 1078-1083. 13. Stamm C, Westphal B, Kleine HD, Petzsch M, Kittner C, Klinge H, Schumichen C, Nienaber CA, Freund M, Steinhoff G. Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration. Lancet 2003; 361: 45-46. 14. Galinanes M, Loubani M, Davies J, Chin D, Pasi J, Bell PR. Autotransplantation of Unmanipulated Bone Marrow Into Scarred Myocardium Is Safe and Enhances Cardiac Function in Humans. Cell Transplant 2004; 13: 7-13. 15. de Oliveira SA, Gowdak LH, Buckberg G, Krieger JE; RESTORE Group. Cell biology, MRI and geometry: insight into a microscopic/macroscopic marriage. Eur J Cardiothorac Surg 2006; 29 Suppl 1: S259-S265. 16. Askari A, Unzek S, Goldman CK, Ellis SG, Thomas JD, DiCorleto PE, Topol EJ, Penn MS. Cellular, but not direct, adenoviral delivery of vascular endothelial growth factor results in improved left ventricular function and neovascularization in dilated ischemic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol 2004; 43: 1908-1914. 17. Ninomiya M, Koyama H, Miyata T, Hamada H, Miyatake S, Shigematsu H, Takamoto S. Ex vivo gene transfer of basic fibroblast growth factor improves cardiac function and blood flow in a swine chronic myocardial ischemia model. Gene Ther 2003; 10: 1152-1160. 18. Duan HF, Wu CT, Wu DL, Lu Y, Liu HJ, Ha XQ, Zhang QW, Wang H, Jia XX, Wang LS. Treatment of myocardial ischemia with bone marrow-derived mesenchymal stem cells overexpressing hepatocyte growth factor. Mol Ther 2003; 8: 467-474.