VEGFR-2 receptor – target for anticancer therapy

Wstęp
W 1971 r. Judah Folkman zaproponował hipotezę o wpływie naczyń okołonowotworowych na rozwój nowotworów [1]. Dzięki nowo powstałym naczyniom krwionośnym możliwy jest dopływ tlenu i substancji odżywczych do rozwijającego się guza nowotworowego. Poprzez naczynia krwionośne, komórki nowotworowe przemieszczają się do innych narządów, gdzie mogą tworzyć przerzuty [2]. Kluczową rolę w powstawaniu sieci naczyń okołonowotworowych odgrywa naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu VEGF. Za pośrednictwem swoistych receptorów, znajdujących się na powierzchni komórek śródbłonkowych, czynnik VEGF stymuluje powstawanie sieci naczyń, wokół których grupują się komórki nowotworowe. Decydująca rola VEGF w procesie unaczynienia guzów nowotworowych skłoniła badaczy do poszukiwania inhibitorów hamujących działanie VEGF i blokujących aktywność jego receptorów. Celem pracy było przedstawienie roli VEGF i receptora VEGFR-2 w powstawaniu naczyń okołonowotworowych oraz omówienie różnych rozwiązań terapeutycznych, których molekularnym celem jest ten receptor.

Angiogeneza w nowotworach
Istnieje kilka różnych mechanizmów powstawania naczyń w guzach. Jednym z nich jest angiogeneza, czyli tworzenie nowych naczyń krwionośnych z naczyń już istniejących. Fizjologicznie proces ten zachodzi podczas życia płodowego, cyklu owulacyjnego, w trakcie gojenia się ran. Odgrywa ważną rolę w powstawaniu różnego rodzaju stanów chorobowych, takich jak retinopatia cukrzycowa, reumatoidalne zapalenie stawów, łuszczyca czy powstawanie nowotworów [3]. Angiogeneza jest wieloetapowym procesem, podczas którego dochodzi do istotnych zmian w środowisku otaczającym komórki. Proces ten zależy od lokalnej równowagi pomiędzy czynnikami angiogennymi (m.in. VEGF, FGF-1 i -2, metaloproteaz MMP) a inhibitorami angiogenezy (m.in. angioarestyny, angiopoetyny, kalretikuliny, czy endostatyny) działającymi na komórki śródbłonkowe, macierz pozakomórkową i błonę podstawną. W pierwszym etapie angiogenezy dochodzi do aktywacji proteaz, które rozkładają błonę podstawną naczyń krwionośnych i macierz pozakomórkową oraz do aktywacji czynników proangiogennych, które pobudzają komórki śródbłonkowe do proliferacji i migracji. Nowo powstałe komórki śródbłonka formują struktury tubularne dające początek nowym naczyniom krwionośnym [4]. W końcowym etapie dochodzi do odtworzenia błony podstawnej oddzielającej komórki śródbłonka od składników macierzy pozakomórkowej.
Naczynia okołonowotworowe mogą powstawać także w wyniku podłużnego rozszczepienia istniejących naczyń i proliferacji komórek śródbłonkowych wewnątrz naczynia (tzw. proces wgłobienia) [5], a także w wyniku kooptowania naczyń prawidłowych przez naczynia okołonowotworowe (ang. vascular cooption) bądź też przez budowanie naczyń mozaikowych, które tworzone są zarówno z komórek śródbłonkowych, jak i komórek nowotworowych [6, 7].
Doniesienia z ostatnich lat wskazują, że waskulogeneza, charakterystyczna dla wczesnego rozwoju zarodkowego, odgrywa również istotną rolę w powstawaniu naczyń okołonowotworowych [8, 9]. Naczynia powstałe z krążących w krwiobiegu prekursorowych komórek śródbłonka EPCs (ang. endothelial progenitor cells) mogą stanowić u myszy nawet do 50% wszystkich naczyń okołonowotworowych [10].
Naczynia krwionośne w nowotworach wyraźnie różnią się od naczyń prawidłowych [8, 9]. Posiadają wiele nietypowych rozgałęzień, pętli i połączeń, co często spowalnia przepływ krwi, a ich przepuszczalność powoduje wzrost ciśnienia śródmiąższowego wewnątrz guzów. W naczyniach okołonowotworowych brakuje często perycytów, a błona podstawna ma zmieniony skład chemiczny i luźno przylega do komórek śródbłonkowych. Profil transkrypcyjny komórek śródbłonkowych naczyń okołonowotworowych jest wyraźnie różny od profilu komórek naczyń prawidłowych. Na ich powierzchni występuje wiele charakterystycznych białek, m.in. receptory dla VEGF, integryny αvβ₃, endoglina (CD105), VCAM-1, białka z rodziny TEM [11]. Charakterystyczne markery mogą także pojawić się w okołonowotworowych perycytach (np. proteoglikan NG-2) oraz w macierzy pozakomórkowej znajdującej się w sąsiedztwie naczyń okołonowotworowych (np. fibronektyna z dodatkową domeną ED-B) [12].

VEGF w angiogenezie nowotworów
Czynniki wzrostu VEGF tworzą dość dobrze poznaną grupę, do której zalicza się VEGF-A, -B, -C, -D, -F, wirusowy orf-VEGF oraz czynnik wzrostu łożyska (PlGF) [13]. Istotną rolę w angiogenezie odgrywa VEGF-A, nazywany w skrócie VEGF lub też VPF (ang. vascular permeability factor). Gen dla tej cytokiny na drodze alternatywnego dojrzewania mRNA tworzy 7 różnych izoform (121, 145, 148, 165, 183, 189, 206). Poza tym istnieje także forma VEGF110, która jest wynikiem proteolitycznego rozkładu VEGF165 i VEGF189. Poszczególne postacie różnią się liczbą i składem aminokwasów, co pociąga za sobą różnice we właściwościach biochemicznych i biologicznych [13].
Ekspresja VEGF jest regulowana poprzez wiele mechanizmów. Najważniejszym jest niedotlenowanie (hipoksja). W odpowiedzi na miejscowe zmniejszenie ciśnienia parcjalnego tlenu gwałtownie zwiększa się w komórkach ilość czynnika transkrypcyjnego HIF-1α (ang. hypoxia-inducible factor). Czynnik HIF-1α razem z HIF-1β tworzy aktywny kompleks, który indukuje transkrypcję szeregu genów, w tym m.in. genu VEGF. Czynnik VEGF poprzez pobudzenie receptorów na komórkach śródbłonka, doprowadza do proliferacji i migracji komórek, z których tworzone są nowe naczynia krwionośne [13]. VEGF wpływa także na rozszerzanie naczyń, pośredniczy w sekrecji i aktywacji enzymów biorących udział w degradacji macierzy pozakomórkowej, a poprzez indukcję ekspresji białka antyapoptycznego Bcl-2 osłania komórki śródbłonkowe przed apoptozą [2].

VEGFR
VEGF jest ligandem dla dwóch receptorów: VEGFR-1 (Flt-1) i jego rozpuszczalnej formy sVEGFR1 oraz dla VEGFR-2 (KDR/Flk-1). Trzeci z receptorów: VEGFR-3 (Flt-4) pośredniczy w przekazywaniu sygnałów limfangiogennych, które doprowadzają do podziału komórek naczyń limfatycznych, a ligandami dla tego receptora są czynniki VEGF-C oraz VEGF-D (ryc. 1.) [14].

VEGFR-1
Receptor VEGFR-1, zwany też Flt-1 (ang. fms-like tyrosine kinase-1) jest pierwszym zidentyfikowanym receptorem należącym do rodziny RTK. W prawidłowych warunkach fizjologicznych ekspresja VEGFR-1 ma miejsce w komórkach śródbłonkowych i monocytach. U homozygotycznych myszy niedobór VEGFR-1 prowadzi do przerostu naczyń, co powoduje przedwczesną śmierć zarodków myszy już w połowie ciąży [15]. VEGFR-1 wykazuje zdolność wiązania nie tylko z VEGF-A, ale także PlGF i VEGF-B. W wielu różnych nowotworach obserwuje się nadekspresję VEGFR-1 oraz jego ligandów (PIGF i VEGF-B), co może świadczyć o udziale VEGFR-1 w patologicznej angiogenezie [3]. W wyniku alternatywnego składania transkryptu VEGFR-1 powstaje tzw. rozpuszczalna forma receptora VEGFR-1 (sFlt-1), pozbawiona 6. i 7. domeny immunoglobulinopodobnej oraz domeny śródbłonowej i wewnątrzkomórkowej kinazy tyrozynowej. Ta specyficzna budowa powoduje, że VEGFR-1, łącząc się z każdą wybraną izoformą VEGF zachowuje się jak czynnik antyangiogenny znoszący efekty działania VEGF [16].

VEGFR-2
VEGFR-2, nazywany u myszy Flk-1 (ang. fetal liver kinase-1) lub u ludzi KDR (ang. kinase domain receptor) odgrywa kluczową rolę w procesie waskulogenezy w okresie rozwoju embrionalnego oraz angiogenezy u osobników dojrzałych. U mysich embrionów wykazano obecność receptora VEGFR-2 w komórkach śródbłonkowych we wszystkich etapach embrio- i organogenezy, poczynając od momentu pojawienia się wysepek krwiotwórczych w pęcherzyku żółtkowym 8,5-dniowego zarodka. Embriony pozbawione receptora VEGFR-2 nie wykształcają unaczynienia i giną we wczesnym etapie embriogenezy [14]. W prawidłowych warunkach fizjologicznych receptor ten występuje prawie wyłącznie na powierzchni komórek śródbłonkowych i odgrywa decydującą rolę w proliferacji, migracji i różnicowaniu tych komórek [2].
Po przyłączeniu VEGF dochodzi do dimeryzacji receptora, a następnie do autofosforylacji kinazy tyrozynowej, co prowadzi do aktywacji wielu wewnątrzkomórkowych szlaków przekazywania sygnałów, w tym m.in. aktywacji szeregu kinaz oraz czynników transkrypcyjnych (fosfolipazy Cg, kinaz PI3, białek rodziny scr, ras i innych) (ryc. 2.) [13]. Efektem końcowym zachodzących w komórce mechanizmów jest m.in. proliferacja i migracja komórek śródbłonkowych oraz zwiększenie przepuszczalności naczyń krwionośnych.
Jednym z najsilniejszych induktorów transkrypcji VEGFR-2, podobnie jak VEGFR-1, jest niedotlenowanie. Mechanizm indukowanej hipoksją nadekspresji VEGFR-2 jest jednak zupełnie inny niż w przypadku VEGFR-1. Mechanizm indukcji ekspresji VEGFR-1 odbywa się z udziałem czynnika transkrypcyjnego HIF1α, który wiąże się z promotorem genu VEGFR-1 i indukuje jego transkrypcję. Ekspresja receptora VEGFR-2 indukowana niedotlenieniem jest natomiast efektem mechanizmów na poziomie potranskrypcyjnym, prawdopodobnie związanych z aktywacją innych białek indukowanych hipoksją [17].
Receptor VEGFR-2 ma zdolność oddziaływania nie tylko z VEGF-A, ale także z czynnikami limfangiogennymi VEGF-C i VEGF-D. Cytokiny VEGF-C i VEGF-D ulegają wysokiej ekspresji w wielu ludzkich nowotworach (czerniaku złośliwym, raku płuc, piersi, szyjki macicy, tarczycy, żołądka i odbytu), wpływając nie tylko na ich wzrost, ale również tworzenie przerzutów [18]. O udziale VEGF-D w procesie nowotworzenia świadczą badania przeprowadzone na myszach, u których zaobserwowano zahamowanie wzrostu guza i brak przerzutów po podaniu przeciwciał blokujących oddziaływanie VEGF-D z VEGFR-2 [19].
Niektóre doświadczenia wskazują na to, że dopamina, poprzez aktywację receptora dopaminowego D2, indukuje internalizację samego receptora VEGFR-2 i uniemożliwia w ten sposób wiązanie VEGF, co w efekcie hamuje sygnał proangiogenny [20]. Działanie dopaminy jest przy tym wysoce swoiste i ogranicza się wyłącznie do VEGFR-2. Blokowanie dopaminy, czy też receptora D2 może być wykorzystane w terapii antyangiogennej [20].
W regulacji procesu angiogenezy, jako koreceptor VEGFR-2, uczestniczy również neuropilina 1 (NP1), która jest receptorem dla dwóch różnych ligandów: semaforyny A klasy trzeciej (Sema3A) i VEGF₁₆₅ [21]. Koekspresja NP1 i VEGFR-2 powoduje 6-krotny wzrost oddziaływania VEGF₁₆₅ z VEGFR-2. Zahamowanie wiązania VEGF₁₆₅ z N1 powoduje spadek aktywności mitogennej i chemotaksji komórek, co sugeruje, że NP1, modulując wiązanie VEGF z VEGFR-2, uczestniczy w regulacji angiogenezy [22]. Embriony mysie pozbawione receptorów neuropilinowych ginęły in utero ok. 8.–9. dnia [23].
Nadekspresję VEGF i VEGFR-2 zaobserwowano w wielu typach nowotworów, m.in. w raku piersi, niedrobnokomórkowym raku płuc, wątroby, nerki, jelita grubego, pęcherza moczowego, tarczycy i jajnika [2]. Istotna rola VEGFR-2 w angiogenezie nowotworów sprawiła, że stał się on celem nowych rozwiązań terapeutycznych, które mogą być wykorzystane w leczeniu nowotworów.

Terapia antyangiogenna z wykorzystaniem VEGFR-2
Obecnie w terapii antyangiogennej wykorzystuje się m.in.:
a) blokowanie aktywności VEGFR-2 przeciwciałami anty-VEGFR-2, co ma zapobiegać wiązaniu VEGF do receptora [13],
b) fałszywe ligandy, które stanowią konkurencję dla VEGF w wiązaniu do receptora VEGFR-2 i nie indukują transdukcji sygnału mitogennego [24],
c) inhibitory kinaz tyrozynowych, które hamują przekaz sygnału proangiogennego na poziomie domeny cytozolowej VEGFR-2 [25],
d) oligonukleotydy blokujące ekspresję VEGFR-2: antysensy oraz rybozymy [17]. Rycina 3. przedstawia przykłady wymienionych zastosowań w terapii antyangiogennej z wykorzystaniem VEGFR-2. Oryginalnym rozwiązaniem terapeutycznym jest indukcja odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko naczyniom z receptorem VEGFR-2 [26].

Przeciwciała anty-VEGFR-2
W terapii antyangiogennej można zastosować przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko receptorom VEGFR-2. Przeciwciało anty-VEGFR-2, o symbolu DC-101, zostało uzyskane przez firmę ImClone Inc. Przeciwciało to w istotny sposób hamuje rozwój guzów pierwotnych, takich jak mysi rak płuca (Lewis lung), piersi (4T1), okrężnicy (CT-26) oraz czerniaka (B16), a także powstrzymuje rozwój przerzutów w raku płuc [27]. Skuteczność działania przeciwciała DC101 w kombinacji z chemioterapią badano również u myszy bezgrasiczych zaszczepionych ludzkimi guzami, m.in. glejakiem, rakiem płaskonabłonkowym, gruczolakorakiem kory nadnerczy, rakiem trzustki, u których zaobserwowano 75–92% zahamowanie wzrostu guzów [27].
W badaniach stosowano również przeciwciało o symbolu 2C3. Przeciwciało to selektywnie blokuje wiązanie VEGF z VEGFR-2 oraz aktywację tego receptora i nie wykazuje takiego działania w stosunku do VEGFR-1. Blokowanie aktywności VEGFR-2 powoduje zahamowanie wzrostu naczyń okołonowotworowych oraz spadek ich przepuszczalności oraz ogranicza wzrost ludzkich guzów wykształconych u myszy [28].

Peptydy hamujące aktywność VEGFR-2
W badaniach stosuje się również tzw. fałszywe ligandy – peptydy, które wiążą się z receptorem VEGFR-2, a nie indukują sygnału angiogennego. Jednym z takich peptydów jest peptyd o symbolu K237 i sekwencji aminokwasowej HTMYYHHQHHL [24]. Został on wyizolowany z biblioteki 12-aminokwasowych peptydów jako jeden z najbardziej efektywnych peptydów wykazujących powinowactwo do pozakomórkowej domeny receptora VEGFR-2. Peptyd K237 w 90% hamował podziały komórek HUVEC w badaniach in vitro oraz w 70% rozwój ludzkiego raka piersi u myszy zaszczepionych tym nowotworem [24]. Również 17-aminokwasowy peptyd (CBO-P11), nazywany cyclo-VEGI, konkuruje z VEGF o miejsce wiążące w domenie pozakomórkowej receptora VEGFR-2 [29]. Cyclo-VEGI blokuje także interakcję VEGF z receptorem VEGFR-1. Liniowy peptyd kontrolny takich właściwości nie posiada. Efekt blokowania receptora VEGFR-2 jest w tym przypadku ściśle uzależniony od struktury peptydu. Cyklo-VEGI konkuruje nie tylko z VEGF, ale także z FGF-2 (ang. fibroblast growth factor 2). Jego powinowactwo do receptora FGFR jest jednak dużo mniejsze niż do VEGFR-2. Badania in vivo potwierdziły właściwości cyklo-VEGI jako inhibitora angiogenezy. Peptyd ten hamuje rozwój zarówno mysiego glejaka (78% zahamowania wzrostu guza), jak i ludzkiego (70% zahamowania wzrostu) oraz istotnie wydłuża czas przeżycia myszy leczonych peptydem w porównaniu z grupą kontrolną [29].

Niskocząsteczkowe inhibitory kinaz tyrozynowych VEGFR-2
Od wielu lat prowadzone są również badania nad swoistym blokowaniem kinazy tyrozynowej receptora VEGFR-2. Reakcja autofosforylacji VEGFR-2 może zostać zahamowana przez swoiste inhibitory kinaz tyrozynowych, które blokują transdukcję sygnału mitogennego indukowanego przez VEGF.
Jednym z pierwszych syntetycznych inhibitorów kinaz tyrozynowych receptorów VEGF, o wysoce skutecznym działaniu, był związek o symbolu PTK787/ZK222584. Inhibitor ten posiada wysokie powinowactwo do ludzkiego VEGFR-2 i w niewielkim stopniu hamuje aktywność VEGFR-1 [30]. Tylko w bardzo wysokich dawkach, w porównaniu z dawkami dla VEGFR-2, PTK787/ZK222584 hamuje aktywność innych kinaz klasy III (m.in. PDGFR-β, c-Kit, c-Fms). Kinazy tyrozynowe innych klas (m.in. EGFR, c-Abl, c-Src, Cdc2, PKC-α) są niewrażliwe na działanie tego inhibitora. PTK787/ZK222584 nie tylko hamuje proliferację komórek, ale wpływa także na ich migrację. Działanie inhibitora PTK787/ZK222584 przetestowano na wielu doświadczalnych modelach guzów, m.in. raku naskórka, nowotworach okrężnicy, prostaty i tarczycy [30, 31]. Rozwój raka prostaty CWR-22 u myszy został skutecznie powstrzymany, nie zaobserwowano jednak całkowitej regresji nowotworu. Obecnie PTK787/ZK222584 znajduje się w III fazie badań klinicznych, gdzie stosowany jest zarówno w celu wzmocnienia efektu działania klasycznej chemioterapii, jak i w monoterapii u pacjentów z rakiem okrężnicy [31].
Inhibitorem, który równie dobrze hamuje aktywność receptora VEGFR-2 jest lek o symbolu SU5416. Jest on równie swoisty, jak PTK/ZK. Nie hamuje aktywności kinaz serynowo-treoninowych oraz wielu innych kinaz tyrozynowych (m.in. c-Src, receptora FGF, Met i Abl) i tylko w niewielkim stopniu hamuje aktywność receptora PDGF (ang. platelet derived growth factor) [32]. SU5416 znacznie obniża liczbę nowych naczyń i ich gęstość w obrębie guza. Lek ten hamuje rozwój guzów, m.in. czerniaka, raka piersi, prostaty, płuc, naskórka, włókniakomięsaka i glejaka oraz tworzenie przerzutów [32, 33].

Oligonukleotydy hamujące ekspresję genu VEGFR-2
W terapii antyangiogennej próbowano również wykorzystać oligonukleotydy hamujące ekspresję kluczowych genów biorących udział w angiogenezie. Wykorzystano do tego celu dwa rodzaje oligonukleotydów: oligonukleotydy antysensowne oraz rybozymy. Antysensy to oligonukleotydy o długości ok. 20–30 nukleotydów (zarówno rybo-, jak i deoksynukleotydy), których sekwencja jest komplementarna do mRNA lub sekwencji kodujących gen (często są to sekwencje jego promotora). Hybrydyzując z mRNA oligonukleotydy blokują dostęp do rybosomów [34], zaburzają składanie pre-mRNA [35], lub inicjują jego degradację [36].
Antysensowne oligonukleotydy po przyłączeniu do docelowego mRNA tworzą dwupasmowy hybryd aktywujący enzym RNazę H degradujący mRNA w tym dupleksie. Odmianą oligonukleotydów antysensownych są małe cząsteczki RNA o długości ok. 20–25 nukleotydów, nazywane siRNA (ang. small interfering RNA). Po wniknięciu do komórki jedna z nici siRNA aktywuje rybonukleinoproteinowy kompleks zwany RISC, który rozpoznaje komplementarną sekwencję w obrębie docelowego mRNA. W wyniku endonukleolitycznej degradacji (fragmentacji) mRNA przez kompleks RISC translacja mRNA zostaje zablokowana [37].
Do hamowania ekspresji genów wykorzystuje się również oligonukleotydy zwane rybozymami. Są to katalityczne cząsteczki RNA, zdolne do specyficznego rozpoznawania i fragmentacji docelowego mRNA. Rybozym po rozpoznaniu sekwencji komplementarnej docelowego mRNA przyjmuje aktywną konformację i hydrolizuje wiązanie fosfodiestrowe w nici mRNA powodując jego fragmentację. Do hamowania ekspresji genów w komórkach ssaków wykorzystuje się najczęściej rybozymy niskocząsteczkowe typu głowa młotka (ang. hammerhead) oraz typu spinka (ang. harpin), co wynika z ich niewielkich rozmiarów (do 30 nukleotydów). Stosuje się także rybozymy wielkocząsteczkowe m.in. rybonukleazę P (RNazaP) – właściwym rybozymem jest w tym przypadku cząsteczka RNA M1, związana z podjednostką białkową C5 [38].
Oligonukleotydy antysensowne, siRNA i rybozymy znalazły zastosowanie w wyciszaniu ekspresji genu receptora VEGFR-2 w terapii antyangiogennej nowotworów. U myszy leczonych antysensownymi oligonukleotydami, skierowanymi przeciwko mRNA VEGFR-1 oraz VEGFR-2, zaobserwowano zahamowanie rozwoju unaczynienia [39]. Podobne wyniki zaobserwowano również u myszy bezgrasiczych zaszczepionych ludzkim rakiem żołądka, u których zastosowanie antysensownych oligonukleotydów skierowanych przeciwko VEGFR-2 znacznie zmniejszyło liczbę naczyń krwionośnych w guzie i ograniczyło jego wzrost [40].
Zastosowanie rybozymów typu głowa młotka skierowanych przeciwko mRNA VEGFR-1 i VEGFR-2 zahamowało proliferację ludzkich komórek śródbłonkowych HMVEC (ang. human dermal microvascular endothelial cell) [41]. Terapia z użyciem rybozymów przeciwko obu receptorom VEGFR znacznie ograniczyła powstawanie unaczynienia, zahamowała rozwój guza oraz zredukowała liczbę tworzonych przerzutów [41, 42]. Cząsteczki siRNA z powodzeniem wykorzystano do wyciszania ekspresji receptora VEGFR-2. Zaobserwowano zahamowanie angiogenezy oraz ograniczenie rozwoju guza neuroblastomy (nowotworu pnia współczulnego) [43, 44].

Indukcja odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko naczyniom z receptorem VEGFR-2
To oryginalne rozwiązanie terapeutyczne polega na swoistym niszczeniu naczyń okołonowotworowych przez limfocyty CD8+. Wykorzystuje się tu gen kodujący VEGFR-2 jako swoisty antygen, który dostarczany jest do organizmu biorcy w formie doustnej szczepionki bakteryjnej. Szczepionkę tworzą atenuowane bakterie Salmonella typhimurium transformowane ekspresyjnym plazmidem niosącym gen VEGFR-2. W organizmie biorcy, w makrofagach i komórkach dendrytycznych, dochodzi do ekspresji genu, a następnie indukcji odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko naczyniom okołonowotworowym posiadającym receptor VEGFR-2 (ryc. 4.) [26].
Na podstawie niektórych badań można było prześledzić rozwój bakterii z eukariotycznymi, ekspresyjnymi plazmidami w organizmie myszy [45]. Podane doustnie atenuowane bakterie S. typhimurium (AroA–) są gromadzone w jelicie cienkim, skąd są wychwytywane i gromadzone przez makrofagi oraz komórki dendrytyczne [46, 47]. W czasie wędrówki komórek do śledziony bakterie uwalniają plazmidowy DNA. Geny kodujące białka naczyniowe ulegają ekspresji, a pojawiające się białka podlegają ubikwitynizacji i proteolitycznej degradacji w proteosomach. Powstające w wyniku takiej obróbki peptydy są następnie prezentowane z udziałem cząsteczek MHC klasy I i biorą udział w aktywacji limfocytów T cytotoksycznych (CD8⁺) [47].
W prezentacji antygenów bakteryjnych ważną rolę odgrywają także cząsteczki klasy II. Limfocyty T pomocnicze (CD4⁺), które rozpoznają antygeny prezentowane przez te cząsteczki uczestniczą we wspomaganiu odpowiedzi komórkowej oraz humoralnej. Limfocyty pomocnicze, głównie poprzez wydzielane cytokiny, m.in. IFN-γ, mogą również pośrednio hamować powstawanie nowych naczyń w obrębie guza. Przeprowadzone doświadczenia wskazują na istnienie obu typów odpowiedzi, w wyniku których dochodzi do aktywacji zarówno limfocytów CD8⁺, jak i CD4⁺. Zastosowanie takiej doustnej szczepionki znosi obwodową tolerancję limfocytów T dla receptora VEGFR-2, w wyniku czego dochodzi do eliminacji proliferujących komórek śródbłonkowych naczyń. W badaniach przedklinicznych na modelach mysich nowotworów czerniaka, okrężnicy i niedrobnokomórkowego raka płuc wykazano zahamowanie rozwój guzów [26].

Terapia przeciwnaczyniowa
z wykorzystaniem receptora VEGFR-2 Receptor VEGFR-2 występuje u 30–70% komórek śródbłonkowych naczyń okołonowotworowych, a w komórkach naczyń prawidłowych – poniżej 5% [48]. Stwarza to duże możliwości celowego wprowadzania za pośrednictwem VEGFR2 tzw. leków dwudomenowych (związanych z VEGF toksyn czy innych ligandów niszczących komórki śródbłonkowe) [12] (ryc. 5.). Leki te, po związaniu z receptorem, muszą zostać internalizowane wraz z receptorem przez komórki docelowe. Tylko wtedy skoniugowana z ligandem toksyna może dostać się do wnętrza komórki [12]. Niszczenie naczyń okołonowotworowych przez toksyczne leki ma pociągać za sobą niedotlenowanie komórek nowotworowych i w konsekwencji ich śmierć nekrotyczną.
Dwudomenowe leki przeciwnaczyniowe mają charakterystyczną budowę. Jedna z domen, tzw. kognitywna, swoiście rozpoznaje komórki docelowe, np. receptory czynnika wzrostowego VEGF czy receptory integryn α_vβ₃. Druga, tzw. efektorowa, to najczęściej fragment toksyny, która indukuje w komórkach docelowych apoptozę [12]. Do chwili obecnej, w badaniach przedklinicznych, wykazano już przeciwnaczyniowe właściwości kilku leków, w których domeną kognitywną jest VEGF₁₂₁ rozpoznający receptor VEGFR-2, a jako domen efektorowych użyto m.in. toksyny dyfterytu [49, 50], geloniny [51] i granzymu B [52]. Jednym z pierwszych skonstruowanych dwudomenowych leków był koniugat toksyny dyfterytu z VEGF₁₆₅. Ramakrishnan i wsp. [49] wykazali, że taki dwudomenowy lek specyficznie rozpoznaje VEGFR-2 i zostaje internalizowany do wnętrza komórki. W badaniach in vitro oba białka fuzyjne VEGF₁₆₅/DT (toksyna dyflerytu) i VEGF_121-DT są wysoce toksyczne zarówno dla proliferujących komórek śródbłonkowych, jak i dla komórek nowotworowych mięsaka Kaposiego KS, a terapia z wykorzystaniem VEGF₁₂₁/DT prowadzona na myszach z mięsakiem Kaposiego powstrzymała rozwój guza [50]. Veenendaal i wsp. [51] skonstruowali białko fuzyjne złożone z VEGF₁₂₁ i toksyny roślinnej: geloniny. Gelonina jest zasadową glikoproteiną o właściwościach enzymatycznych, katalizującą hydrolizę wiązania N-glikozydowego specyficznie przy jednej adenozynie w 28S rRNA, co powoduje inaktywację rybosomów w komórce i w rezultacie śmierć komórki. Uszkodzenie naczyń okołonowotworowych u myszy z ludzkim rakiem prostaty (PC-3) obserwowano już po 48 godz. od momentu podania VEGF121/rGel, przy czym nie zaobserwowano zmian morfologicznych w innych narządach myszy. Badania przedkliniczne z użyciem konstruktu VEGF121/rGel wykazały zahamowanie wzrostu guzów raka prostaty i czerniaka [51]. Elementem efektorowym zastosowanym w konstruktach dwudomenowych leków przeciwnaczyniowych z VEGF121 jest także granzym B (GrB), proteaza serynowa typu B, biorąca udział w aktywacji szeregu kaspaz biorących udział w apoptozie [52]. Białko fuzyjne VEGF121/GrB indukuje apoptozę w komórkach z receptorem VEGFR-2 powodując uwalnianie cytochromu c z mitochondrium do cytoplazmy, aktywację kaspazy-3 i -8 oraz fragmentację białka syntazy poli-ADP-rybozy (PARP) (ang. poly ADP-ribose polymerase) naprawiającego uszkodzenia DNA [52].

Podsumowanie
Receptor VEGFR-2 jest obiecującym celem terapii, gdyż hamowanie jego aktywności wykazało istotny efekt przeciwnowotworowy w badaniach in vivo. VEGFR-2 może być dobrym celem terapii antyangiogennej z kilku powodów:
a) VEGFR-2 występuje u 30–70% komórek śródbłonkowych naczyń okołonowotworowych, a tylko w niewielkim procencie (<5%) w komórkach śródbłonkowych naczyń prawidłowych;
b) inaktywacja receptora VEGFR-2 powoduje indukcję apoptozy w komórkach śródbłonkowych, co hamuje angiogenezę i pośrednio wzrost guza;
c) leki przeciwnaczyniowe z domeną VEGF są swoiście internalizowane przez komórki śródbłonkowe posiadające receptor VEGFR-2;
d) badania doświadczalne i kliniczne wskazują, że kombinacja czynników anty-VEGFR-2 z chemioterapeutykami daje wyraźny efekt terapeutyczny (zahamowanie wzrostu guzów nowotworowych).

Duże nadzieje pokłada się obecnie w terapii kombinowanej, w której kojarzy się leki antyangiogenne i przeciwnaczyniowe z chemioterapeutykami bądź napromienieniem. Doniesienia ostatnich lat wskazują, że kombinacje poszczególnych metod terapeutycznych o różnych mechanizmach działania są bardziej skuteczne niż jakiekolwiek inne sposoby leczenia [53–56].

Piśmiennictwo
1. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med 1971; 285: 1182-6.
2. Ferrara N. Vascular Endothelial Growth Factor as a Target for Anticancer Therapy. The Oncologist 2004; 9: 2-10.
3. Ferrara N. Vascular Endothelial Growth Factor: Basic Science and Clinical Progres. Endocr Rev 2004; 25: 581-611.
4. Conway EM, Collen D, Carmeliet P. Molecular mechanisms of blood vessel growth. Cardiovasc Res 2001; 49: 507-21.
5. Risau W. Mechanisms of angiogenesis. Nature 1997; 386: 671-4.
6. Scappaticci FA. Mechanisms and future directions for angiogenesis-based cancer therapies. J Clin Oncol 2002; 20: 3906-27.
7. Hendrix MJ, Seftor EA, Hess AR, Seftor REB. Vasculogenic mimicry and tumor-cell plasticity: lessons from melanoma. Cancer 2003; 3: 411-21.
8. Carmeliet P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med 2003; 6: 653-60.
9. Jain RK. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med 2003; 9: 685-93.
10. Garcia-Barros M, Paris F, Cordon-Cardo C, Lyden D, Rafii S, Haimovitz-Friedman A, Fuks Z, Kolesnick R. Tumor response to radiotherapy regulated by endothelial cell apoptosis. Science 2003; 300: 1155-9.
11. Neri D, Bicknell R. Tumor vascular targeting. Nature Rev Cancer 2005; 5: 436-46.
12. Szala S. Two-domain vascular disruptive agents in cancer therapy. Curr Cancer Drug Targets 2004; 4: 501-9.
13. Hoeben A, Landuyt B, Highley MS, Wildiers H, Van Oosterom A, De Bruijn EA. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev 2004; 56: 549-80.
14. Shibuya M, Claesson-Welsh L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res 2006; 312: 549-60.
15. Fong GH, Rossant J, Gertsenstein M, Breitman ML. Role of the Flt-1 receptor tyrosine kinase in regulating the assembly of vascular endothelium. Nature 1995; 376: 65-9.
16. Chen H, Ikeda U, Shirnpo M, Maeda Y, Shibuya M, Ozawa K, Shimada K. Inhibition of vascular endothelial growth factor activity by transfection with the soluble flt-1 gene. J Cardiovasc Pharmacol 2000; 36: 496-502.
17. Jośko J, Knefel K. The role of vascular endothelial growth factor in cerebral oedema formation. Folia Neuropathol 2003; 43: 161-6.
18. Jain RK, Fenton BT. Intratumoral lymphatic vessels: a case of mistaken identity or malfunction? J Natl Cancer Inst 2002; 94: 417-21.
19. Stacker SA, Caesar C, Baldwin ME, et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med 2001; 7: 186-91.
20. Basu SB, Nagy JA, Pal S, et al. The neurotransmitter dopamine inhibits angiogenesis induced by vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor. Nat Med 2001; 7: 569-74.
21. Oh H, Takagi H, Otani A, Koyama S, Kemmochi S, Ukemura A, Honda Y. Selective induction of neuropilin-1 by vascular endothelial growth factor (VEGF): a mechanism contributing to VEGF-induced angiogenesis. PNAS 2002; 99: 383-8.
22. Soker S, Takashima S, Miao HQ, Neufeld G, Klagsburn M. Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor. Cell 1998; 92: 735-45.
23. Takashima S, Kitakaze M, Asakura M, Asanuma H, Sanada S, Tashiro F, Niwa H, Miyazaki JiJ i wsp. Targeting of both mouse neuropilin-1 and neuropilin-2 genes severely impairs developmental yolk sac and embryonic angiogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 3657-62.
24. Hetian L, Ping A, Shumei S, et al. A novel peptide isolated from a phage display library inhibits tumor growth and metastasis by blocking the binding of vascular endothelial growth factor to its kinase domain receptor. J Biol Chem 2002; 277: 43137-42.
25. McMahon G. VEGF receptor signaling in tumor angiogenesis. Oncologist 200; 5: 3-10.
26. Niethammer AG, Xiang R, Becker JC, Wodrich H, Peri U, Karsten G, Eliceiri BP, Reisfeld RA. A DNA vaccine against VEGF receptor 2 prevents effective angiogenesis and inhibits tumor growth. Nat Med 2002; 8: 1369-75.
27. Prewett M, Huber J, Li Y, et al. Antivascular endothelial growth factor receptor (fetal liver kinase1) monoclonal antibody inhibits tumor angiogenesis and growth of several mouse and human tumors. Cancer Res 1999; 59: 5209-18.
28. Brekken RA, Overholser JP, Stastny VA, Waltenberger J, Minna JD, Thorpe PE. Selective inhibition of vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor 2 (KDR/Flk-1) activity by a monoclonal anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice. Cancer Res 2000; 60: 5117-24.
29. Zilberberg L, Shinkaruk S, Lequin O, Rousseau B, Hagedorn M, Costa F, Caronzolo D, Balke M i wsp. Structure and inhibitory effects on angiogenesis and tumor development of a new vascular endothelial growth inhibitor. J Biol Chem 2003; 278: 35564-73.
30. Wood JM, Bold G, Buchdunger E, et al. PTK787/ZK 222584, a novel and potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, impairs vascular endothelial growth factor-induced responses and tumor growth after oral administration. Cancer Res 2000; 60: 2178-89.
31. Schoenberger J, Grimm D, Kossmehl P, Infanger M, Hurth E, Eilles C. Effects of PTK787/ZK222584, a tyrosine kinase inhibitor, on the growth of a poorly differentiated thyroid carcinoma: an animal study. Endocrinology 2006; 145: 1031-1038.
32. Fong TAT, Shawver LK, Sun L, et al. SU5416 is a potent and selective inhibitor of the vascular endothelial growth factor receptor (Flk-1/KDR) that inhibits tyrosine kinase catalysis, tumor vascularization, and growth of multiple tumor types. Cancer Res 1999; 59: 99-106.
33. Shaheen RM, Davis DW, Liu W, et al. Antiangiogenic therapy targeting the tyrosine kinase receptor for vascular endothelial growth factor receptor inhibits the growth of colon cancer liver metastasis and induces tumor and endothelial cell apoptosis. Cancer Res 1999; 59: 5412-16.
34. Baker BF, Lot SS, Condon TP, Cheng-Flournoy S, Lesnik EA, Sasmor HM, Bennet CF. 2”-O-(2-Methoxy) ethyl-modified anti-intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) oligonucleotides selectively increase the ICAM-1 mRNA level and inhibit formation of the ICAM-1 translation initiation complex in human umbilical vein endothelial cells. J Biol Chem 1997; 272: 11994-2000.
35. Mercatante DR, Sazani P, Kole R. Modification of alternative splicing by antisense oligonucleotides as a potential chemotherapy for cancer and other diseases. Curr Cancer Drug Targets 2001; 1: 211-30.
36. Vickers TA, Koo S, Bennett CF, Crooke ST, Dean NM, Baker BF. Efficient reduction of target RNAs by small interfering RNA and RNase H-dependent antisense agents. J Biol Chem 2003; 278: 7108-18.
37. Tuschl T, Borkhardt A. Small interfering RNAs: a revolutionary tool for the analysis of gene function and gene therapy. Mol Interv 2002; 2: 158-67.
38. Cobaleda C, Sanchez-Garcia I. RNase P: from biological function to biotechnological applications. Trends Biotechnol 2001; 19: 406-11.
39. Marchand GS, Noiseux N, Tanguay JF, Sirois MG. Blocade of in vivo VEGF-mediated angiogenesis by antisense gene therapy: role of Flk-1 and Flt-1 receptors. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2002; 282: 194-204.
40. Kamiyama M, Ichikawa Y, Ishikawa T, et al. VEGF receptor antisense therapy inhibits angiogenesis and peritoneal dissemination of human gastric cancer in nude mice. Cancer Gene Ther 2002; 9: 197-201.
41. Parry TJ, Cushman C, Gallegos AM, et al. Bioactivity of anti-angiogenic ribozymes targeting Flt-1 and KDR mRNA. Nucleic Acid Res 1999; 27: 2569-77.
42. Pavco PA, Bouhana KS, Gallegos AM, et al. Antitumor and antimetastatic activity of ribozymes targeting the messenger RNA of vascular endothelial growth factor receptors. Clin Cancer Res 2000; 6: 2094-103.
43. Kim B, Tang Q, Biswas P, et al. Inhibition of ocular angiogenesis by siRNA targeting vascular endothelial growth factor pathway genes: therapeutic strategy for herpetic stromal keratitis. Am J Pathol 2004; 165: 2177-85.
44. Schiffelers RM, Ansari A, Xu J, et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res 2004; 32: e149.
45. Reisfeld RA, Niethammer AG, Luo Y, Xiang R. DNA vaccines suppress tumor growth and metastases by the induction of anti-angiogenesis. Immunol Rev 2004; 199: 181-90.
46. Luo Y, Zhou H, Mizutani M, Mizutani N, Reisfeld RA. Transcription factor Fos-related antigen 1 is an effective target for a breast cancer vaccine. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 8850-5.
47. Darji A, Guzman CA, Gerstel B, Wachholz P, Timmis KN, Wehland J, Chakraborty T, Weiss S. Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium. Cell 1997; 91: 765-75.
48. Sivridis E, Giatromanolaki A, Koukourakis MI. The vascular network of tumors – what is it not for? J Pathol 2003; 201: 173-80.
49. Ramakrishnan S, Olson TA, Bautch VL, Mohanraj D. Vascular endothelial growth factor-toxin conjugate specifically inhibits KDR/flk-1-positive endothelial cell proliferation in vitro and angiogenesis in vivo. Cancer Res 1996; 56: 1324-30.
50. Wild R, Dhanabal M, Olson TA, Ramakrishnan S. Inhibition of angiogenesis and tumor growth by VEGF121-toxin conjugate: differential effect on proliferating cells. Brit J Cancer 2000; 83: 1077-83.
51. Veenendaal LM, Jin H, Ran S, et al. In vitro and in vivo studies of a VEGF121/rGelonin chimeric fusion toxin targeting the neovasculature of solid tumors. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 7866-71.
52. Liu Y, Cheung LH, Thorpe P, Rosenblum MG. Mechanistic studies of novel, human fusion toxin composed of vascular endothelial growth factor (VEGF)121 and the serine protease granzyme B: Directed apoptotic events in vascular endothelial cells. Mol Cancer Ther 2003; 2: 949-59.
53. Zhang L, Hannay JA, Liu J, et al. Vascular endothelial growth factor overexpression by soft tissue sarcoma cells: implications for tumor growth, metastasis, and chemoresistance. Cancer Res 2006; 66: 8770-8.
54. Abdollahi A, Lipson KE, Sckell A, et al. Combined therapy with direct and indirect angiogenesis inhibition results in enhanced antiangiogenic and antitumor effects. Cancer Res 2003; 63: 8890-8.
55. Strieth S, Eichhorn ME, Sutter A, Jonczyk A, Berghaus A, Dellian M. Antiangiogenic combination tumor therapy blocking alpha (v)-integrins and VEGF-receptor-2 increased therapeutic effects in vivo. Int J Cancer 2006; 119: 423-31.
56. Feng KK, Zhao HY, Qiu H, Liu JX, Chen J. Combined therapy with flk1-based DNA vaccine and interleukin-12 results in enhanced antiangiogenic and antitumor effects. Cancer Lett 2005; 221: 41-7.

Adres do korespondencji
prof. dr hab. Stanisław Szala Zakład Biologii Molekularnej Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie Oddział w Gliwicach Wybrzeże Armii Krajowej 15 44-101 Gliwice tel. +48 32 278 98 79 faks +48 32 231 35 12 e-mail: sszala@io.gliwice.pl