Expression of leptin and its receptor in selected human cancers - preliminary results

WSTĘP

Leptyna, kodowana przez gen ob [1] jest polipeptydem o wybitnie plejotropowym działaniu: hormonem, wytwarzanym głównie przez tkankę tłuszczową, biorącym udział w regulacji masy ciała [2] i stymulującym wytwarzanie estrogenu [3] oraz cytokiną, biorącą udział w hemopoezie [4, 5], angiogenezie [6], modulacji wytwarzania cytokin przez limfocyty T pomocnicze [7], regulacji cyklu komórkowego i być może onkogenezie.


Receptor leptyny, kodowany przez gen db [8] na skutek alternatywnego składania pierwotnego transkryptu, występuje u człowieka w 4 izoformach [4, 5]. Receptor ten składa się z 3 części: zewnątrzkomórkowej, wiążącej ligand; błonowej (wspólna sekwencja dla wszystkich izoform) oraz cytoplazmatycznej, przekazującej sygnał do wnętrza komórki (w każdej z izoform różna liczba i sekwencja aminokwasów). Część cytoplazmatyczna długiej izoformy (OBR_L) zawiera 3 motywy aminokwasowe (kolejno, począwszy od N-końca): box 1 i box 2, wiążące JAK oraz box 3, wiążący STAT [9]. Przyłączenie leptyny do domeny cytoplazmatycznej izoformy OBRL indukuje homodimeryzację cząsteczek receptora oraz związanie JAK2 z sekwencjami box 1 i box 2. W ten sposób zaktywowana JAK2 może następnie uruchamiać kilka dalszych szlaków przekazywania sygnału:

1) szlak STAT przez fosforylację box 3 [10-14],

2) szlak MAPK, poprzez który leptyna aktywuje ekspresję genów c-fos, c-jun, junB i junD, kodujących czynniki transkrypcyjne [15-17],

3) szlak PI3K [18, 19],

4) szlak IRS-1 i IRS-2 [15].



Izoformy krótkie OBRs (OBRs1, OBRs2 i OBRs3) posiadają krótkie domeny cytoplazmatyczne, pozbawione box 2 i box 3. Izoformy te mają zdolność wiązania JAK2 z box 1 i aktywacji (choć nie tak silnej jak OBR_L) ww. szlaków przekazywania sygnału z wyjątkiem szlaku STAT (ze względu na brak box 3) [15, 16, 20].



Otwarte pozostaje pytanie o udział leptyny w onkogenezie. Za postawieniem tego pytania przemawia krytyczna rola szlaków przekazywania sygnału w komórce, przez które działa leptyna, w regulacji proliferacji, apoptozy i transformacji nowotworowej. W nowotworach przysadki zaobserwowano supresorowe działanie leptyny [21-23], natomiast działanie stymulujące onkogenezę zaobserwowano w białaczkach [24] oraz nowotworach jelita grubego i nerek [19]. Niniejsza praca dotyczy wstępnych wyników badania przesiewowego, którego celem jest zbadanie ekspresji leptyny i jej receptora w różnych ludzkich nowotworach.



MATERIAŁ I METODY


Ludzkie nowotworowe linie komórkowe

Badano 2 linie komórkowe komórkowe białaczek: Jurkat, udostępnioną przez dr. E. Kontny z Instytutu Reumatologii w Warszawie i K562, udostępnioną przez dr. Skórzaka z Centrum Onkologii - Instytutu im. M. Skłodowskiej-Curie w Warszawie oraz 2 linie komórkowe raka jajnika: OVCAR3, zakupioną w ATCC i OVP10, wyprowadzoną z pierwotnego guza jajnika i scharakteryzowaną przez dr B. Szaniawską w Centrum Onkologii - Instytutu im. M. Skłodowskiej-Curie w Warszawie.



Komórki Jurkat i K562 hodowano w podłożu RPMI 1640 z 2 mM L-glutaminą i 10 proc. FCS. Komórki OVCAR3 hodowano w podłożu RPMI 1640 z 2 mM L-glutaminą, 20 proc. FCS i 10 μg/ml insuliny wołowej. Komórki OVP10 hodowano w podłożu RPMI 1640 z 2 mM L-glutaminą, 10 proc. FCS i 5 μg/ml insuliny wołowej. Do wszystkich podłóż dodawano 100 IU/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Wszystkie odczynniki do hodowli pochodziły z firmy Sigma.



Fragmenty ludzkich tkanek

Badaniem objęto nowotwory niezłośliwe jajnika (3 przypadki) oraz pierwotne raki: jajnika (4 przypadki), piersi (2 przypadki), prostaty (1 przypadek), nerek (1 przypadek) i pęcherza moczowego (3 przypadki), a także guz przerzutowy nowotworu jądra (1 przypadek). Fragment tkanki tłuszczowej uzyskano z torebki tłuszczowej, otaczającej nerkę usuniętą pacjentowi z powodu wodonercza połączonego z marskością nerki bez zmian nowotworowych. Tkanki natychmiast po usunięciu operacyjnym umieszczano w soli fizjologicznej o temp. 4^oC. W ciągu kilkunastu minut fragmenty przeznaczone do izolacji RNA zamrażano w ciekłym azocie i tam przechowywano. Pozostałe fragmenty tkanek służyły do przeprowadzenia diagnostyki histopatologicznej.



Zgodę na prowadzenie badań wyraziła Komisja Etyczna CSK WAM. Wszyscy pacjenci, których fragmenty tkanek były używane do badań, zostali pisemnie poinformowani o celu badań oraz podpisali protokół świadomej zgody.



Preparatyka RNA i RT/PCR

Całkowity RNA izolowano z komórek pochodzących z hodowli i fragmentów ludzkich tkanek metodą oczyszczania na kolumnach (Rneasy Mini Kit, Qiagen). Preparaty RNA trawiono Dnazą I (Rnase-Free Dnase Set, Qiagen) w celu zupełnego oczyszczenia z resztek genomowego DNA. Reakcję odwrotnej transkrypcji wykonywano przy użyciu zestawu Omniscript RT Kit (Qiagen), używając jako starterów losowych sześcionukleotydów lub oligodT (Gibco-BRL). PCR wykonywano przy użyciu zestawu Taq PCR Master Mix Kit (Qiagen). Sekwencje używanych starterów, zakupionych w firmie TIB MOLBIOL (Poznań), przedstawiono w tab. 1. Warunki PCR były następujące: 95 (C 15 min; (94^oC 30 s; 59^oC 30 s; 72^oC 1 min) - 30 cykli dla amplifikacji GAPDH i LPL lub 40 cykli dla amplifikacji OB i OBRu; 72^oC 10 min. Wyniki analizowano za pomocą rozdziału elektroforetycznego produktów reakcji w 1,5-procentowym żelu agarozowym.



WYNIKI

W każdej serii oznaczeń za pomocą RT/PCR wykonano kontrolę negatywną z użyciem wody zamiast RNA, kontrolę bez użycia odwrotnej transkryptazy w celu wykluczenia zanieczyszczenia RNA genomowym DNA oraz kontrole pozytywne z użyciem RNA, wyizolowanego z tkanki tłuszczowej, w której zachodzi ekspresja lipazy lipoproteinowej [27], leptyny i jej receptora [31]. Z każdym preparatem RNA z linii komórkowych lub guzów nowotworowych po przeprowadzeniu RT, wykonano następujące reakcje PCR:

1) ze starterami dla genu gapdh, który ulega konstytutywnej ekspresji w każdej żywej komórce - w celu potwierdzenia integralności otrzymanego cDNA. Do dalszych badań używano tylko tych preparatów RNA, w których stwierdzono wyraźną ekspresję genu gapdh;

2) ze starterami dla genu lpl, ulegającego specyficznej ekspresji w adipocytach - w celu wykluczenia zanieczyszczenia badanych fragmentów guzów nowotworowych tkanką tłuszczową. Do dalszych badań używano tylko tych preparatów RNA, w których nie wykryto ekspresji genu lpl;

3) ze starterami dla genu ob;

4) ze starterami dla genu obr - parę starterów OBRu-1 i OBRu-2 tak dobrano, że amplifikacji ulegał fragment cDNA wspólny dla wszystkich izoform receptora.



Wyniki przykładowych reakcji pokazano na ryc. Wszystkie otrzymane wyniki przedstawiono w tab. 2.



OMÓWIENIE WNIOSKÓW

Wykrycie ekspresji receptora leptyny w liniach komórkowych białaczek: Jurkat i K562 jest zgodne z danymi literaturowymi [24]. Spośród wszystkich badanych nowotworów właśnie w powstawaniu białaczek najlepiej jest udokumentowany udział leptyny. Leptyna, wytwarzana przez adipocyty i komórki podścieliska jest jednym z regulatorów multipotencjalnych komórek macierzystych. Podczas normalnej hemopoezy OBRL i OBRu ulegają ekspresji w komórkach CD34+, a potem ekspresja ta zanika w promielocytach, natomiast komórki białaczkowe zachowują ekspresję tych dwóch izoform [24, 32]. Niniejsza praca wykazała brak ekspresji leptyny w liniach Jurkat i K562, co wyklucza autokrynne działanie leptyny na te komórki.

Dane literaturowe mówią jedynie o wykryciu ekspresji receptora leptyny w zdrowych jajnikach [5, 33]. W niniejszej pracy w obu badanych liniach komórkowych raka jajnika: OVCAR3 i OVP10 nie stwierdzono ekspresji leptyny i tylko w linii OVCAR3 stwierdzono ekspresję jej receptora. W nowotworach niezłośliwych jajnika nie stwierdzono ekspresji leptyny ani jej receptora; natomiast we wszystkich trzech badanych rakach jajnika stwierdzono ekspresję receptora leptyny, a w jednym z nich ekspresję leptyny. Obserwacje te mogą sugerować związek między ekspresją receptora leptyny a złośliwością nowotworu.



Ekspresję leptyny stwierdzono w normalnych komórkach nabłonkowych piersi [34], a także w normalnej linii komórkowej oraz w rakach przewodowych piersi, przy czym w guzach przerzutowych obserwowano silniejszą ekspresję leptyny niż w guzach pierwotnych [35]. W niniejszej pracy natomiast nie stwierdzono ekspresji leptyny w dwóch zbadanych pierwotnych rakach przewodowych piersi, natomiast w obu stwierdzono ekspresję receptora leptyny.



Dane literaturowe mówią o ekspresji receptora leptyny w zdrowej prostacie, jądrach i nerce [5]. W niniejszej pracy w raku prostaty nie stwierdzono ekspresji leptyny, natomiast w raku jasnokomórkowym nerki i guzie przerzutowym raka jądra do węzłów chłonnych stwierdzono ekspresję obu tych białek.



Brak danych literaturowych, dotyczących ekspresji leptyny i jej receptora w zdrowym pęcherzu i raku tego narządu. W niniejszej pracy nie stwierdzono ekspresji leptyny w 3 zbadanych rakach pęcherza, natomiast w 1 z nich stwierdzono ekspresję receptora leptyny.



Opisane w niniejszej pracy wyniki dotyczą tylko 4 komórkowych linii nowotworowych i 15 guzów nowotworowych. Tak mały i rozproszony materiał nie upoważnia autorów do wyciągania ostatecznych wniosków, jednakże jego analiza nasuwa pewne przypuszczenia:

1) ekspresja leptyny i jej receptora jest bardzo zróżnicowana w nowotworach wywodzących się z różnych narządów, a nawet w obrębie tych samych pod względem histopatologicznym nowotworach;

2) jednoczesna ekspresja leptyny i jej receptora przez niektóre nowotwory może sugerować autokrynny wpływ tej cytokiny na podziały komórek nowotworowych;

3) ekspresja receptora leptyny przy braku ekspresji leptyny może sugerować systemowy (przez leptynę obecną w surowicy) lub parakrynny (przez leptynę wytwarzaną przez komórki mikrośrodowiska) wpływ tej cytokiny na podziały komórek nowotworowych.



PIŚMIENNICTWO
1. Isse N, Ogawa Y, Tamura N, et al. J Biol Chem 1995; 270: 27728-33.
2. Zhang Y, Proenca R, Maffei M, Barone M, Leopold L, Friedman JM. Nature 1994; 372: 425-32.
3. Kitawaki J, Kusuki I., Koshiba H, Tsukamoto K, Hanjo H. Mol Hum Repr 1999; 5: 708-3.
4. Bennett BD, Solar GP, Yuan JQ, Mathias J, Thomas GR, Matthews W. Cur Biol 1996; 6: 1170-80.
5. Cioffi JA, Shafer AW, Zupancic TJ, Smith-Gbur J, Mikhail A, Platika D, Snodgrass HR. Nature Med 1996; 2: 585-9.
6. Sierra-Honigmann M, Nath A. K, Murakami Ch, et al. Science 1998; 281: 1683-6.
7. Lord GM, Materese G, Howard JK, Baker RJ, Bloom SR, Lechler RI. Nature 1998; 394: 897-901.
8. Tartaglia LA, Dembski M, Weng X, et al. Cell 1995; 83: 1263-71.
9. Chen H, Charlat O, Tartaglia L, et al. Cell 1996; 84: 491-5.
10. Ghilardi N, Ziegler S, Wiestner A, Stoffel R, Heim MH, Skoda RC. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 6231-5.
11. Stahl N, Farruggella TJ, Bolton TG, Zhong Z, Darnell JE, Yancopulos GD. Science 1995: 267: 1349-53.
12. Takahashi Y, Okimura Y, Mizuno I, Takahashi T, Kaji H, Uchiyama T, Abe H, Chihara K. Bioch Bioph Res Comm 1996; 228: 859-64.
13. Baumann H, Morella KK, White DW, Dembski M, Bailon PS, Kim H, Lai CF, Tartaglia LA. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 8374-8.
14. White DW, Kuropatwinski KK, Devos R, Baumann H, Tartaglia LA. J Biol Chem 1997; 272: 4065-71.
15. Bjorbaek Ch, Uotani Sh, da Sliva B, Fliers JS. J Biol Chem 1997; 272: 32686-95.
16. Murakami T, Yamashita T, Iida M, Kuwajima M, Shima K. Biol Bioph Res Comm. 1997; 231: 26-9.
17. Morton NM, Emilsson V, Liu YL, Cawthorne MA. J Biol Chem 1998; 273: 26194-201.
18. Wang Y, Kuropatwinski KK, White DW, Hawley TS, Hawley RG, Tartaglia LA, Baumann H. J Biol Chem 1997; 272: 16216-23.
19. Attoub S, Noe V, Pirola L, Bruyneel E, Chastre E, Mareel M, Wymann MP, Gespach Ch. FASEB J 2000; 14: 2329-38.
20. Yamashita T, Murakami T, Otani S, Kuwajima M, Shima K. Bioch Bioph Res Comm 1998; 246: 752-9.
21. Shimon I, Yan X, Magoffin DA, Friedman TC, Melmed S. J Clin Endocrinol Met 1998; 83: 4059-64.
22. Jin L, Burguera BG, Couce ME, Scheithauer BW, Lamsan J, Eberhardt NL, Kulig E, Lloyd RV. J Clin Endocrinol Met 1999; 84: 2903-11.
23. Vidal S, Cohen SM, Horvath E, Kovacs K, Scheithauer BW, Burguera BG, Lloyd RV J Histochem Cytochem 2000; 48: 1147-52.
24. Konopleva M, Mikhail A, Estrov Z, et al. Blood 1999; 93: 1668-76.
25. Ercolani L, Florence B, Denaro M, Alexander M. J Biol Chem 1988; 263: 15335-41.
26. Brossart P, Keilholz U, Scheibenbongen C, Mohler T, Willhauck M, Hunstein W. J Immunol, 1994; 15: 38-41.
27. Wion KL, Kirchgessner TG, Lusis AJ, Lusis AJ, Schotz MC, Lawn RM. Science 1987; 235: 1638-41.
28. Deeb SS, Peng R. Biochemistry 1989; 28: 4131-5.
29. Oka K, Tkalcevic GT, Nakano T, Tucker H, Ishimura-Oka K, Brown WV. Bioch Biophys Acta 1990; 1049: 21-6.
30. Chung WK, Power-Kehoe L, Chua M, Lee R, Leibel RL. Genome Res 1996; 12: 1192-9.
31. Kielar D, Clark JSC, Ciechanowicz A, Kurzawski G, Sulikowski T, Naruszewicz M. Metabolism 1998; 47: 844-7.
32. Nakao T, Hino M, Yamane T, Nishizawa Y, Morii H. Br J Hematol 1998; 102: 740-5.
33. Karlsson C, Lindell K, Svesson E, et al. J Clin Endocrinol Met 1997; 82: 4144-8.
34. Smith-Kirwin SM, O'Connor DM, De Johnston J, Lancey ED, Hassink SG, Funanage VL. J Clin Endocrinol Met 1998, 83: 1810-3.
35. O'Brien SN, Welter BH, Price TM. Bioch Bioph Res Comm 1999; 259: 695-8.

Wykaz skrótów używanych w artykule:

ATCC (American Type Culture Collection) - Amerykański Bank Linii Komórkowych; FCS (fetal calf serum) - płodowa surowica cielęca; GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) - dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego; IRS-1, IRS-2 (insulin-like receptor substrate -1, -2); JAK (Janus kinase) - kinazy Janus; LPL (lipoprotein lipase) - lipaza lipoproteinowa; MAPK (mitogen activated protein kinase) - kinaza białkowa aktywowana mitogenem; PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) - kinaza fosfatydyloinozytolu; PCR (polymerase chain reaction); RT (reverse transcription or reverse transcriptase) - odwrotna transkrypcja (reakcja) lub odwrotna transkryptaza (enzym); STAT (signal transduction and activation of transcription) - białka przekazujące sygnał i aktywujące transkrypcję.



ADRES DO KORESPONDENCJI

dr med. Jolanta Szenajch

Laboratorium Onkologii Molekularnej

Klinika Onkologii

Centralny Szpital Kliniczny

Wojskowa Akademia Medyczna

ul. Szaserów 128

00-909 Warszawa

tel. (022) 681 70 92, 681 70 95

fax (022) 610 30 98

e-mail: jolaszen@cskwam.mil.pl