The ERCC4/XPF gene polymorphism in postmenopausal women with breast cancer

Wstęp
Najczęstszymi nowotworami u kobiet są nowotwory złośliwe piersi. W Polsce notuje się prawie 10 tys. nowych przypadków zachorowań rocznie. Oznacza to, że każdego roku na raka piersi zachoruje 30 kobiet na 100 tys. Umieralność na raka piersi rośnie w tempie 1,6% rocznie, ponieważ wykrywany jest zbyt późno. Tylko w 20% przypadków chorobę rozpoznaje się we wczes-nym stadium zaawansowania, gdy szanse na wyleczenie są bardzo duże. Wśród wszystkich nieleczonych kobiet z rakiem gruczołu piersiowego 10 lat przeżywa 5%. Dla leczonej pacjentki szansa przeżycia następnych 5 lub 10 lat bez postępu lub wznowienia procesu chorobowego jest uzależniona od stopnia zaawansowania schorzenia przy rozpoczęciu leczenia. Średni wskaźnik 10-letnich przeżyć dla wszystkich stopni zaawansowania wynosi ok. 40%. Nie jest znana bezpośrednia przyczyna powstawania nowotworów złośliwych piersi, można tylko określić z pewnym prawdopodobieństwem, jaki wpływ na powstanie raka piersi mają określone czynniki. Wiadomo, że w etiologii raka piersi dużą rolę odgrywają czynniki środowiskowe [1, 2]. DNA komórek jest nieustannie uszkadzany przez mutageny endogenne i egzogenne. Większość uszkodzeń DNA podlega naprawie, natomiast uszkodzenia nienaprawione ulegają akumulacji i mogą doprowadzić do rozregulowania mechanizmów wzrostu komórki i powstania nowotworu [3–5]. Geny systemu naprawy uszkodzeń DNA odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu integracji genomu. Bez nich komórki gromadziłyby błędy, które w krótkim czasie uniemożliwiłyby przeżycie komórki. Geny te są wysoce polimorficzne, a ich polimorfizmy, poprzez uszkodzenie funkcji białek kodowanych przez te geny, zmniejszają zdolność naprawy DNA i wpływają na wzrost ryzyka pojawienia się procesów kancerogennych [6–12]. Dane literaturowe wskazują, że zaburzenia w naprawie DNA są związane z ryzykiem powstania raka piersi, które może korelować z wariantami polimorficznymi genów naprawy [6, 8, 10, 11]. Znanych jest obecnie pięć głównych dróg naprawy w zależności od typu uszkodzenia DNA: • naprawa bezpośrednia, • naprawa poprzez wycinanie zasad azotowych (ang. base excision repair – BER), • naprawa poprzez wycinanie nukleotydów (ang. nucleotide excision repair – NER), • naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (ang. mismatch excision repair – MMR) oraz • naprawa rekombinacyjna – homologiczna i niehomologiczna (ang. homology repair – HRR) [13–15]. Ponieważ ww. mechanizmy, a zwłaszcza BER, NER i HRR, odgrywają bardzo istotną rolę w naprawie różnych typów uszkodzeń DNA, kumulacja błędów genetycznych w obrębie genów tych trzech dróg naprawy może przyczyniać się do zwiększonego ryzyka wystąpienia nowotworów. Skumulowane warianty polimorficzne genów XRCC1, XRCC3 i ERCC4/XPF, charakteryzujące się podstawieniem błędnych aminokwasów, mogą być związane ze zwiększonym ryzykiem powstania raka piersi [16–18]. Są to zwłaszcza polimorfizmy R399Q genu XRCC1 oraz Arg415Gln genu ERCC4/XPF [10, 11, 19–21]. Dotychczasowe wyniki są jednak niejasne i problem wymaga dalszych badań. Wśród licznych genów uczestniczących w naprawie podwójnych pęknięć DNA, tylko dwa zawierają zbadane polimorfizmy związane z ryzykiem powstania raka piersi. Są to BRCA2 i XRCC3 [22]. Ze względu na duże znaczenie problemu wczesnego wykrywania i leczenia chorób nowotworowych, istotne wydaje się zbadanie związków pomiędzy polimorfizmami a występowaniem i rozwojem nowotworów. W przedstawionej pracy przeprowadzono analizę oceny związków pomiędzy polimorfizmem genu ERCC4/XPF biorącego udział w naprawie uszkodzeń DNA a ryzykiem pojawienia się raka piersi. Wcześniejsze badania autorów niniejszej pracy dotyczące genów naprawy DNA przez rekombinację (wyniki wcześniej opublikowane) [23, 24] wydawały się autorom tej publikacji niewystarczające do poznania skomplikowanego procesu powstawania raka piersi.
Materiał i metody

Chorzy
Krew żylna została uzyskana od 100 kobiet chorych na raka piersi, w wieku 39.–69. roku życia (średnia wieku 54 lata), u których stwierdzono obecność przerzutów (n=51) lub ich brak (n=49) do węzłów chłonnych pachowych. U żadnej z pacjentek nie stwierdzono przerzutów odległych. Średni rozmiar guzów wynosił 21 mm. Stopień zaawansowania nowotworów był oceniany wg skali Scarf-Bloom-Richardsona. Przebadano 23 nowotwory I stopnia, 60 II stopnia oraz 17 III stopnia. Grupę kontrolną stanowiło 106 próbek krwi żylnej pobranej od dobranych wiekowo kobiet, u których nie stwierdzono choroby nowotworowej.
Izolacja DNA
DNA był izolowany z krwi żylnej z zastosowaniem komercyjnie dostępnego zestawu QIAamp DNA Blood Mini Kits (Qiagen GmbH, Hilden, Germany), zgodnie z zaleceniami producenta. Analiza polimorfizmu genu ERCC4/XPF metodą PCR-RFLP W celu analizy polimorfizmu Arg415Gln zastosowano startery o następujących sekwencjach: • 5’-GCACAGGGAAACTAGGAGGA-3’, • 5’-TCGACATCTCCTTCCTCTTC-3’. Reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction – PCR) była przeprowadzana w termocyklerze Perkin-Elmer/Gene Amp., PCR System 2400 thermal cycler. Mieszanina reakcyjna (25 µl) obejmowała 5 ng genomowego DNA, 0,2 µmol każdego ze starterów (ARK Scientific GmbH, Biosystems, Darmstadt, Germany), 2,5mM MgCl2, 1 mM dNTP i 1 U polimerazy Taq (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Warunki reakcji PCR wyglądały następująco: trawienie w temperaturze 94°C przez 60 s, w temperaturze 54°C przez 30 s i w temperaturze 72°C przez 40 s, i obejmowały 35 cykli. Po trawieniu enzymem restrykcyjnym XmnI, amplifikowane fragmenty DNA rozdzielane były w 7-procentowym żelu poliakrylamidowym i po barwieniu bromkiem etydyny obserwowane w świetle ultrafioletowym. Produkty Arg/Arg, Arg/Gln, i Gln/Gln odpowiadały odpowiednio pasmom długości 96/284 pz, 96/284/380 pz i 380 pz. Analiza statystyczna Rejestrowana liczba każdego genotypu była porównywana z liczbą oczekiwaną na podstawie prawa Hardy’ego i Weinberga z użyciem testu χ². Istotność różnic między częstościami występowania alleli i genotypów dla poszczególnych grup była oceniana testem c2; p<0,05 było określane jako wynik statystycznie znaczący.
Wyniki
Polimorfizm genu ERCC4/XPF analizowano u 100 chorych na raka piersi oraz u 106 osób, u których nie stwierdzono choroby nowotworowej. Populacja chorych na nowotwór oraz grupa kontrolna były jednorodne pod względem płci (kobiety) oraz dobrane wiekowo. W grupie chorych nie zaobserwowano związków pomiędzy polimorfizmem Arg415Gln genu ERCC4/XPF a występowaniem raka piersi. Częstości alleli Arg i Gln oraz w grupie badanej nie różniły się istotnie (p>0,05) od częstości alleli w grupie kontrolnej (tab. I). Wszystkie rozkłady były zgodne z rozkładem Hardy’ego i Weinberga (p>0,05). Badaniom została poddana także grupa pacjentek o różnym stopniu zaawansowania raka piersi, w celu określenia znaczenia polimorfizmów dla rozwoju nowotworu. Nie wykazano statystycznie istotnych różnic w rozkładach genotypów i częstości alleli (p>0,05) pomiędzy badanymi grupami.
Dyskusja
Prawidłowa naprawa DNA zapewnia utrzymanie integralności genomu i pełni kluczową funkcję w jego ochronie przed działaniem czynników kancerogennych. Wysoka częstość zmian DNA mogłaby mieć śmiertelne konsekwencje dla organizmu, gdyby nie była kontrolowana przez systemy naprawy DNA. Genami, które sterują naprawą DNA zmienionego w wyniku mutacji (geny kodujące enzymy kontrolujące wierność replikacji i naprawy DNA), są geny naprawcze (mutatorowe). Zaburzenia funkcjonowania naprawy poreplikacyjnej błędnie sparowanych zasad prowadzą do niestabilności genomowej, sprzyjającej indukcji i rozwojowi procesu kancerogenezy. Zmiany syntezy białek naprawy DNA są zazwyczaj poprzedzane zmianami w transkrypcji ich genów i mRNA, dlatego też wkład w syntezę tych białek może mieć zmienność sekwencji genów. Geny naprawy DNA są polimorficzne i wobec ich znaczącej roli w progresji nowotworów istotne wydaje się poznanie roli polimorfizmów w rozwoju raka [25, 26]. Białko XRCC1 odgrywa znaczącą rolę w mechanizmie naprawy poprzez wycinanie zasad [16]. Przebadano trzy polimorfizmy genu XRCC1 (R194W, R399Q R280H), z których tylko wystąpienie polimorfizmu R194W może być związane ze wzrostem ryzyka wystąpienia raka piersi w populacji kaukaskiej i Afroamerykanów [10, 21]. Obecność allela W redukuje ryzyko powstania nowotworu. Polimorfizm R399Q podlega nieustannym badaniom. Jednakże uzyskuje się rozbieżne wyniki dla różnych nowotworów. Związek polimorfizmu R399Q z obniżonym ryzykiem nowotworzenia stwierdza się w przypadku raka skóry [27], przełyku [28], pęcherza moczowego [29], korelację ze zwiększonym ryzykiem dla raka żołądka [30] czy piersi [10]. Produkty genów ERCC4/XPF i ERCC1 związane z naprawą DNA poprzez wycinanie nukleotydów tworzą kompleks, który rozpoznaje uszkodzenia i nacina DNA od końca 5. Badania polimorfizmu Arg415Gln genu ERCC4/XPF przeprowadzono do tej pory na niewielkiej populacji chorych na raka piersi [23]. Zaobserwowano obecność genotypu Gln/Gln tylko u 3% badanych chorych, w przeciwieństwie do grupy kontrolnej. Jednakże nie wyjaśniono, czy polimorfizm Arg415Gln może odgrywać istotną rolę w rozwoju raka piersi [23]. W prezentowanej pracy skoncentrowano się na analizie polimorfizmu genu ERCC4/XPF u chorych na raka piersi oraz u osób, u których nie stwierdzono choroby nowotworowej. Populacja chorych na nowotwór oraz grupa kontrolna były jednorodne pod względem płci oraz dobrane wiekowo. Nie wykazano związku pomiędzy polimorfizmem a występowaniem raka piersi. Nie stwierdzono znaczących różnic w rozkładzie genotypów pomiędzy pacjentkami o różnym stopniu zaawansowania nowotworu. Sugeruje to brak związku pomiędzy polimorfizmem powyższego genu a rozwojem raka piersi. Defekty białek zaangażowanych bezpośrednio w naprawę DNA mają wpływ na zwiększoną podatność na nowotwory. W wielu typach komórek nowotworowych stwierdza się tego typu defekty, z czym wiąże się zmniejszona zdolność do naprawy uszkodzeń DNA. Wyniki sugerują, że polimorfizm genu Arg415Gln ERCC4/XPF może nie być bezpośrednio związany z występowaniem i rozwojem raka piersi, jednakże konieczne są badania większej populacji dla potwierdzenia tego przypuszczenia.
Piśmiennictwo
1. McGuire W, Clark GM. Prognostic factors and treatment decisions in axillary node-negative breast cancer. N Engl J Med 1992; 326: 1756-61. 2. Ravaioli A, Bagli L, Zucchini A, Monti F. Prognosis and prediction of response in breast cancer. The current role of the main biological markers. Cell Prolif 1998; 31: 113-26. 3. Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet 2001; 27: 247-54. 4. Aquilina G, Bignami M. Mismatch repair in correction of replication errors and processing of DNA damage. J Cell Physiol 2001; 187: 145-54. 5. Lengauer C, Kinzler K, Vogelstain B. Genetic instabilities in human cancers. Nature 1998; 396: 643-9. 6. Shi Q, Wang LE, Bondy M, et al. Reduced DNA repair of benzo [a] pyrene diol epoxide-induced adducts and common XPD polymorphisms in breast cancer patients. Carcinogenesis 2004; 25: 1695-700. 7. Shen M, Hung RJ, Brennan P, et al. Polymorphisms of DNA repair genes XRCC1, XRCC3, XPD, interaction with environmental exposures, and bladder cancer risk in a case-control study in Northern Italy. Cancer Epidemiol Biomark Prev 2003; 12: 1234-40. 8. Webb PM, Hopper JL, Newman B, et al. Double-strand break repair gene polymorphisms and risk of breast or ovarian cancer. Cancer Epidemiol Biomark Prev 2005; 14: 319-323. 9. Goode EL, Ulrich CM, Potter JD. Polymorphisms in DNA Repair Genes and Associations with Cancer Risk. Cancer Epidemiol Biomark Prev 2002; 11: 1513-30. 10. Duell EJ, Milikan RC, Pitman GS, et al. Polymorphisms in the DNA repair gene XRCC1 and breast cancer. Cancer Epidemiol Biomark Prev 2001; 10: 217-22. 11. Smith TR, Levine EA, Perrier ND, et al. DNA-repair genetic polymorphism and breast cancer risk. Cancer Epidemiol Biomark Prev 2003; 12: 1200-4. 12. Fu YP, Yu JC, Cheng TC, et al. Breast cancer risk associated with genotypic polymorphism of the nonhomologous endjoining genes. Cancer Res 2003; 63: 2440-6. 13. Vispe S, Yung TM, Ritchot J, et al. A cellular defense pathway regulating transcription through poly (ADP-ribosyl) ation in response to DNA damage. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 9886-91. 14. Roberts RJ, Cheng X. Base flipping. Ann Rev Biochem 1998; 67: 181-98. 15. Sobol RW, Horton JK, Kuhn R, et al. Requirement of mammalian DNA polymerase-b in base excision repair. Nature 1996; 379: 183-6. 16. Thompson LH, West MG. XRCC1 keeps DNA from getting stranded. Mutat Res 2000; 459: 1-18. 17. Bishop DK, Ear U, Bhattacharyya A, et al. Xrcc3 is required for assembly of Rad51 complexes in vivo. J Biol Chem 1998; 273: 21482-8. 18. Bessho T, Sancar A, Thompson LH, Thelen MP. Reconstitution of human excision nuclease with recombinant XPF-ERCC1 complex. J Biol Chem 1997; 272: 3833-7. 19. Zhai X, Liu J, Hu Z, et al. Polymorphisms of ADPRT Val762Ala and XRCC1 Arg399Glu and risk of breast cancer in Chinese women: a case control analysis. Oncol Rep 2006; 15: 247-52. 20. Metsola K, Kataja V, Sillanpää P, et al. XRCC1 and XPD genetic polymorphisms, smoking and breast cancer risk in a Finnish case-control study. Breast Cancer Res 2005; 7: R987-97. 21. Chacko P, Rajan B, Joseph T, et al. Polymorphisms in DNA repair gene XRCC1 and increased genetic susceptibility to breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2005; 89: 15-21. 22. Kuschel B, Auranen A, McBride S, et al. Variants in DNA double-strand break repair genes and breast cancer susceptibility. Hum Mol Genet 2002; 11: 1399-407. 23. Romanowicz-Makowska H, Smolarz B, Kulig A. The G/C polymorphism of RAD51 gene in breast cancer. Pol Merkuriusz Lek 2006; 21: 55-8. 24. Romanowicz-Makowska H, Smolarz B, Zadrozny M, Kulig A. Analysis of RAD51 polymorphism and BRCA1 mutations in Polish women with breast cancer. Exp Oncol 2006; 28: 156-9. 25. Spencer CC. Human polymorphism around recombination hotspots. Biochem Soc Trans 2006; 34: 535-6. 26. Chang-Claude J, Popanda O, Tan XL, et al. Association between polymorphisms in the DNA repair genes, XRCC1, APE1, and XPD and acute side effects of radiotherapy in breast cancer patients. Clin Cancer Res 2005; 11: 4802-9. 27. Nelson H, Kelsey K, Mott L, Karagas MR. The XRCC1 Arg399Gln polymorphism, sunburn, and non-melanoma skin cancer: evidence of gene-environment interaction. Cancer Res 2002; 62: 152-5. 28. Lee JM, Lee YC, Yang SY, et al. Genetic polymorphism of XRCC1 and risk of the esophageal cancer. Int J Cancer 2001; 95: 240-6. 29. Stern MC, Umbach DM, et al. DNA repair gene XRCC1 polymorphism, smoking and bladder cancer risk. Cancer Epidemiol Biomark Prev 2001; 10: 125-31. 30. Shen H, Xu Y, Qian Y, et al. Polymorphism of the DNA repair gene XRCC1 and risk of gastric cancer in a Chinese population. Int J Cancer 2000; 88: 601-6.