Antibodies against p53 protein (anti-p53 Ab)

Jądrowa fosfoproteina p53, kodowana przez jeden z najważniejszych znanych genów supresorowych nowotworów, uczestniczy w reakcji komórki na uszkodzenia DNA. Mutacje w genie p53 notuje się w większości ludzkich nowotworów. Badania z przełomu lat 70. i 80., przeprowadzone na zwierzęcych modelach nowotworowych, wskazywały na istnienie humoralnej odpowiedzi na białko p53 [1–3]. W roku 1982 opisano po raz pierwszy obecność przeciwciał przeciwko ludzkiemu białku p53 (Ab anty-p53), występujących u 9 proc. chorych na raka sutka [4]. Kolejna praca dotycząca tego zjawiska pojawiła się w roku 1987 i donosiła o przeciwciałach przeciwko p53, występujących w surowicach u dzieci z różnymi postaciami nowotworów [5]. W badaniach tych nie poszukiwano związku między występowaniem Ab anty-p53 a klinicznymi cechami nowotworu; nie stały się one również przedmiotem szerszego zainteresowania. Dopiero odkrycie faktu, iż mutacje w genie p53 prowadzą do gromadzenia białka p53 w komórce i są najczęściej obserwowanym uszkodzeniem DNA we wszystkich rodzajach ludzkich nowotworów, rzuciło nowe światło na wcześniejsze obserwacje, dotyczące występowania przeciwciał przeciwko białku p53 w surowicach chorych z nowotworami i stało się przesłanką do podjęcia dalszych badań.
Do tej pory występowanie Ab anty-p53 zostało przeanalizowane w wielu typach ludzkich nowotworów. W początkowych badaniach, przy niewielkiej liczbie prób, stosowano techniki immunoprecypitacji bądź Western-blottingu. Analiza dużych serii prób stała się możliwa dzięki rozwojowi technik ELISA. W pracy obejmującej ponad 1 000 prób, Lubin i wsp. wykazali, iż Ab anty-p53 występują w surowicach osób zdrowych niezmiernie rzadko, bo z częstością poniżej 0,5 proc. oraz, że ich obecność u pacjentów z nowotworami koreluje dodatnio z częstością występowania mutacji w genie p53 [6]. Przeciwciała anty-p53 występują u około 30 do 40 proc. osób ze zmutowanym genem p53 [6]. W komórkach nowotworowych większości pacjentów z Ab anty-p53 obserwuje się akumulację białka p53 [7, 8]. Początkowo brak odpowiedzi humoralnej na uszkodzone białko p53 próbowano tłumaczyć zależnością tego zjawiska od rodzaju mutacji [9]. Dalsze badania, w których wykazano, że podobne mutacje mogą powodować różną odpowiedź humoralną, wskazywały na konieczność weryfikacji tej hipotezy oraz na potencjalny wpływ innych, poza mutacjami, czynników, jak chociażby specyficzna dla każdego pacjenta kombinacja genów MHC klasy I i II [7, 8, 10, 11].
W badaniach z użyciem fragmentów białka p53 i syntetycznych peptydów udowodniono, że przeciwciała przeciwko białku p53 wiążą się z końcem aminowym (zawierającym domeny odpowiedzialne za interakcję z innymi białkami, jak mdm2 czy TBP) lub karboksylowym białka (z domeną odpowiedzialną za oligomeryzację p53), a więc z regionami, w których nie występują mutacje [6, 12].
Fakt ten znajduje potwierdzenie w obserwacji, iż Ab anty-p53 porównywalnie rozpoznają zarówno białko natywne, jak i zmutowane [12, 13]. Podobną lokalizację epitopów zaobserwowano podczas immunizacji myszy i królików ludzkim białkiem p53 [14]. Tak więc akumulacja białka p53 może być głównym czynnikiem odpowiedzialnym za rozwinięcie humoralnej odpowiedzi przeciwko białku p53 u chorych na nowotwory. Wydaje się, że tolerancja immunologiczna na endogenne białko p53 jest bardzo niska (białko p53 w normalnych warunkach występuje w bardzo małych ilościach). Przeciwciała anty-p53 obecne w surowicach chorych należą głównie do podklas IgG1 i IgG2, choć u niektórych pacjentów dominują immunoglobuliny klasy IgA. U niektórych osób wykrywano również przeciwciała klasy IgM, choć nigdy nie stanowiły one jedynego izotypu. Wśród Ab anty-p53 nie znaleziono natomiast przeciwciał podklasy IgG3 i IgG4 [6].
W trakcie badań nad występowaniem Ab anty-p53 w surowicach osób ze schorzeniami nowotworowymi podejmowano próby wykorzystania tego parametru do celów rokowniczych. W raku sutka obecność przeciwciał przeciwko białku p53 nie tylko wiąże się z prawdopodobieństwem krótszego przeżycia chorych, ale i koreluje z innymi niekorzystnymi czynnikami prognostycznymi, jak brak receptorów estrogenowych [15]. Współzależność występowania Ab anty-p53 z gorszym rokowaniem stwierdzono również, m.in. w nowotworach przełyku [16], jelita grubego [17], głowy i szyi [18] oraz żołądka [19]. Istnieje również wiele prac, w których nie zanotowano rokowniczej wartości oznaczania Ab anty-p53, jak też korelacji między obecnością tych przeciwciał a innymi parametrami klinicznymi [20–22].
W chwili obecnej dwie dziedziny: wczesna diagnostyka nowotworowa i monitorowanie przebiegu leczenia wydają się być najbardziej obiecującymi zastosowaniami oznaczania przeciwciał przeciwko białku p53 w onkologii.
Mimo pojawiających się w niektórych pracach sugestii co do braku absolutnej specyficzności występowania Ab anty-p53 u pacjentów chorych na nowotwory, zarówno uważny przegląd dostępnej literatury, jak i wyniki najnowszych badań, rozwiewają te wątpliwości [23, 24]. W bieżącym roku grupa japońskich badaczy opracowała test ELISA, o bardzo wysokiej czułości oraz specyficzności i użyła go do przebadania ponad 1 000 pacjentów z różnymi postaciami nowotworów. Pozytywny wynik uzyskano w blisko 20 proc. przypadków, potwierdzając tym samym przydatność oznaczeń Ab anty-p53 w diagnostyce nowotworowej [23].
Analiza obecności Ab anty-p53, będących wyrazem uszkodzeń genu p53, a więc częstego i wczesnego wydarzenia w kaskadzie zmian prowadzących do powstania nowotworu, wydaje się być również obiecującym narzędziem diagnostycznym. Modelową grupą wysokiego ryzyka w próbach wykorzystania oznaczeń Ab-anty p53 do wczesnego wykrywania zmian nowotworowych, są palacze tytoniu. Lubin i wsp. opisali 2 przypadki wykrycia Ab anty-p53 u osób palących, u których w 5 i 15 mies. od ujawnienia obecności Ab anty-p53 rozwinął się nowotwór złośliwy płuc [25]. W retrospektywnym badaniu grupy osób palących z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc opisano również występowanie surowiczych Ab anty-p53 na 5 (w przypadku raka sutka) 6 i 7 (w przypadku raka płuca) oraz 11 mies. (w przypadku raka prostaty) przed zdiagnozowaniem raka [26]. Trivers i wsp. badając grupę osób zawodowo narażonych na kontakt z chlorkiem winylu wykazali, że obecność przeciwciał przeciwko białku p53 jest wczesnym markerem naczyniakomięsaka wątroby [27]. Wykazano również, że przeciwciała mogą pojawiać się jeszcze przed objawami klinicznymi nowotworu w przypadku osób z przełykiem Barretta [28].
Do chwili obecnej zidentyfikowano wiele białek będących antygenami nowotworowymi, zdolnymi do indukcji odpowiedzi humoralnej i stanowiących potencjalnie obiecujący obiekt diagnostyczny [29]. Jednym z takich antygenów jest surwiwina (ang. survivin). Cząsteczka ta jest białkiem występującym preferencyjnie w zmienionych nowotworowo tkankach, zdolnym do bezpośredniego hamowania aktywności kaspaz. Przeciwciała przeciwko temu białku są obecne w surowicy pacjentów ze schorzeniami nowotworowymi częściej, niż ma to miejsce w przypadku białka p53, a jednocześnie nie są wykrywane w populacji osób zdrowych [30]. Problemem pojawiającym się podczas oceny przydatności oznaczania autoprzeciwciał skierowanych przeciwko antygenom nowotworowym w diagnostyce nowotworowej jest fakt, iż przy rozpatrywaniu odpowiedzi na pojedyncze antygeny, odsetek chorych, u których stwierdza się występowanie przeciwciał rzadko przekracza 20 proc. Jeśli jednak stosuje się badanie panelu autoprzeciwciał, odsetek ten można zwiększyć ponaddwukrotnie. W bieżącym roku Zhang i wsp. opublikowali badania, przeprowadzone na grupie ponad 500 chorych z różnymi postaciami nowotworów, w których analizowali obecność surowiczych przeciwciał przeciwko 7 antygenom nowotworowym: c-myc, p53, cyklinie B1, p62, Koc, IMP1 i surwiwinie. W tym kompleksowym badaniu odsetek osób z wykrywalnymi przeciwciałami stanowił 44–68 proc. Dodatkowo uzyskano też informacje na temat różnic w profilu odpowiedzi humoralnej na antygeny nowotworowe pomiędzy poszczególnymi rodzajami nowotworów, co mogłoby sugerować nawet możliwość różnicowania między typami nowotworów [31]. Wydaje się więc, że wczesne testy przesiewowe w kierunku nowotworów, oparte na analizie surowiczych przeciwciał przeciwko antygenom nowotworowym, będą musiały być konstruowane z myślą o badaniu osób z grup wysokiego ryzyka, pod kątem wystąpienia konkretnych typów nowotworów [32]. W swojej pracy La Naour i wsp. zaproponowali taki właśnie zestaw przeciwciał przydatnych do monitorowania osób z grupy wysokiego ryzyka zachorowania na raka wątroby, obejmujący przeciwciała przeciwko kalretikulinie, cytokeratynie 8, kinazie A difosforanów nukleozydów oraz podjednostce beta syntazy F1-ATP [33]. Poziom przeciwciał przeciwko białku p53 może być również wykorzystany do monitorowania chorego podczas terapii: opisano ponowne pojawienie się Ab anty-p53 w surowicy poprzedzające nawrót raka sutka [15].

Precyzyjna odpowiedź na pytanie o związek mutacji w genie p53, akumulacji produktu genu p53 i istnienia humoralnej odpowiedzi skierowanej przeciwko białku p53, pozostaje więc wciąż kwestią przyszłości, podobnie jak zastosowanie na szeroką skalę analizy występowania Ab anty-p53 jako narzędzia diagnostycznego, a szczególnie wykorzystanie tego parametru w rutynowych badaniach przesiewowych w kierunku chorób nowotworowych. Wszystko wskazuje jednak na to, że badanie obecności Ab anty-p53 może stać się przydatną procedurą w nowoczesnej diagnostyce, zajmującej się wczesnym wykrywaniem schorzeń nowotworowych. Rozwój diagnostyki nowotworów, oparty m.in. na opracowaniu kompleksowych testów służących do wykrywania odpowiedzi humoralnej na zestaw antygenów związanych z nowotworami może być jedną ze skutecznych dróg prowadzących do poprawy wyników leczenia nowotworów.
PIŚMIENNICTWO
1. De Leo AB, Jay G, Appella E, Dubois GC, Law LW, Old LJ. Detection of a transformation-related antigen in chemically induced sarcomas and other transformed cells of the mouse. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76: 2420-4.
2. Kress M, May E, Cassingena R, May P. Simian virus 40-transformed cells express new species of proteins precipitable by anti-simian virus 40 tumor serum. J Virol 1979; 31: 472-83.
3. Rotter V, Witte ON, Coffman R, Baltimore D. Abelson murine leukemia virus-induced tumors elicit antibodies against a host cell protein, P50. J Virol 1980; 36: 547-55.
4. Crawford LV, Pim DC, Bulbrook RD. Detection of antibodies against the cellular protein p53 in sera from patients with breast cancer. Int J Cancer 1982; 30: 403-8.
5. Caron de Fromentel C, May-Levin F, Mouriesse H, Lemerle J, Chandrasekaran K, May P. Presence of circulating antibodies against cellular protein p53 in a notable proportion of children with B-cell lymphoma. Int J Cancer 1987; 39: 185-9.
6. Lubin R, Schlichtholz B, Teillaud JL, Garay E, Bussel A, Wild CP. p53 antibodies in patients with various types of cancer: assay, identification, and characterization. Clin Cancer Res 1995; 1: 1463-9.
7. Wild CP, Ridanpaa M, Anttila S, Lubin R, Soussi T, Husgafvel-Pursiainen K, Vainio H. p53 antibodies in the sera of lung cancer patients: comparison with p53 mutation in the tumour tissue. Int J Cancer 1995; 64: 176-81.
8. Winter SF, Minna JD, Johnson BE, Takahashi T, Gazdar AF, Carbone DP. Development of antibodies against p53 in lung cancer patients appears to be dependent on the type of p53 mutation. Cancer Res 1992; 52: 4168-74.
9. Davidoff AM, Iglehart JD, Marks JR. Immune response to p53 is dependent upon p53/HSP70 complexes in breast cancers. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 3439-42.
10. Guinee DG Jr, Travis WD, Trivers GE, et al. Gender comparisons in human lung cancer: analysis of p53 mutations, anti-p53 serum antibodies and C-erbB-2 expression. Carcinogenesis 1995; 16: 993-1002.
11. Preudhomme C, Lubin R, Lepelley P, Vanrumbeke M, Fenaux P. Detection of serum anti p53 antibodies and their correlation with p53 mutations in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia. Leukemia 1994; 8: 1589-91.
12. Schlichtholz B, Legros Y, Gillet D, Gaillard C, Marty M, Lane D, Calvo F, Soussi T. The immune response to p53 in breast cancer patients is directed against immunodominant epitopes unrelated to the mutational hot spot. Cancer Res 1992; 52: 6380-4.
13. Labrecque S, Naor N, Thomson D, Matlashewski G. Analysis of the anti-p53 antibody response in cancer patients. Cancer Res 1993; 53: 3468-71.
14. Legros Y, Lafon C, Soussi T. Linear antigenic sites defined by the B-cell response to human p53 are localized predominantly in the amino and carboxy-termini of the protein. Oncogene 1994; 9: 2071-6.
15. Peyrat JP, Bonneterre J, Lubin R, Vanlemmens L, Fournier J, Soussi T. Prognostic significance of circulating P53 antibodies in patients undergoing surgery for locoregional breast cancer. Lancet 1995; 345: 621-2.
16. Bergqvist AS, Bergqvist M, Brattstrom D, Hesselius P, Larsson A, Brodin O, Wagenius G. Serum p53 autoantibodies as prognostic marker in patients with oesophageal carcinoma. Anticancer Res 2001; 21: 4141-5.
17. Houbiers JGA, Vanderburg SH, Vandewatering LMG, Tollenaar RAEM, Brand A, Vandevelde CJH, Melief CJM. Antibodies against p53 are associated with poor prognosis of colorectal cancer. Br J Cancer 1995; 72: 637-41.
18. Werner JA, Gottschlich S, Folz BJ, Goeroegh T, Lippert BM, Maass JD, Rudert H. p53 serum antibodies as prognostic indicator in head and neck cancer. Cancer Immunol Immunother 1997; 44: 112-6.
19. Wurl P, Weigmann F, Meye A, et al. Detection of p53 autoantibodies in sera of gastric cancer patients and their prognostic relevance. Scand J Gastroenterol 1997; 32: 1147-51.
20. Skrzypski M, Szymanowska A, Janowicz A, et al. Serum anti-P53 antibodies (AB-anti-P53) in patients with advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Pneumonol Alergol Pol 2002; 70: 353-8.
21. Jassem E, Bigda J, Dziadziuszko R, Schlichtholz B i wsp. Serum p53 antibodies in small cell lung cancer: the lack of prognostic relevance. Lung Cancer 2001; 31: 17-23.
22. Abendstein B, Marth C, Muller-Holzner E, Widschwendter M, Daxenbichler G, Zeimet AG. Clinical significance of serum and ascitic p53 autoantibodies in epithelial ovarian carcinoma. Cancer. 2000; 88: 1432-7.
23. Shimada H, Ochiai T, Nomura F. Titration of serum p53 antibodies in 1,085 patients with various types of malignant tumors: a multiinstitutional analysis by the Japan p53 Antibody Research Group. Cancer 2003; 97: 682-9.
24. Soussi T. p53 Antibodies in the sera of patients with various types of cancer: a review. Cancer Res 2000; 60: 1777-88.
25. Lubin R, Zalcman G, Bouchet L, Trédaniel J, Legros Y, Cazals D, Hirsh A, Soussi T. Serum p53 antibodies as early markers of lung cancer. Nature Med 1995; 1: 701-2.
26. Trivers GE, De Bendetti VMG, Cawley HL i wsp. Anti-p53 antibodies in sera from patients with chronic obstructive pulmonary disease can predate a diagnosis of cancer. Clin Cancer Res 1996; 2: 1767-75.
27. Trivers GE, Cawley HL, Debendetti VMG, et al. Anti-p53 antibodies in sera of workers occupationally exposed to vinyl chloride. J Natl Cancer Inst 1995; 87: 1400-7.
28. Cawley HM, Meltzer SJ, De Benedetti, et al. Anti-p53 antibodies in patients with Barrett’s esophagus or esophageal carcinoma can predate cancer diagnosis. Gastroenterology 1998; 115: 19-27.
29. Tan EM. Autoantibodies as reporters identifying aberrant cellular mechanisms in tumorigenesis. J Clin Invest 2001; 108: 1411-5.
30. Rohayem J, Diestelkoetter P, Weigle B, Oehmichen A, Schmitz M, Mehlhorn J, Conrad K, Rieber EP. Antibody response to the tumor-associated inhibitor of apoptosis protein survivin in cancer patients. Cancer Res 2000; 60: 1815-7.
31. Zhang JY, Casiano CA, Peng XX, Koziol JA, Chan EK, Tan EM. Enhancement of antibody detection in cancer using panel of recombinant tumor-associated antigens. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003; 12: 136-43.
32. Naour FL, Brichory F, Beretta L, Hanash SM. Identification of tumor-associated antigens using proteomics. Technol Cancer Res Treat. 2002; 1: 257-62.
33. Naour FL, Brichory F, Misek DE, Brechot C, Hanash SM, Beretta L. A distinct repertoire of autoantibodies in hepatocellular carcinoma identified by proteomic analysis. Mol Cell Proteomics 2002; 1: 197-203.
ADRES DO KORESPONDENCJI
dr hab. Jacek Bigda
prof. nadzw. AMG
Zakład Biologii Komórki
Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii
UG-AMG
ul. Dębinki 1
80-211 Gdańsk
tel. 0 prefiks 58 349 14 34
lub 0 prefiks 58 349 14 38
faks 0 prefiks 58 349 14 45
e-mail: jjbigd@amg.gda.pl