Wstęp
W leczeniu chorób nowotworowych niezwykle istotna jest wczesna diagnoza. Dostępne obecnie metody nie zawsze pozwalają wykryć nowotwór w początkowym stadium rozwoju, co znacznie zmniejsza skuteczność leczenia. Szczególnie trudny do rozpoznania jest rak jajnika z uwagi na brak specyficznych objawów. Według statystyk odsetek 5-letnich przeżyć dla raka jajnika wykrytego w zaawansowanym stadium wynosi jedynie 20%, podczas gdy dla nowotworu zdiagnozowanego we wczesnej fazie jest to 90%. Obecnie jedynie 25% przypadków udaje się rozpoznać w początkowym stadium rozwoju [1, 18]. Te niepokojące dane wskazują, że istnieje potrzeba jak najszybszego opracowania biomarkera, którego oznaczanie pozwoliłoby na wczesne wykrycie choroby oraz prowadzenie efektywnego leczenia.
Ocena ryzyka zachorowania na raka jajnika z wykorzystaniem markera białkowego CA125 – panele biomarkerów
Od ponad dwóch dekad, podstawę w diagnozowaniu raka jajnika stanowi białko CA125 (Cancer Antigen 125) [5]. Nie jest to jednak marker specyficzny. Glikoproteina ta wytwarzana jest przez dojrzałe, prawidłowe tkanki: opłucnej, osierdzia, otrzewnej, jelita grubego, trzustki, nerek, żołądka i pęcherza moczowego, a także w błonie śluzowej kanału i trzonu macicy. Zwiększone stężenie tego antygenu obserwowane jest również w: marskości wątroby, zapaleniu płuc, zapaleniu osierdzia oraz nowotworach: trzustki, płuca, jelit, żołądka oraz w chłoniakach [3, 4]. W przypadku raka jajnika zwiększone stężenie CA125 obserwuje się w 85% przypadków raka surowiczego, 65% przypadków raka endometrioidalnego, 40% raka jasnokomórkowego oraz 36% przypadków raków niezróżnicowanych, a także jedynie u 12% pacjentek z rakiem śluzowym [7]. Ponadto należy podkreślić, że w przypadku raka jajnika sklasyfikowanego jako I stopień (wg FIGO) stężenie CA125 jest zwiększone jedynie u połowy pacjentek [1].
Z powodu złożoności oraz zróżnicowania histologicznego raka jajnika uważa się, że niemożliwe jest, aby pojedynczy marker pozwalał wykryć wszystkie podtypy raka jajnika z wysoką czułością oraz specyficznością, dlatego też zasadne jest stosowanie tzw. paneli biomarkerów, czyli testów oznaczających kilka substancji jednocześnie, w celu uzyskania jak najwyższej czułości oraz specyficzności [16]. Przykładem skutecznego wykorzystania takich złożonych badań są dwa testy: algorytm ROMA oraz test OVA1.Algorytm ROMA
Algorytm ROMA (Risk of Ovarian Malignancy Algorithm) to najnowsze narzędzie, zatwierdzone we wrześniu 2011 r. przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration – FDA) do oceny ryzyka zachorowania na złośliwy nowotwór jajnika. Procedura ta polega na połączeniu kilku dotychczas stosowanych sposobów w jedną metodę oceny ryzyka. Badanie ROMA obejmuje trzy podstawowe składowe: statystyczne oszacowanie ryzyka zachorowania na złośliwy guz jajnika (uwzględniające status menopauzalny pacjentek) oraz dwa testy markerów nowotworowych: CA125 i HE4. Marker HE4 (human epididymis protein 4), znany również jako WFDC2 (WAP 4-disulfide core domain 2), jest niskocząsteczkową glikoproteiną, po raz pierwszy zidentyfikowaną w nabłonku dystalnej części najądrza jako inhibitor proteazy biorący udział w dojrzewaniu plemników. Badania Lu i wsp. dowiodły, że czynnik ten odgrywa ważną rolę w procesie powstawania raka jajnika. Nadekspresja HE4 wiąże się ze zwiększoną migracją oraz adhezją komórek raka jajnika. Ograniczenie ekspresji genu HE4 powoduje zahamowanie migracji komórek raka jajnika linii SKOV-3 (SKOV-3 human ovarian adenocarcinoma cell line), a także ogranicza proliferację oraz zdolność do inwazji komórek tej samej linii. Przypuszczalnie HE4 pobudza również ścieżkę sygnałową EGF-MAPK (epidermal growth factor/mitogen-activated protein kinases pathway), która jest kluczowa dla metastazy. W badaniach in vivo redukcja poziomu tego genu ogranicza rozwój nowotworu u myszy z zaszczepionymi ludzkimi komórkami nowotworowymi [8]. Jako marker nowotworowy HE4 w połączeniu z CA125 wykazuje czułość rzędu 76% oraz specyficzność na poziomie 95%. Średnia wartość HE4 w surowicy kobiet z rakiem jajnika oraz rakiem endometrium była znacznie wyższa, w porównaniu z wartością mierzoną u kobiet chorujących na endometriozę. Czułość połączonych markerów to 95% dla raka jajnika oraz 92,9% dla endometriozy jajnika. Stosowanie obu markerów jednocześnie pozwala na zwiększenie dokładności diagnozowania raka jajnika oraz pozwala na lepsze rozróżnianie raka jajnika od schorzeń takich jak torbiele endometrioidalne jajnika czy endometrioza [9]. Wynik algorytmu podawany jest w procentach – określają one prawdopodobieństwo, że u chorej rozwija się stan nowotworowy (ryc. 1.).Test OVA1
Test OVA1 został zatwierdzony przez FDA do oceny charakteru masy nowotworowej przed zabiegiem chirurgicznym. Nie jest to typowy test przesiewowy w kierunku raka jajnika. Nie może także zastąpić metod diagnostycznych. Pozwala jednak zwiększyć dokładność rozpoznania guza, a tym samym zwielokrotnić skuteczność leczenia. Badanie polega na oznaczaniu w osoczu stężenia pięciu białek związanych z procesem nowotworzenia. Są to: CA125, apolipoproteina A-1 (ApoA-1), transtyretyna (TTR), transferyna (TF), β2-mikroglobulina (B2MG). Stężenie Apo-A1, TF oraz TTR jest zmniejszone, natomiast CA125 zwiększa się u chorych z nowotworami złośliwymi w stosunku do tych ze zmianami łagodnymi. Za pomocą specjalnego algorytmu oblicza się wynik testu podawany w postaci liczbowej (0–10), który wskazuje, czy mamy do czynienia z guzem łagodnym czy złośliwym. Należy zwrócić uwagę, że wyniki wskazujące na wysokie ryzyko różnią się dla kobiet w okresie przedmenopauzalnym (≥ 5,0) oraz po menopauzie (≥ 4,4) [6, 10].Niebiałkowe markery
Należy podkreślić, że dużo uwagi poświęca się ostatnio także niebiałkowym markerom. Przykładem może być kwas lizofosfatydowy (lysophosphatidic acid – LPA). Jest on fosfolipidem, którego zwiększone stężenie odnotowano w płynie wodobrzusza oraz osoczu pacjentek z rakiem jajnika. Produkowany jest przez komórki nabłonkowe jajnika. Bierze udział w stymulowaniu proliferacji oraz inwazji komórek. W obecności LPA komórki raka jajnika wykazują niższą wrażliwość na apoptozę indukowaną chemioterapeutykami (np. cisplatynę). Prawdopodobnie LPA bierze również udział w powstawaniu przerzutów (zwiększa stężenie czynników angiogennych, takich jak interleukina 8 oraz VEGF). Na podstawie badań stwierdzono, że poziom receptorów LPA2 oraz LPA3 był znacznie wyższy u pacjentek z rakiem jajnika w porównaniu z pacjentkami z łagodnymi zmianami na jajnikach oraz z grupą kontrolną, w skład której wchodziły kobiety zdrowe. W warunkach fizjologicznych komórki nabłonkowe jajników nie wydzielają tego kwasu. Stężenie LPA zwiększało się wraz ze wzrostem stopnia zaawansowania nowotworu jajnika. Zwiększone stężenie kwasu lizofosfatydowego zaobserwowano u 90% pacjentek z rakiem jajnika w stadium I [11]. Niezwykle obiecujące wydaje się także wykorzystanie metabolomiki, która jest gałęzią biologii systemowej, zajmującą się badaniem wszystkich metabolitów znajdujących się w komórce. Metabolity uważane są za efekt oddziaływania genomu ze środowiskiem, a nie jedynie prostym odzwierciedleniem metabolizmu komórki. Do badań metabolitów stosuje się głównie spektroskopię 1H-NMR. Badanie prowadzone z udziałem 38 kobiet z rakiem jajnika, 12 z łagodnymi nowotworami jajnika oraz 51 kobiet należących do grupy kontrolnej wykazało, że markery oparte na metabolitach charakteryzują się czułością oraz specyficznością wykrywania nabłonkowego raka jajnika równą 100%, co zachęca do dalszych badań w kierunku zastosowania metabolomiki we wczesnym wykrywaniu nowotworów [1].Biomarkery oparte na analizie mutacji genów
Większość nowotworów jajnika powstaje w wyniku nagromadzenia zmian w materiale genetycznym, jednakże szczegółowo proces ten nie został jak dotąd poznany. Mutacje genów supresorowych, takich jak p53, pRB (retinoblastoma protein), BRCA (breast cancer type 1/2 susceptibility protein), oraz onkogenów – K-ras, c-myc, c-erbB2 wydają się odgrywać znaczącą rolę w powstawaniu raka jajnika. Najczęstsze zmiany w materiale genetycznym obserwowane u pacjentek z rakiem jajnika to amplifikacja regionów 8q, 1q, 20q, 19q, oraz delecje fragmentów 13q (usunięcie tego fragmentu wiąże się z inaktywacją genu RB – retinoblastoma gene – supresora nowotworowego będącego negatywnym regulatorem wzrostu komórki), 4q, 18q [3, 12]). Zmiany w DNA lub RNA badane są za pomocą łatwo dostępnych dziś technik, takich jak: reakcja łańcuchowa polimerazy (polymerase chain reaction – PCR), RT-PCR (reverse transcription PCR), sekwencjonowanie DNA oraz technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (fluorescent in situ hybridisation – FISH). Markerami nowotworowymi mogą być zarówno mutacje w materiale genetycznym, jak i zmiany o charakterze epigenetycznym oraz nieprawidłowości w ekspresji genów [1].
Dziedziczne zmiany genetyczne
Szacuje się, że ok. 10% wszystkich przypadków nabłonkowego raka jajnika spowodowane jest nosicielstwem zmutowanych genów, głównie BRCA1 oraz BRCA2, a także genów kodujących systemy naprawcze DNA – MMR (mismatch repair), głównie genów hMLH1 oraz hMSH2 [1, 2, 4]. Białka BRCA1 oraz BRCA2 odpowiedzialne są za regulację ekspresji genów oraz rozpoznawanie uszkodzeń DNA, w szczególności dwuniciowych pęknięć [17]. Mutacje obserwowane w raku jajnika to głównie zmiana ramki odczytu oraz mutacje nonsensowne. Ryzyko wystąpienia raka jajnika u nosicielek mutacji genu BRCA1 wynosi 35–46% (do 70. roku życia). Wśród nosicielek mutacji BRCA2 ryzyko to jest mniejsze – wynosi 13–23% [2]. Geny hMLH1 oraz hMSH2 są odpowiedzialne za naprawę błędnie sparowanych nukleotydów podczas replikacji DNA. Wykrycie mutacji ww. genów może pomóc w zaklasyfikowaniu pacjentek do grupy wysokiego ryzyka [1].
Zmiany epigenetyczne
Metylacja DNA w obszarach promotorowych genów będąca głównym mechanizmem epigenetycznym oraz modyfikacja histonów odgrywają zasadniczą rolę w etapie inicjacji oraz progresji nowotworu. Obecnie trwają intensywne badania polegające na identyfikacji specyficznych genów, które ulegają zmianom pod wpływem czynników epigenetycznych. Wyniki badań potwierdzają, że może być to dobry marker. W badaniu materiału genetycznego pochodzącego od 50 pacjentek we wszystkich próbach wykryto hipermetylację promotorów 6 genów kodujących supresory nowotworowe – RAS (rat sarcoma), BRCA (breast cancer susceptibility protein), APC (adenomatous polyposis coli), p14ARF, p16INK4a oraz DAPKinase (death associated protein-kinase). Identyczny wzór hipermetylacji obecny był w DNA 41 spośród 50 próbek (w tym w 13 z 17 przypadków raka w I stadium). Hipermetylacja nie była obserwowana u żadnej z 40 pacjentek stanowiących grupę kontrolną. Niewątpliwą zaletą jest fakt, że badanie jest nieinwazyjne – materiałem pobieranym do testu jest krew [13].
Nieprawidłowości w ekspresji genów
We wczesnym wykryciu raka jajnika może pomóc także analiza zmian w ekspresji poszczególnych genów. Rozróżnianie tkanek zdrowych i tkanek nowotworowych na podstawie różnic w ekspresji genów, identyfikacja histologicznych podtypów nowotworu jajnika oraz przewidywanie odpowiedzi na terapię (w tym próba oceny wrażliwości na chemioterapię I rzutu z zastosowaniem platyny) możliwe są dzięki rozwojowi wysokoprzepustowych technologii pozwalających na analizę ekspresji tysięcy genów podczas jednego eksperymentu. Techniką używaną do tego typu badań jest seryjna analiza ekspresji genów (serial analysis of gene expression – SAGE). Geny, których poziom ekspresji oceniano u pacjentek z rakiem jajnika, to m.in.: gen klaudyny 3 (claudin 3 – CLDN 3), podfrakcja 4 ludzkiego białka z komórek nabłonkowych najądrza (human epidymal protein 4 – HE4), receptor folianów 1 (folate receptor 1 – FOLR1) oraz cyklina D1 (cyclin D1 – CCND1) [14].Biomarkery microRNA
MicroRNA to niekodujące cząsteczki RNA składające się z ok. 22 nukleotydów. Główną ich rolą jest regulacja ekspresji genów na poziomie translacji, co nazywane jest wyciszaniem mRNA. Uważa się, że ok. 30% ludzkich genów kodujących białka podlega regulacji zależnej od microRNA. Zmieniona ekspresja microRNA w komórkach nowotworowych (w tym w komórkach raka jajnika) daje możliwość zastosowania microRNA jako markerów nowotworowych, stosowanych w celach zarówno diagnostycznych, jak i pozwalających na klasyfikację nowotworu. W ciągu ostatnich 5 lat wykryto 29 cząsteczek microRNa, których ekspresja różni się w komórkach zdrowych i komórkach nowotworowych. Wśród nich znalazły się cząsteczki ulegające nadekspresji: miR-200a, miR-200b, miR-200c oraz miR-141, oraz cząsteczki o obniżonej ekspresji: miR-199a, miR-140, miR-145 oraz miR-125b1. Prawdopodobnie pomiar ekspresji miRNA w komórkach raka jajnika może również znaleźć zastosowanie w klasyfikowaniu nowotworów do odpowiednich typów histologicznych oraz do klasy nowotworów o wysokim bądź niskim stopniu złośliwości, a także odróżnianiu zmian łagodnych od złośliwych. Niewątpliwą zaletą miRNA jako markera nowotworowego byłaby możliwość oznaczania go bezpośrednio z osocza. Zwiększenie poziomu ekspresji miR-21, miR-92 oraz miR-93 u pacjentek chorujących na raka jajnika, u których stężenie CA125 mieści się w normie, sugeruje, że oznaczanie miRNA mogłoby być stosowane jako uzupełnienie w celu zwiększenia efektów pomiaru stężenia CA125 w surowicy pacjentek [15].Podsumowanie
Wysokoprzepustowe technologie stosowane dziś na coraz większą skalę w analizie i detekcji genów, analizie proteomicznej profili białkowych oraz metabolomice pozwalają na wykrycie potencjalnych markerów nowotworowych, które w przyszłości będą mogły zrewolucjonizować walkę z rakiem jajnika, poprzez jego wczesną detekcję. Pomimo obiecujących rezultatów, potrzeba jeszcze wielu szczegółowych badań, aby móc na szeroką skalę stosować markery bądź kombinacje markerów, które byłyby wystarczająco czułe i specyficzne, aby spełnić podstawowe kryterium wg norm Światowej Organizacji Zdrowia – obniżenie śmiertelności spowodowanej przez nowotwór jajnika w ogólnej populacji.Piśmiennictwo
1. Zhang B, Cai FF, Zhong XY. An overview of biomarkers for the ovarian
cancer diagnosis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2011; 158: 119-23.
2. Gentry-Maharaj A, Menon U. Screening for ovarian cancer in the general
population. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2012; 26: 243-56.
3. Husseinzadeh N. Status of tumor markers in epithelial ovarian cancer
has there been any progress? A review. Gynecol Oncol 2011; 120: 152-7.
4. Rak jajnika – patologia, diagnostyka i przegląd nowoczesnych metod
leczenia. Wcisło G, Szczylik C (red.). Termedia, Poznań 2011.
5. Rogulski L, Olejek A. Zastosowanie biomarkerów w diagnostyce i lecze-
niu raka jajnika. Przegl Menopauz 2008; 12: 301-7.
6. Abraham J. OVA1 test for preoperative assessment of ovarian cancer.
Community Oncology 2010; 7: 249-50.
7. Hogdall EV, Christensen L, Kjaer SK, et al. CA125 expression pattern,
prognosis and correlation with serum CA125 in ovarian tumor patients.
From The Danish “MALOVA” Ovarian Cancer Study. Gynecol Oncol 2007;
104: 508-15.
8. Lu R, Sun X, Xiao R, et al. Human epididymis protein 4 (HE4) plays a key
role in ovarian cancer cell adhesion and motility. Biochem Biophys Res
Commun 2012; 419: 274-80.
9. Huhtinen K, Suvitie P, Hiissa J, et al. Serum HE4 concentration differenti-
ates malignant ovarian tumours from ovarian endometriotic cysts. Br
J Cancer 2009; 100: 1315-9.
10. Macuks R, Baidekalna I, Donina S. An ovarian cancer malignancy risk
index composed of HE4, CA125, ultrasonographic score, and menopau-
sal status: use in differentiation of ovarian cancers and benign lesions.
Tumour Biol 2012; 33: 1811-7.
11. Sedlakova I, Vavrova J, Tosner J, et al. Lysophosphatidic acid (LPA)-a per-
spective marker in ovarian cancer. Eur J Gynaecol Oncol 2011; 32: 311-6.
12. Hu J, Khanna V, Jones MW, et al. Comparative study of primary and
recurrent ovarian serous carcinomas: comparative genomic hybridiza-
tion analysis with a potential application for prognosis. Gynecol Oncol
2003; 89: 369-75.
408
13. Ibanez de Caceres I, Battagli C, Esteller M, et al. Tumor cell-specific
BRCA1 and RASSF1A hypermethylation in serum, plasma, and perito-
neal fluid from ovarian cancer patients. Cancer Res 2004; 64: 6476-81.
14. Peters DG, Kudla DM, Deloia JA, et al. Comparative gene expression
analysis of ovarian carcinoma and normal ovarian epithelium by serial
analysis of gene expression. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005;
14: 1717-23.
15. Iorio MV, Visone R, Di Leva G, et al. MicroRNA signatures in human ovar-
ian cancer. Cancer Res 2007; 67: 8699-707.
16. Moulla A, Miliaras D, Sioga A, et al. The immunohistochemical expres-
sion of CD24 and CD171 adhesion molecules in borderline ovarian tu-
mors. Pol J Pathol 2013; 64: 180-4.
17. Michalak M, Filip A, Karczmarek-Borowska B. Biological and clinical sig-
nificance of BRCA2. Wspolczesna Onkol 2011; 15: 309-16.
18. Mielczarek-Palacz A, Kondera-Anasz Z, Sikora J. Higher serum levels of
tumour necrosis factor and its soluble receptors are associated with
ovarian tumours. Arch Med Sci 2012; 8: 848-53.
