Th1 and Th2 types cytokine production by the activated peripheral blood mononuclear cells (PBMC_s) from atopic dermatitis patients – relationship to the clinical parameters and Staphylococcus aureus skin colonization

Wprowadzenie
Atopowe zapalenie skóry (AZS) jest przewlekłą i nawrotową dermatozą zapalną, której towarzyszy wybitny świąd i charakterystyczny obraz zmian skórnych. W badaniach nad tym schorzeniem wskazywano na kluczową rolę limfocytów T CD4⁺ w nasileniu alergicznego stanu zapalnego skóry, a szczególnie na brak równowagi pomiędzy subpopulacjami limfocytów Th 1 i Th 2 [1, 2]. Charakterystyczna dla AZS jest przewaga funkcjonalna subpopulacji limfocytów Th2 CD4⁺ w ostrym okresie choroby. Zwiększona jest nie tylko produkcja cytokin promujących rozwój zapalenia alergicznego i nasilających wytwarzanie IgE, ale także ekspresja receptorów dla IL-4 i IL-5 na komórkach w ognisku chorobowym [3]. Zmiany profilu produkowanych cytokin w AZS zostały wykazane zarówno w odniesieniu do komórek krwi obwodowej [4–6], jak i lokalnie naciekających skórę [7].
W ostatnim czasie ukazały się prace podkreślające także znaczącą rolę cytokin Th2 w zwiększaniu podatności skóry chorych na AZS na czynniki infekcyjne [7, 8]. Najwięcej uwagi poświęcono kolonizacji zmian skórnych przez szczepy z gatunku Staphylococcus aureus i jej znaczeniu w patogenezie choroby [9]. U chorych na AZS gronkowce występują w 75–100% w obrębie zmian skórnych [10], a w 30–50% w obrębie skóry niezmienionej [11]. Szczepy z gatunku S. aureus podtrzymują alergiczny stan zapalny skóry w AZS, wydzielając egzotoksyny o aktywności superantygenów [12]. Superantygeny, w tym gronkowcowa enterotoksyna typu B (SEB), aktywują limfocyty T do produkcji licznych cytokin, w tym czynnika martwicy nowotworów (TNF), interleukiny 2 (IL-2),
IL-4, IL-5, IL-6 oraz interferonu-gamma (IFN-γ), które mogą nasilać stan zapalny skóry atopowej [13, 14]. Lin i wsp. [15], stosując barwienie cytoplazmatyczne wykazali, że limfocyty T CD4⁺ pacjentów chorych na AZS w hodowlach aktywowanych SEB, w przeciwieństwie do zdrowych dawców, produkowały znamiennie więcej
IL-4 niż IFN-γ. Campbell i wsp. [16] wykazali, że znamiennie obniżony odsetek limfocytów T CD2+ produkujących IFN-γ, jak i zredukowana wewnątrzkomórkowa synteza tej cytokiny po stymulacji SEB i zabitym szczepem gronkowca, korelowała ze stopniem nasilenia objawów klinicznych u dzieci chorych na AZS. Badania te potwierdziły wcześniejsze obserwacje Byrona i wsp. [17], którzy donieśli, że jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC_s) chorych w ostrej fazie klinicznego zaawansowania uwalniają w modelu in vitro mniej IFN-γ po aktywacji nieswoistym stymulatorem – fitohemaglutyniną (PHA), w porównaniu do stężeń tej cytokiny w grupie osób bez cech atopii.
W ostatnich badaniach Nomura i wsp. [7] oraz Ong i wsp. [8] wykazali, że konsekwencją obniżonej produkcji IFN-γ i TNF-α w skórze jest zwiększona podatność skóry chorych na AZS na infekcje S. aureus przy równoczesnym wzroście produkcji IL-4 i IL-13. W badaniach własnych [18] potwierdzono wcześniejsze obserwacje [19, 20], że gęstość kolonizacji skóry zmienionej przez S. aureus znamiennie koreluje z nasileniem objawów klinicznych wyrażonych wartością SCORAD.
Cel pracy
W tym kontekście interesująca wydawała się ocena produkcji cytokin Th1 i Th2 przez PBMC_s u chorych na AZS różniących się między sobą gęstością kolonizacji przez S. aureus w obrębie skóry zmienionej i niezmienionej oraz stanem klinicznym, jak również ocena tych parametrów u osób bez cech atopii. Przeprowadzono także analizę korelacji pomiędzy liczbą bakterii w obrębie zmian skórnych a parametrami zaawansowania klinicznego AZS (SCORAD index, IgE, ECP).
Materiał i metody
Pacjenci i grupa kontrolna
Badania przeprowadzono w grupie 37 chorych na atopowe zapalenie skóry (AZS) (20 kobiet i 17 mężczyzn) w wieku 6–62 lat (średnia 20,3±1,9) leczonych na Oddziale Dermatologii i Poradni Dermatologiczno-Alergologicznej Szpitala Specjalistycznego im. S. Żeromskiego w Krakowie. Charakterystykę kliniczną pacjentów przedstawiono w tab. 1. Rozpoznanie atopowego zapalenia skóry ustalano na podstawie kryteriów Hanifina i Rajki [21]. Do badań włączano chorych z wieloletnim przebiegiem AZS w okresie zaostrzenia choroby. U wszystkich chorych oceniano stan kliniczny metodą SCORAD [22]. Miejscowe objawy skórne oceniano na podstawie obecności rumienia, obrzęku, przeczosów, lichenizacji oraz suchości skóry w skali 0–3 w odniesieniu do każdego z objawów. Świąd i zaburzenia snu określano na podstawie skali subiektywnej oceny pacjenta 0–10 [23]. Chorzy w ciągu 2 tyg. poprzedzających badanie nie byli leczeni miejscowymi, doustnymi ani parenteralnymi preparatami kortykosteroidowymi, antybiotykami, ani poddawani immunoterapii. U 27% pacjentów całkowite stężenie IgE w surowicy było niższe niż 100 kU/l (śr.=30,3±5,6 kU/l), u pozostałych 73% wynosiło średnio 2 587,2±1 009 kU/l. Badaniem kolonizacji skóry zmienionej i niezmienionej przez S. aureus objęto wszystkich chorych na AZS. Ocenę odpowiedzi PBMC_s na aktywację określonymi stymulatorami/mitogenami przeprowadzono ogółem u 42 osób, w tym u 29 chorych na AZS i u 13 osób bez cech atopii. Próbki krwi żylnej pobrano od 18 pacjentów z lekkim lub średnim stanem klinicznego zaawansowania (SCORAD; 21–59; śr.=42,7±2,1) i od 11 chorych będących w ciężkim stanie klinicznym (SCORAD; 60–84; śr.=67,9±2,0).
Badanym tłumaczono cel i przebieg badań. Od każdego chorego uzyskano pisemną zgodę na udział w badaniach.
Grupę kontrolną stanowiło 13 osób (8 kobiet i 5 mężczyzn) z ujemnym wywiadem w kierunku chorób atopowych. Średni wiek w tej grupie wynosił 39,4±2,4. W badanej grupie kontrolnej wartość średnia całkowitego stężenia IgE w surowicy krwi wynosiła 42,6±8,3 kU/l i u żadnej z osób nie przekroczyła 100 kU/l.
Pomiaru całkowitego stężenia IgE w surowicy dokonywano przy pomocy komercyjnego zestawu diagnostycznego UniCAP Total IgE fluoroenzymeimmunoassay (Pharmacia Diagnostic) wg zaleceń producenta. Zakres oznaczalności zastosowanych pomiarów dla próbek nierozcieńczonych wynosił 2–5 000 kU/l. Stężenie eozynofilowego białka kationowego (ECP) w surowicy mierzono z wykorzystaniem zestawu UniCAP ECP fluoroenzymeimmunoassay kits (Pharmacia&Upjohn) zgodnie z zaleceniami producenta. Dolna granica oznaczalności pomiarów wynosiła <0,5 mg/l. Do czasu wykonania pomiaru surowicę przechowywano w temp. –70^oC.
Izolacja komórek jednojądrzastych z krwi obwodowej
PBMC_s izolowano z 10 ml heparynizowanej krwi żylnej w gradiencie gęstości. Krew rozcieńczano zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS), nawarstwiano na Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) i wirowano przez 30 min w 400 x g w temp. 20^oC. Komórki płukano w medium RPMI-1640, a następnie do dalszej analizy zawieszano w podłożu hodowlanym RPMI-1640 zawierającym 2 mM L-glutaminę i 10% płodową surowicę cielęcą, FCS (Gibco, Grand Island, N.Y.).
Hodowle komórkowe
Hodowle komórkowe prowadzono na 96-dołkowych płytkach hodowlanych (NUNC), w atmosferze wzbogaconej w CO₂ (5%), w temp. 37^oC. W każdym dołku umieszczano 0,2 ml zawiesiny PBMC_s o gęstości 1,0x10⁶/ml i dodawano różne aktywatory. Stosowano enterotoksynę gronkowcową typu B (SEB, superantygen) o stężeniu końcowym 0,1 mg/ml (Sigma, St. Louis, MO, USA), fitohemaglutyninę (PHA, mitogen) o stężeniu końcowym 2,5 mg/ml, Sigma) oraz mitogen szkarłatki (PWM) w rozcieńczeniu 1:100. Do próbek kontrolnych nie dodawano żadnego stymulatora. Hodowle prowadzono przez 24–96 godz. celem oznaczenia produkcji cytokin zgodnie z doniesieniami Yoshino i wsp. [6].
Produkcja cytokin
Pomiaru poziomu IFN-γ dokonywano po 96 godz. w supernatantach z hodowli PBMC_s stymulowanych SEB i PHA metodą immunoenzymatyczną (ELISA) przy użyciu komercyjnego zestawu OptEIA Human IFN-γ Set kits (Becton Dickinson Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), wg zaleceń producenta. Dolna granica czułości pomiarów wynosiła do 10 pg/ml. W supernatantach pochodzących z 48-godz. hodowli PBMC_s aktywowanych SEB oznaczano IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 i TNF-α przy pomocy zestawu Human Th1/Th2 Cytokine Cytometric Bead Array kits (Dickinson Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), wg procedury podanej przez producenta. Próbki analizowano w cytometrze przepływowym FACScan (Becton Dickinson) w programie BD CellQuest Software. Wyniki ilościowego pomiaru oznaczanych cytokin analizowano w programie BD CBA Analysis Software. Krzywa standardowa dla każdej cytokiny mieściła się w zakresie stężeń 20–5 000 pg/ml.
Jakościowa i ilościowa ocena
kolonizacji skóry przez S. aureus
Materiał do badań bakteriologicznych pobierano zmodyfikowaną metodą Williamsona i Kligmana [24] co najmniej z 4 różnych obszarów skóry zmienionej (najczęściej z okolic zgięć łokciowych, dołów podkolanowych, grzbietowych powierzchni dłoni) oraz 2 obszarów skóry niezmienionej (okolica międzyłopatkowa i lędźwiowa), które będąc trudno dostępnymi dla chorego, stwarzają małe prawdopodobieństwo przeniesienia bakterii ze zmian skórnych. Na powierzchni skóry umieszczano jałowe szklane cylinderki o średnicy 2,5 cm i wstrzykiwano do nich
2,0 ml jałowy 0,9% roztwór soli fizjologicznej. Skórę pocierano następnie szklaną bagietką, a płyn aspirowano.
W celu ilościowej oceny S. aureus w popłuczynach uzyskiwanych ze skóry zmienionej i niezmienionej próbki posiewano w kolejnych dziesiętnych rozcieńczeniach na płytki z podłożem agarowym, z dodatkiem 5% krwi baraniej (Oxoid, Hanpshire, UK). Hodowle inkubowano przez 24 godz. w temp. 37^oC. Gęstość kolonizacji skórnej określano liczbą colony forming unit (cfu), co pozwoliło na określenie liczby żywych bakterii w przeliczeniu na 1 cm² badanej powierzchni skóry. Uzyskane wartości analizowano po przekształceniu log10.
Identyfikację bakterii przeprowadzano przy pomocy standardowych technik laboratoryjnych na podstawie morfologii kolonii, testów na obecność koagulazy, czynnika zlepiającego clumping factor i potwierdzano w teście Slidex Staph kit (BioMerieux SA, Marcy-l Etoile, France).
Analiza statystyczna
Analizę statystyczną wykonano przy pomocy programu Statistica 5,0 for Windows 95. W przypadku analizy zmian ilościowych flory bakteryjnej skóry zastosowano przekształcenie logarytmiczne dziesiętne danych. Dla wszystkich danych empirycznych wyznaczano wartości średniej arytmetycznej oraz błąd standardowy średnich rozpatrywanych cech (±SE). Do weryfikacji hipotez o równości średnich arytmetycznych zastosowano test t-Studenta dla zmiennych niezależnych. Analizę korelacji prowadzono przy pomocy testów korelacji Pearsona i Spearmana w zależności od normalności rozkładu i oczekiwanego charakteru zależności. Poziom znamienności ustalono na P=0,05.
Wyniki
Analiza związku intensywności
kolonizacji bakteryjnej i stanu klinicznego
Badanie materiału uzyskanego z wypłukiwania skóry (patrz Materiał i metody) wykazało obecność S. aureus u 91,9% chorych, w obrębie zmian skórnych oraz u 62,2%, zarówno w obrębie skóry chorobowo zmienionej, jak i niezmienionej. Wykazano także statystycznie istotną różnicę (P<0,05) pomiędzy skórą zmienioną chorobowo i skórą niezmienioną w zakresie średniej gęstości bakterii na 1 cm2 (tab. 2.). Nie zaobserwowano natomiast znamiennych różnic w częstości występowania S. aureus na skórze zmienionej i niezmienionej, między osobami dorosłymi a dziećmi (tab. 3.).
Ocena średniej, wyjściowej gęstości kolonizacji (infekcji) w obrębie skóry zmienionej i niezmienionej przez S. aureus u każdego pacjenta umożliwiła wyodrębnienie trzech grup chorych. Jako kryterium podziału przyjęto różny stopień nasilenia kolonizacji gronkowcem w miejscach, z których pobierano materiał (grupy I i II) lub jej brak (grupa III). Podstawową charakterystykę chorych i różnice między analizowanymi grupami przedstawiono w tab. 4. Wyniki analizy korelacji pomiędzy gęstością S. aureus (log10) w obrębie skóry zmienionej i niezmienionej a stopniem zaawansowania klinicznego (SCORAD index) przedstawiono w tab. 5. Wartość współczynnika korelacji R w teście korelacji Spearmana wynosiła dla skóry zmienionej chorobowo 0,74; p<0,001, a dla skóry niezmienionej 0,46; p=0,03, a zatem dodatnią korelację między gęstością kolonizacji bakteryjnej skóry (log10) a SCORAD index wykazano również w odniesieniu do skóry chorobowo niezmienionej (tab. 5.).
Produkcja cytokin o profilu Th1
przez limfocyty T krwi obwodowej
po stymulacji SEB, PHA lub PWM
Produkcja IFN-γ w supernatantach z hodowli PBMC_s stymulowanych SEB była znamiennie niższa u 29 chorych na AZS – niezależnie od wyjściowej intensywności kolonizacji bakteryjnej skóry zmienionej i miejsc niezmienionych oraz stanu klinicznego – w porównaniu do stężeń tej cytokiny w grupie osób zdrowych. Limfocyty T krwi obwodowej, stymulowane fitohemaglutyniną (PHA), produkowały znamiennie mniej IFN-γ jedynie u chorych z wysoką gęstością S. aureus w skórze zmienionej. Po stymulacji PBMC_s mitogenem szkarłatki (PWM) nie wykazano znamiennych różnic dla stężeń interferonu między chorymi na AZS a grupą kontrolną (ryc. 1a., tab. 6.). Wykazana ponadto statystycznie znamiennie obniżona, w porównaniu do kontroli, produkcja TNF-αu chorych na AZS
(1 467,2±2 270,9±348 pg/ml; P<0,05) dotyczyła w szczególności pacjentów z gęstością kolonizacji S. aureus w zakresie log 7,14–8,41 w obrębie skóry zmienionej
i log 5,48–7,97 w obrębie skóry niezmienionej. U chorych na AZS z wysokim SCORAD index (zakres 60–84) produkcja TNF-αnie różniła się znamiennie w porównaniu z grupą kontrolną (tab. 6.).
Produkcja IL-2 w supernatantach – pochodzących z hodowli limfocytów T krwi obwodowej chorych na AZS – nie różniła się znamiennie od stężeń w grupie kontrolnej. Różnice znamienne statystycznie wykazano pomiędzy chorymi na AZS – z nasiloną kolonizacją bakteryjną, niezależnie od jej lokalizacji, i wysokim klinicznym współczynnikiem SCORAD – a pacjentami, u których liczba bakterii w obrębie skóry zmienionej (log 3,57–6,99) i niezmienionej (log 3,13–5,02) była niska (P<0,05 i P<0,01, ryc. 1a.).
Związek pomiędzy stanem zaawansowania
klinicznego a produkcją IFN-γ
PBMC_s izolowane od chorych z AZS charakteryzowała obniżona zdolność do produkcji IFN-γ in vitro w następstwie stymulacji SEB i PHA w porównaniu do osób bez atopii. Wykazano statystycznie znamiennie ujemną korelację między zmniejszoną produkcją interferonu a zaawansowaniem klinicznym AZS w okresie zaostrzenia wyrażonym jako SCORAD index (ryc. 2. i ryc. 3.). U chorych na AZS, wykazujących kolonizację S. aureus jedynie w obrębie skóry zmienionej, nie stwierdzono statystycznie istotnej korelacji pomiędzy produkcją TNF-g a ilością bakterii. Natomiast u chorych na AZS, u których kolonizacja (infekcja) gronkowcem występowała równolegle na skórze atopowo zmienionej i niezmienionej (R=-0,46; P=0,04) wykazano dodatnią korelację między produkcją IFN-γ a ilością bakterii kolonizujących skórę (tab. 5.).
Produkcja cytokin Th2
przez PBMC_s po stymulacji SEB
Produkcja IL-4, IL-5 i IL-10 nie różniła się znamiennie u chorych na AZS, w porównaniu do osób z grupy kontrolnej. Wyjątek stanowiło znamiennie podwyższone stężenie IL-10 u 8 pacjentów z niską gęstością kolonizacji bakteryjnej skóry niezmienionej w porównaniu z grupą kontrolną (2 719±661 pg/ml vs 927±145 pg/ml; P<0,01) oraz z chorymi na AZS (n=10) z nasiloną kolonizacją gronkowcem w obrębie skóry zmienionej i niezmienionej
(2 719±661 pg/ml vs 1 040±295 pg/ml; P<0,05).
Wykazano ponadto, że produkcja IL-5 w hodowlach PBMC_s izolowanych od chorych na AZS znamiennie korelowała ze stężeniem eozynofilowego białka kationowego uwalnianego z eozynofilów (R=0,52; P<0,01; ryc. 3.). Nie wykazano natomiast statystycznie znamiennej korelacji pomiędzy produkcją IL-4 a poziomem całkowitego IgE w surowicy (R=0,29; P>0,05).
Wnioski
1. Obecność i intensywność kolonizacji skóry chorych na AZS przez S. aureus ma związek z nasileniem objawów chorobowych.
2. Gęstość kolonizacji w obrębie skóry zmienionej i niezmienionej chorobowo ma wpływ na odpowiedź limfocytów T aktywowanych SEB.
3. Statystycznie znamiennie obniżona korelacja pomiędzy zmniejszoną produkcją IFN-γ a zaawansowaniem klinicznym AZS w okresie zaostrzenia objawów AZS wskazuje, że obserwowana zależność odzwierciedla przede wszystkim status kliniczny chorych na AZS.
Dyskusja
Badania klonów limfocytów T u chorych na AZS wskazują, iż pobudzenie subpopulacji limfocytów T pomocniczych (Th) prowadzi do wytwarzania cytokin mających istotny udział w patogenezie AZS [25]. Wg niektórych autorów egzotoksyny gronkowcowe, obok ich działania jako superantygeny, mogą w przypadku chorych na AZS pełnić także rolę alergenów [26]. Nasze badania pozwoliły wykazać, że w okresie zaostrzenia choroby kolonizacja (infekcja) zmian skórnych miała miejsce u 92% chorych z AZS, jednak nie była ona jednorodna. U części z nich wykazano wysoką kolonizację bakteryjną we wszystkich lub tylko w niektórych lokalizacjach zmian skórnych (67%), u pozostałych była ona niska we wszystkich miejscach zapalnie zmienionych (33%). Potwierdzono również wcześniejsze obserwacje, że ilość drobnoustrojów izolowana z cm2 skóry zmienionej i niezmienionej koreluje z zaawansowaniem objawów klinicznych wyrażonym wartością SCORAD [18, 19].
Podjęte badania zmierzały do ustalenia, na ile różnice w gęstości kolonizacji bakteryjnej pomiędzy chorymi na AZS różnią pacjentów pod względem produkcji cytokin Th1 i Th2 przez limfocyty T krwi obwodowej in vitro po ich stymulacji superantygenem (SEB) lub mitogenami (PHA, PWM). Zważywszy, że szczepy S. aureus izolowane ze skóry chorych na AZS w ok. 60% wytwarzają superantygen(y) [9, 19], zastosowanie SEB jako swoistego aktywatora stanowi właściwy układ do badania PBMC_s. Obserwacjami po raz pierwszy objęto nie tylko chorych, u których kolonizacja gronkowcem występowała w obrębie skóry zmienionej, ale również grupę pacjentów z równoległą kolonizacją skóry niezmienionej (miejsc kontrolnych). Nasze badania wykazały, że nasilenie stanu klinicznego pacjentów z AZS koreluje ze znamiennie obniżoną produkcją IFN-γ w porównaniu do osób zdrowych. Wprawdzie zbliżoną obserwację poczynili już Campbell i wsp. [16] oraz Byron i wsp. [17], ale w niniejszej pracy udało się wykazać tę zależność nie tylko po stymulacji PBMC_s in vitro SEB, lecz również po aktywacji nieswoistym stymulatorem – fitohemaglutyniną. Statystycznie znamiennie obniżona produkcja interferonu u chorych na AZS występowała niezależnie od intensywności kolonizacji przez S. aureus skóry zmienionej i niezmienionej oraz w grupie 10 chorych, u których nie wykazano obecności bakterii w miejscach atopowo zmienionych. Obserwacja ta potwierdza tezę, iż upośledzenie syntezy IFN-γ jest jedną z przyczyn zaburzonej odporności na obecny na skórze szczep gronkowca, co prowadzi do kolonizacji skóry przez tę bakterię [7, 8, 27]. Ostatnio Nomura i wsp. [7] stwierdzili obniżoną ekspresję genów dla czynników przeciwbakteryjnych w skórze, jako wynik lokalnej nadprodukcji cytokin Th2 (IL-4, IL-13) i obniżonego poziomu cytokin prozapalnych, jak TNF-a, IFN-γ i IL-1b. Wykazany w układzie in vitro prawdopodobny mechanizm tego zjawiska polega na inhibicyjnym oddziaływaniu w skórze IL-4 i IL-13 na TNF-αi IFN-γ jako potencjalnych induktorów ludzkich b-defensyn, w tym HBD-3. Campbell i wsp. [16] twierdzą, że znamienne obniżenie produkcji IFN-γ u chorych na AZS jest wynikiem równoczesnego upośledzenia produkcji tej cytokiny przez pojedyncze komórki i całe populacje komórek, zdolnych do jej wytwarzania. Jednocześnie wykazaliśmy, że produkcja IFN-γ w 96-godzinnych hodowlach PBMC_s ujemnie koreluje z gęstością szczepów S. aureus, kolonizujących skórę niezmienioną w grupie 23 chorych na AZS, choć podobnych zależności nie stwierdzono w odniesieniu do intensywności kolonizacji w obrębie skóry zmienionej. Uzyskane przez autorów niniejszej pracy wyniki sugerują jednak, że obniżona produkcja IFN-γ odzwierciedla przede wszystkim status kliniczny chorych na AZS, chociaż gęstość kolonizacji S. aureus w obrębie skóry zmienionej i niezmienionej u chorych na AZS ma wpływ na odpowiedź limfocytów T, aktywowanych SEB.
Dalsze obserwacje pozwalają wykazać, w populacji badanych chorych, przesunięcie w kierunku profilu cytokinowego Th2, związane nie tylko z obniżoną produkcją IFN-γ , ale również TNF-α [25]. Znamiennie niższą produkcję TNF-α u chorych z AZS, w porównaniu do osób bez atopii, wykazywali już Takahashi i wsp. [4]. W naszej grupie znamiennie niska produkcja TNF-α dotyczyła pacjentów z wysoką kolonizacją bakteryjną, zarówno w obrębie skóry zmienionej, jak i niezmienionej. W przeciwieństwie do uprzednich analiz nie wykazaliśmy dodatniej znamiennej korelacji pomiędzy IFN-γ a TNF-a.
W badanej grupie chorych nie potwierdzono znamiennych różnic w produkcji IL-2 przez limfocyty T krwi obwodowej u chorych na AZS w porównaniu do kontroli. Wykazano jednak znamienne różnice w poziomie IL-2 między grupami z wysoką kolonizacją skóry zmienionej i niezmienionej oraz wysoką wartością indeksu SCORAD, a pacjentami z niską ilością bakterii i ze słabo nasilonymi zmianami klinicznymi. Obserwacje autorów pozostają zgodne z doniesieniem Kapp i wsp. [28], którzy wykazali, że zdolność do produkcji IL-2 przez limfocyty izolowane z krwi obwodowej odwrotnie koreluje z klinicznym nasileniem atopowego zapalenia skóry. W tych samych badaniach wykazano znamiennie wyższe poziomy receptora dla IL-2 (IL-2R) w surowicy pacjentów z AZS. Ostatnio Yoshino i wsp. [6] opisali u chorych z wysokim klinicznym SCORAD obniżoną reaktywność PBMC_s na SEB, tłumacząc ją zwiększoną apoptozą aktywowanych limfocytów T. Konig i wsp. [29] sugerują, że zahamowana proliferacja PBMC_s chorych na AZS spowodowana jest zahamowaną ekspresją IL-2 w stymulowanych przez SEB limfocytach T. W badaniach własnych [18] wykazano znamiennie wyższy odsetek apoptotycznych limfocytów T aktywowanych SEB u pacjentów z wysoką kolonizacją bakteryjną i wysokim klinicznym SCORAD, przy równocześnie znamiennie obniżonej produkcji IL-2.
W niniejszej pracy nie wykazano znamiennych różnic pomiędzy chorymi na AZS i grupą kontrolną pod względem produkcji cytokin o profilu Th2 (IL-4, IL-5) przez PBMC_s w odpowiedzi na stymulację SEB. Podobne obserwacje poczynili uprzednio Aleksza i wsp. [30]. Yoshino i wsp. [6] wykazali, że PBMC_s od pacjentów z niską wartością indeksu SCORAD charakteryzowała znamiennie niższą produkcja IL-4 w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy u chorych z wysokim SCORAD poziom tej cytokiny nie różnił się od grupy kontrolnej. Ostatnie badania Heaton i wsp. [14] wskazują na rolę gronkowcowej enterotoksyny B w wybiórczej stymulacji produkcji IL-5 przez PBMC_s izolowanych od osób zarówno z objawami atopowego zapalenia skóry, jak i astmy atopowej. Wykazana przez nas znamiennie dodatnia korelacja między produkcją IL-5 in vitro a stężeniem ECP w surowicy pacjentów atopowych promuje obserwacje Wedi i wsp. [31], że autokrynna produkcja IL-5 przez eozynofile wydłuża okres przeżycia tych komórek. W rzeczywistości wydzielanie cytokin przez zaktywowane przez SEB limfocyty T ściśle zależy od wzajemnych interakcji limfocyt T-monocyt, podobnie, jak wykazany udział innych niż limfocyty T CD4⁺ komórek w produkcji cytokin w hodowlach stymulowanych SEB [16, 25].
Piśmiennictwo
1. Akdis CA, Akdis M, Trautmann A, et al.: Immune regulation in atopic dermatitis. Curr Opin Immunol, 2000, 12: 641-6.
2. Galli E, Cicconi R, Rossi P, et al.: Atopic dermatitis: molecular mechanism, clinical aspects and new therapeutical approaches. Curr Mol Med 2003, 3: 127-38.
3. Taha RA, Leung DYM, Boguniewicz M, et al.: IL-4 and IL-5 receptor mRNA expression in acute and chronic atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol 1997, 99: 331-8.
4. Takahashi T, Sasaki Y, Hama K, et al.: Production of IL-4, IL-2, IFN-γamma, and TNF-alpha by peripheral blood mononuclear cells of patients with atopic dermatitis. J Dermatol Sci 1992, 3: 172-80.
5. Koning B, Neuber K, Koning W: Responsiveness of peripheral blood mononuclear cells from normal and atopic donors to microbial superantigens. Int Arch Allergy Immunol 1995, 106: 124-33.
6. Yoshino T, Asada H, Sano S, et al.: Impaired responses of peripheral blood mononuclear cells to staphylococcal superantigen in patients with severe atopic dermatitis: a role of T cell apoptosis. J Invest Dermatol 2000, 114: 281-8.
7. Nomura I, Goleva E, Howell MD, et al.: Cytokine milieu of atopic dermatitis, as compared to psoriasis, skin prevents induction of innate immune response genes. J Immunol 2003, 171: 3262-9.
8. Ong PY, Ohtake T, Brandt C, et al.: Endogenous antimicrobial peptides and skin infections in atopic dermatitis. N Engl J Med 2002 347: 1151-60.
9. Leung DYM: Infection in atopic dermatitis. Curr Opin Pediatr 2003 15: 399-404.
10. Abeck D, Mempel M: Staphylococcus aureus colonization in atopic dermatitis and its therapeutic implications. Br J Dermatol 1998, 139: 13-6.
11. Goh CL, Wong JS, Giam YC: Skin colonization of Staphylococcus aureus in atopic dermatitis patients seen at the National Skin Centre, Singapore. Int J Dermatol 1997, 36: 653-7.
12. Kotzin BL, Leung DYM, Kappler J, et al.: Superantigens and human disease. Adv Immunol 1993, 54: 99-166.
13. Sperber K, Silverstein L, Brusco C, et al.: Cytokine secretion induced superantigens in peripheral blood mononuclear cells, lamina propria lymphocytes, and intraepithelial lymphocytes. Clin Diag Lab Immunol 1995, 2: 473-7.
14. Heaton T, Mallon D, Venaille T, et al.: Staphylococcal enterotoxin induced IL-5 stimulation as a cofactor in the pathogenesis of atopic disease: the hygiene hypothesis in reverse? Allergy 2003, 58: 252-6.
15. Lin YT, Wang CT, Hsu CT, et al.: Differential susceptibility to staphylococcal superantigen (SsAg)-induced apoptosis of CD4⁺ T cells from atopic dermatitis patients and healthy subjects: the inhibitory effect of IL-4 on SsAg-induced apoptosis.
J Immunol 2003, 171: 1102-8.
16. Campbell DE, Fryga AS, Bol S, et al.: Intracellular interferon- -gamma (IFN-γ) production in normal children and children with atopic dermatitis. Clin Exp Immunol 1999, 115: 377-82.
17. Byron KA, Liberatos S, Varigos GA, et al.: Interferon-gamma production in atopic dermatitis: a role for prostaglandins? Int Arch Allergy Immunol 1992, 99: 50-5.
18. Kędzierska A, Kaszuba-Zwoińska J, Kapińska-Mrowiecka M, et al.: SEB-induced T-cells apoptosis in atopic patients – correlation to the clinical status and skin colonization with Staphylococcus aureus. Arch Immun Ther Exp, 2004 (w druku).
19. Capoluongo E, Giglio A, Lavieri MM, et al.: Genotypic and phenotypic characterization of Staphylococcus strains isolated in subjects with atopic dermatitis. Higher prevalence of exfoliative B toxin production in lesional strains and correlation between the markers of disease intensity and colonization density. J Dermatol Sci 2001, 26: 145-55.
20. Adamek-Guzik T, Guzik T, Czerniawska-Mysik G i wsp.: Wpływ leczenia atopowego zapalenia skóry na stopień kolonizacji przez Staphylococcus aureus. Przegl Lek 2002, 58: 1029-33.
21. Hanifin JM., Rajka G: Diagnostic features of atopic dermatitis. Acta Derm Venereol (Suppl) 1980, 92: 44-7.
22. European Task Force on Attopic Dermatitis: Severity scorning of atopic dermatitis: the SCORAD index. Consensus report. Dermatology 1993, 186: 23-31.
23. Hanifin JM: Standardized grading of subjects for clinical research studies in atopic dermatitis: workshop report. Acta Dermato Venerol (Suppl) 1989, 144: 28-30.
24. Williamson P, Kligman A: A new method for the quantitative investigation of cutaneous bacteria. J Invest Dermatol 1965, 45: 498-503.
25. Akdis M, Trautmann A, Klunker S, et al.: Cytokine network and dysregulated apoptosis in atopic dermatitis. Acta Odontol Scand 2001, 59: 178-82.
26. Zollner TM, Wichelhaus TA, Hartung A, et al.: Colonization with superantigen-producing Staphylococcus aureus is associated with increased severity of atopic dermatitis. Clin Exp Allergy 2000, 30: 994-1000.
27. Campbell DE, Kemp AS. Cell mediated immunity to Staphylococcus aureus in Childhood atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol 1997, 99: 263-9.
28. Kapp A, Neuner P, Kurtmann J, et al.: Production of interleukin-2 by mononuclear cells in vitro in patients with atopic dermatitis and psoriasis – comparison with serum interleukin 2 receptor levels. Acta Derm Venereol 1991, 71: 403-6.
29. Konig B, Neuber K, Konig W: Responsiveness of peripheral blood mononuclear cells from normal and atopic donors to microbial superantigens. Int Arch Allergy Immunol 1995, 106: 124-33.
30. Aleksza M, Lukacs A, Antal-Szalmas P., et al.: Increased frequency of intracellular interleukin (IL) – 13 and IL-10, but not IL-4, expressing CD4⁺ and CD8+ peripheral T cells of patients with atopic dermatitis. Br J Dermatol, 2002, 147: 1135-41.
31. Wedi B, Raap U, Lewrick H, et al.: Delayed eosinophil programmed cell death in vitro: A common feature of inhalant allergy and extrinsic and intrinsic atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol 1997, 100: 536-43.