The evaluation of the effectivness of RESAN vaccine in the prophylaxis and the treatment of endometriosis – an experimental study with the animal model. Part II – prevention of the adhesions

Zrosty, mające przeważnie postać cienkich pasm tkanki łącznej, są to patologiczne połączenia pomiędzy powierzchniami otrzewnej trzewnej i/lub ściennej [1]. Formowanie się pooperacyjnych zrostów otrzewnowych zależy zarówno od rodzaju i rozległości przeprowadzanego zabiegu, jak i stanu ogólnego oraz układu immunologicznego pacjentki. Przyczyną ich powstawania są najczęściej urazy i niedotlenienie tkanek podczas operacji chirurgicznych i ginekologicznych, a także stosowane w trakcie zabiegów rękawice talkowane i materiały chirurgiczne. Ponadto do powstawania de novo zrostów otrzewnowych na powierzchni narządów miednicy mniejszej dochodzi także w przypadku przewlekłych stanów zapalnych miednicy mniejszej i w przebiegu endometriozy.
Stopień odczuwania bólu w endometriozie nie jest proporcjonalny do stopnia zaawansowania choroby i rozległości zrostów. Niestety, związek między obecnością zrostów a natężeniem bólu nie jest do końca poznany. Statystycznie częściej dolegliwości bólowe towarzyszą cienkim zrostom w przebiegu endometriozy jajnikowej oraz minimalnej i łagodnej endometriozie (głównie w I i II stopniu zaawansowania klinicznego) [2]. Być może takie zrosty, umiejscowione na powierzchni jajników i otrzewnej, poprzez ciągłe zmiany napięcia i anatomii, są przyczyną przewlekłego bólu [3]. Wydaje się także, iż obecność włókien nerwowych w obrębie zrostów może być przyczyną dolegliwości bólowych odczuwanych przez pacjentkę [1, 4, 5]. Jednakże w wytworzonej w przebiegu endometriozy tkance łącznej zrostów występują głównie komórki zapalne, rzadziej nerwowe [4].
Powstałe w przebiegu choroby liczne zrosty upośledzają prawidłowe funkcjonowanie narządów wewnętrznych. W III i IV stopniu zaawansowania klinicznego wytworzone zrosty okołojajnikowe i jajowodowe są prawdopodobnie główną przyczyną niepłodności. Zmienione strzępki lub zarośnięte ujście brzuszne jajowodu nie jest w stanie przechwycić oocytu lub też może nie dochodzić do owulacji wskutek licznych zrostów tkankowych [6].
Zalecanym sposobem postępowania terapeutycznego w endometriozie jest leczenie chirurgiczne. Jajniki i jajowody są jednak szczególnie podatne na pooperacyjne tworzenie się zrostów. Ponowne ich formowanie po zabiegach na przydatkach (po wycięciu torbieli czy zmian endometrioidalnych lub w przypadku obustronnej klinowej resekcji jajników) obserwuje się aż u 90% kobiet [7]. Już w 8. dniu po zabiegach laparoskopowych, odtwarzających ciągłość jajowodów, oraz po plastyce strzępków lub po rozdzielaniu zrostów okołojajowodowych w 50% przypadków stwierdza się ich powtórne wytwarzanie [8]. Makroskopowy wygląd zrostów pozwala natomiast wstępnie ocenić ryzyko ich ponownego formowania się. Zrosty grube i w konglomeratach tkankowych mają większą tendencję do ponownego tworzenia się niż cienkie i przezroczyste. Cienkie pasma tkanki łącznej częściej towarzyszą natomiast endometriozie.
We wstępnych badaniach klinicznych dotyczących leczenia endometriozy zespół dr. Ovsienko zastosował szczepionkę RESAN. Wśród 24 kobiet z rozpoznaną endometriozą miednicy mniejszej po zakończeniu
doświadczenia zaobserwowano zmniejszenie się wymiarów torbieli endometrialnych oraz mięśniaków
macicy, a poziomy osoczowych markerów nowotworowych uległy istotnemu statystycznie obniżeniu [10].
Niestety, doświadczenie to nie zostało szczegółowo udokumentowane, a badana grupa była nieliczna i niejednorodna. Ponadto nie zwrócono uwagi na obecność zrostów otrzewnowych towarzyszących endometriozie. Należy zatem uznać, iż wyciąganie wniosków z cytowanego badania klinicznego nie jest możliwe.

Cel pracy

Celem pracy było określenie skuteczności szczepionki RESAN, zastosowanej w profilaktyce i leczeniu endometriozy miednicy mniejszej, w badaniu eksperymentalnym na modelu zwierzęcym, w odniesieniu do formowania się zrostów otrzewnowych.

Materiał i metody

Materiał do badań doświadczalnych stanowiło 58 dojrzałych szczurzyc szczepu Wistar. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach w Poznaniu. Osoby biorące udział w eksperymencie miały zezwolenia indywidualne.
Eksperyment przeprowadzono zgodnie z zaleceniami Ministerstwa Edukacji i Szkolnictwa Wyższego z 1959 r., jak i Światowej Deklaracji UNESCO odnośnie praw zwierząt z Paryża z 1978 r.
Zwierzęta przebywały w Katedrze i Zakładzie Toksykologii Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu. Szczury trzymano w plastikowych klatkach, w pomieszczeniu o stałej temperaturze (21°C) i wilgotności, z ciągłym dostępem do paszy i wody pitnej. Znormalizowana dieta szczurów zawierała 24% białka i była taka sama dla wszystkich zwierząt.
Szczepionka RESAN ma w składzie kompleksy molekuł więcej niż 40 różnych substancji. Szczegółowy skład szczepionki chroniony jest patentem RB nr 542883. Występuje pod postacią krystalicznego proszku (200 mg), który należy uzupełnić 0,9% solą fizjologiczną do objętości 1 ml.
Metodyka badania została szczegółowo opisana w części I pracy. Zwierzęta, w wieku ok. 4 mies. i o wadze 200–300 g, zostały podzielone na III grupy. Grupa I obejmowała 24 szczurzyce, którym na 3 mies. przed przystąpieniem do wszczepienia endometriozy, podano profilaktycznie szczepionkę. Grupie II (n=24) po usunięciu ognisk endometriozy z otrzewnej ściennej jamy brzusznej podano RESAN w celach leczniczych. Grupę III stanowiła grupa kontrolna (n=10), w której pominięto podanie szczepionki oraz wszczepienie endometriozy. Po przecięciu rogu macicy i założeniu szwów hemostatycznych, wolne końce pozostawiono w jamie otrzewnowej (sham operation). Na otrzewną założono szwy nylonowe, takie jak w grupach I i II podczas wszczepienia endometriozy. Podczas wszystkich operacji zwierzęta znieczulano pentobarbitalem.
Pierwszy etap badań polegał na podaniu szczepionki 24 szczurom, na 3 mies. przed planowanym wszczepieniem endometriozy (grupa I). Etap II eksperymentu to wszczepienie fragmentów endometrium do otrzewnej 48 szczurów (24 uprzednio zaszczepionym z grupy I i 24 zwierzętom z grupy II, którym wcześniej nie podano immunoprofilaktyki). W grupie III przecięto róg macicy i założono szwy hemostatyczne oraz szew na otrzewną. W etapie III usunięto fragmenty otrzewnej ściennej i materiału tkankowego z miejsca, gdzie 3 mies. wcześniej zostały wszczepione implanty endometrium. Równocześnie zwierzętom, które wcześniej nie zostały zaszczepione, podano RESAN (grupa II). Etap IV – po kolejnych 3 mies. – to ocena skuteczności leczenia endometriozy.
Utrwalone tkanki skrojono na mikrotomie, a następnie w sposób typowy przeprowadzono barwienie hematoksyliną i eozyną. W mikroskopie świetlnym dokonano oceny histologicznej wybarwionych preparatów w sposób ślepy, poszukując wykładników endometriozy. Wszystkie dodatnie preparaty zostały skonsultowane z drugim histopatologiem.
W ocenie makroskopowej za kryterium rozpoznania endometriozy przyjęto występowanie pęcherzyków (torbielek) wypełnionych przezroczystą treścią płynną i/lub cienkich zrostów wokół wszczepu, i/lub ognisk przekrwienia na otrzewnej ściennej jamy brzusznej.
Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej przy użyciu testu Fishera. Za poziom istotności statystycznej przyjęto wartość p<0,05.

Wyniki

Z powodu powikłań okołooperacyjnych zwierzęta nr 12 i 30 oddano do utylizacji.
W grupie I na 3 mies. przed wszczepieniem endometriozy podano immunoprofilaktykę preparatem RESAN (w I etapie eksperymentu). Podczas laparotomii kontrolnej (w III etapie badania doświadczalnego), po 3 mies. od wszczepienia endometrium ektopowego (II etap badania) i po 6 mies. od podania szczepionki (I etap doświadczenia) rozwój implantów w ocenie mikroskopowej potwierdzono u jednego z zaszczepionych zwierząt. W barwionych preparatach od pozostałych 22 szczurzyc nie stwierdzono wykładników histologicznych endometriozy.
Zrosty na otrzewnej uwidoczniono u 14 z grupy 23 szczurów (poza zrostami wokół wszczepu ektopowego endometrium dostrzeżonymi u 1 z nich, stwierdzono zrosty w linii cięcia u 11 zwierząt oraz zrosty wokół implantu łącznie ze zrostami w linii cięcia w 2 przypadkach). Zrosty wokół wszczepu były cienkie i przezroczyste, a w linii cięcia grube i tworzące konglomeraty tkankowe. Otrzewną bez zrostów stwierdzono u 9 z 23 szczurzyc.
Podczas ponownego otwarcia jamy brzusznej, po 3 mies. od wycięcia zmian z otrzewnej ściennej jamy brzusznej (w IV etapie pracy), nie stwierdzono żadnych zmian makroskopowych na otrzewnej.
Grupę II stanowiły 23 szczury, którym po usunięciu uprzednio wszczepionych implantów z otrzewnej ściennej jamy brzusznej podano preparat RESAN w celach leczniczych. Podczas laparotomii (III etapu badania), po 3 mies. od wszczepienia endometriozy (II etap doświadczenia), rozwój implantów w ocenie mikroskopowej uzyskano u 16 zwierząt. U pozostałych 7 szczurzyc nie stwierdzono wykładników morfologicznych endometriozy.
Zrosty wokół ektopowego endometrium dostrzeżono u 11 z 23, a w linii cięcia u 6 zwierząt. Zrosty wokół implantu łącznie ze zrostami w linii cięcia występowały w 3 przypadkach. Otrzewną bez widocznych zrostów, ale z ogniskami wzmożonego rysunku naczyniowego stwierdzono u 3 szczurzyc.
Podczas kolejnej laparotomii, w 3. mies. od wycięcia zmian z otrzewnej i podaniu pojedynczej dawki terapeutycznej RESAN (w 4. etapie pracy doświadczalnej) u 3 z 16 zwierząt, u których uprzednio na podstawie oceny mikroskopowej rozpoznano endometriozę, stwierdzono liczne i grube zrosty występujące w konglomeracie łącznotkankowym wokół wszczepu tkankowego. U 1 z 16 zwierząt uwidoczniono zrosty w linii cięcia. U pozostałych 12 szczurzyc żadnych zmian makroskopowych i mikroskopowych na otrzewnej oraz w jamie brzusznej nie stwierdzono. Histologiczna ocena pobranych wycinków pozwoliła wykluczyć obecność endometriozy.
W kontrolnej grupie III (n=10) u żadnego zwierzęcia nie stwierdzono zmian makroskopowych i mikroskopowych na otrzewnej ściennej, w miejscu założenia szwu nylonowego. Grupa ta nie była poddana ani immunoprofilaktyce, ani immunoterapii preparatem RESAN.
Procentowe zestawienie występowania zrostów tkankowych w I i II grupie, III i IV etapu doświadczenia, przedstawiono w tab. I.

Dyskusja

Wytworzone w badaniu eksperymentalnym zrosty otrzewnowe u szczurów różniły się wyglądem oraz miejscem ich wytworzenia. Cienkie i przezroczyste (ryc. 1.) występowały głównie tam, gdzie po wycięciu zmiany,
potwierdzano obecność endometriozy. Grube i w konglomeratach tkankowych (ryc. 2.) nie miały związku z endometriozą, niezależnie od tego, czy zastosowano immunoprofilaktykę czy immunoterapię. Można sądzić, iż powodem ich tworzenia był odczyn zapalny, który łączył się z założeniem ciągłego szwu wchłanialnego na ranę powłoki. W miejscu wszczepienia ogniska endometriozy widoczne były szwy nylonowe niewchłanialne, niepowodujące dodatkowych odczynów (w ocenie mikroskopowej).
W III etapie badania, po podaniu pojedynczej dawki preparatu RESAN (w grupie I), zrosty wokół wszczepu tkanki endometrialnej występowały tylko u 4,4% zwierząt. W grupie II uwidoczniono zrosty u 47,8% szczurów. Po usunięciu implantu wraz z otaczającymi go zrostami, podano wszystkim zwierzętom z grupy II RESAN w pojedynczej dawce terapeutycznej. Po 3 mies. i ponownym otwarciu, grube zrosty i w konglomeratach łącznotkankowych, w okolicy pierwotnej zmiany wytworzyły się tylko u 3 zwierząt. Proporcja występowania zrostów wokół wszczepu tkankowego wynosiła odpowiednio w I i II grupie: 0,0435 i 0,6957 i była to różnica istotna statystycznie (p=0,0009). W prospektywnym badaniu z randomizacją Luciano i wsp. [11] zaobserwowali ponowne formowanie się i powstawanie de novo zrostów u wszystkich królików, 3 tyg. po ich uprzednim wycięciu w trakcie laparotomii [11]. Natomiast w badaniach doświadczalnych nad rozwojem endometriozy u szczurów laboratoryjnych zaobserwowano pojawienie się zrostów po 3 i 6 tyg. od wszczepienia endometriozy, odpowiednio u 3 i 4 szczurzyc (z poddanej ocenie grupy 12 zwierząt). Zrosty wytworzone wokół miejsc wszczepienia ektopowego endometrium były cienkie i przezroczyste [12]. W innym badaniu eksperymentalnym, po 90 dniach od pierwszego otwarcia jamy brzusznej i ektopowej implantacji błony śluzowej macicy, obecność zrostów otrzewnowych stwierdzono u 17 z 28 szczurów szczepu Wistar [13–15].
Na podstawie powyższych obserwacji można przypuszczać, że prawdopodobnie zrosty te nie powstały
tylko w wyniku samej operacji. W grupie I tak mała ich liczba mogłaby być skutkiem podania pojedynczej dawki preparatu RESAN, który wpłynął na układ immunologiczny zwierząt. Natomiast w grupie II wytworzone liczne zrosty były reakcją odczynową na rodzaj i rozległość przeprowadzanego zabiegu. Zrosty wokół ognisk endometriozy mogą świadczyć również np. o istniejącej chorobie, której nie udało się potwierdzić badaniem histologicznym. Taka różnica w ilości zrostów wokół wszczepionego implantu, w grupie I i II, może być skutkiem czasu potrzebnego na przygotowanie odpowiedzi immunologicznej organizmu. Zgodnie z danymi producenta szczepionki, pełną odpowiedź immunologiczną uzyskuje się po 8 tyg. od podania preparatu [10]. Jeśli przeprowadzamy ten sam typ operacji u szczurów, a odsetek zrostów jest w grupie uprzednio szczepionych zwierząt istotnie niższy, można przypuszczać, że operacje wykonano w zupełnie odmiennych warunkach immunologicznych. Właściwości immunostymulujące szczepionki wynikają z tego, że po wprowadzeniu do organizmu, za pośrednictwem monocytów i makrofagów, pobudzona zostaje komórkowa odpowiedź immunologiczna. Można przypuszczać, że zastosowana w doświadczeniu autorów niniejszej pracy szczepionka RESAN wpłynęła na przywrócenie pierwotnej równowagi Th1/Th2, a zatem doprowadziła do pobudzenia odpowiedzi komórkowej. Szczepienie lecznicze nie mogło wpłynąć na ograniczenie odsetka zrostów, bowiem zrosty powstają w okresie pierwszych 24–48 godz. po operacji.
Pozostaje jednak kwestia braku zrostów w grupie III. Wydaje się, że wpłynęły na to dwa elementy. Jednym może być fakt, że obecność immunogennego ciała obcego w postaci fragmentu endometrium w grupie I i II spowodowało wydzielanie cytokin prozapalnych, ułatwiających tworzenie się zrostów. Drugim czynnikiem, prawdopodobnie odpowiedzialnym za brak zmian na otrzewnej, był obiektywnie krótszy czas operacji. W grupie III nie wykonywano procedury wszczepienia fragmentu endometrium. Należy zaznaczyć, że to właśnie przygotowanie endometrium do implantacji było najbardziej czasochłonne, a czas otwarcia jamy otrzewnowej jest niewątpliwie jednym z elementów wpływających na tworzenie zrostów. Wydaje się zatem, że profilaktyka zrostowa powinna polegać na zmniejszaniu urazu i ograniczaniu niedotlenienia tkanek podczas zabiegów, stosowaniu nici i innych materiałów chirurgicznych niepowodujących powstawania reakcji wokół ciała obcego oraz zmniejszaniu ryzyka zakażenia drobnoustrojami i rozwoju stanu zapalnego. Ważne jest również ograniczenie dostępu powietrza, co ma miejsce podczas zabiegów laparoskopowych. Jednak nie można wykluczyć, iż mniejsza liczba wytworzonych zrostów otrzewnowych w prezentowanym modelu doświadczalnym endometriozy wynikała także z przedoperacyjnego i pooperacyjnego zastosowania szczepionki RESAN.
Wiele pytań nasuwających się po podsumowaniu wyników powyższego badania eksperymentalnego na modelu zwierzęcym endometriozy pozostaje nadal bez odpowiedzi. Czy zastosowanie drugiej i trzeciej dawki nie wpłynęłoby na radykalną poprawę uzyskanych wyników leczenia? Jakie szczegóły kryją się w zmienionej odpowiedzi immunologicznej? Kiedy i u kogo można zastosować szczepionkę? Niezależnie od powyższych wątpliwości, uzyskane w pracy wyniki zachęcają do dalszych badań.

Wniosek

Przedoperacyjne i pooperacyjne zastosowanie szczepionki RESAN zmniejsza liczbę tworzących się zrostów w modelu eksperymentalnym endometriozy.

Piśmiennictwo

1. Pietrzycki B, Jóźwik M, Jóźwik M i wsp. Ocena skuteczności leczniczej preparatu Distreptaza w przewlekłym zespole bólowym miednicy mniejszej u kobiet. Gin Prakt 2004; 12: 17-22.
2. Parazzini F. Adhesions and pain in women with first diagnosis of endometriosis: results from a cross-sectional study. J Minimal Invasive Gynecol 2006; 13: 49-54.
3. Harada T, Iwabe T, Terakawa N. Role of cytokines in endometriosis. Fertil Steril 2001; 7: 6-10.
4. Tulandi T, Chen MF, Al-Took S, Watkin K. A study of nerve fibers and histopathology of postsurgical, postinfectious, and endometriosis-related adhesions. Obstet Gynecol 1998; 92: 766-8.
5. Kligman I, Drachenberg C, Papadimitriou J, Katz E. Immunohistochemical demonstration of nerve fibers in pelvic adhesions. Obstet Gynecol 1993; 82: 566-8.
6. Kumar J, Ng SC. Treatment of infertility associated with endometriosis. Curr Obstet Gynaecol 1998; 8: 197-203.
7. Pittaway DE, Daniell JF, Maxson WS. Ovarian surgery in an infertility patient as an indiction for a short-interval second look laparoscopy: A preliminary study. Fertil Steril 1985; 44: 611-4.
8. Trimbos-Kemper TCM, Trimbos JB, van Hall EV. Adhesion formation after tubal surgery: Results of the eighth-day laparoscopy in 188 patients. Fertil Steril 1985; 43: 395-400.
9. Parker J, Sinaii N, Segars J, et al. Adhesion formation after laparoscopic excision of endometriosis and lysis of adhesions. Fertil Steril 2005; 84: 1457-61.
10. www.anticancer.net/resan
11. Hammound A, Gago A, Diamond M. Adhesions in patients with chronic pelvic pain: a role for adhesiolysis? Fertil Steril 2004; 82: 1483-91.
12. Jędrzejczak P, Szymanowski K, Skrzypczak J i wsp. Eksperymentalny model endometriozy u szczurów. Gin Pol 1990; 61: 387-91.
13. Szymanowski K, Florek E, Mikołajczyk M, et al. Integrin pattern in rats endometrium after endometriosis induction. Pol J Gynaecol Invest 2002; 5: 293-8.
14. Szymanowski K, Mikołajczyk M, Rączyńska R, et al. Integrin pattern in rats endometrium after endometriosis excision. Pol J Gynaecol Invest 2002; 5299-302.
15. Szymanowski K. Ocena ekspresji wybranych integryn, metaloproteinaz, cytokin oraz nasilenia apoptozy w błonie śluzowej jamy macicy u kobiet z endometriozą małego stopnia. Seminaria z Medycyny Perinatalnej. Tom XI. Ośrodek Wydawnictw Naukowych. Poznań 2004; 7-80.