The role of flow cytometry in clinical diagnosis

WSTĘP

Cytometria przepływowa rozwija się od 25 lat. Służyła najpierw jako metoda liczenia komórek, określania ich rozmiarów, aż osiągnęła dzisiejszy poziom wysoce specjalistycznego narzędzia do wieloparametrowej analizy biochemiczych i biofizycznych właściwości komórek i ich składowych. Cytometria przepływowa pozwala określić morfologię i funkcje niektórych komórek, umożliwia ilościową i jakościową analizę antygenów różnicowania na dowolnej liczbie komórek nawet bardzo heterogennej populacji. Cytometria przepływowa stanowi obiektywną i powtarzalną metodę ustalania rozpoznania i monitorowania przebiegu terapii w różnych schorzeniach głownie hematologicznych [21]. Cytometria przepływowa pozwala jakościowo i ilościowo ocenić stan układu immunologicznego i dostarcza szeregu danych, które pozwalają szerzej spojrzeć na mechanizmy aktywacji i funkcje komórek układu odpornościowego. Prowadzi to do lepszego poznania zarówno ich znaczenia w patogenezie wielu chorób o podłożu zapalnym, jak i nieinfekcyjnym, a także roli w regulacji odpowiedzi immunologicznej ustroju. Cytometria przepływowa pomaga obiektywnie opisać wiele procesów dzięki analizie wielkości i populacji komórek.



CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA - UWAGI OGÓLNE


Podstawowym pomiarem w cytometrze przepływowym jest rejestrowanie światła rozproszonego na komórce oraz światła wysyłanego przez wzbudzony fluorochrom. Dwa detektory mierzą światło rozproszone. Pierwszy rejestruje rozproszenie od przodu zgodnie z kierunkiem wiązki laserowej pod niewielkim kątem poniżej 100 (FS - Forward Scatter). Drugi detektor rejestruje rozproszenie pod kątem 900 (SS - Side Scatter). FS - rozdziela komórki pod względem wielkości, a SS - rozdziela komórki ze względu na ich kształt i wewnętrzną ziarnistość.

Dodatkowo można otrzymać parametry wyliczane z kształtu impulsów fluorescencji (szerokość sygnału, jego powierzchnia), dzięki czemu można odróżnić komórki z 4N chromosomów od dwóch zlepionych 2N (tzw. dyskryminacja dubletów).



W zależności od aparatu mogą być różne ilości detektorów fluorescencji. Minimum powinny być 2 detektory, ale najczęściej przy jednowiązkowym systemie wzbudzania używa się trzech detektorów FL1, FL2, FL3. Kiedy dostępna jest jeszcze jedna wiązka laserowa mogą być użyte jeszcze detektory dla FL 4 i FL 5.

Integralną i niezbędną częścią każdego aparatu jest system komputerowy wraz z oprogramowaniem. Każda firma ma własny zestaw programów do zbierania i analizy danych.



Do analizy i obrazowania danych stosuje się kilka typów wykresów: jednowymiarowe (histogram), dwuwymiarowe (kropkowy, gęstości, konturowy), wykresy trójwymiarowe (perspektywiczny).

Podczas analizy możliwe jest bramkowanie, ilościowa ocena komórek w każdym regionie, wyliczanie podstawowych wielkości statystycznych itd.
Analizy ekspresji determinant w poszczególnych kombinacjach przeciwciał stosowanych do barwienia komórek dokonuje się najczęściej poprzez analizę kwadrantową (rozkład punktowy, którego osie wykazują intensywność fluorescencji). Można wykonywać ocenę fenotypową: krwi obwodowej, szpiku, węzłów chłonnych, płynu mózgowo-rdzeniowego czy popłuczyn pęcherzykowo-oskrzelikowych.

Analiza fenotypowa może być wykonana tylko w zawiesinie żywych komórek (antykoagulanty) bez zamrażania i środków konserwujących. Ocena dowolnej liczby antygenów w danej populacji ograniczona jest liczbą dostępnych kolorów fluorescencji wykrywanych przez detektory cytometru. W większości stosowanych aparatów można analizować od 2 do 4 kolorów znacznikowych. Nie jest możliwe badanie fragmentów tkankowych i materiału archiwalnego. Materiał musi być świeży i analizowany niezwłocznie po pobraniu jednocześnie na wszystkie znaczniki fluorescencyjne.



Analiza cytometryczna obejmuje:

- opis populacji komórkowych występujących w badanej zawiesinie na podstawie jej właściwości fizycznych (wielkość i ziarnistość),
w określenie proporcji pomiędzy badanymi populacjami komórek z podaniem odsetka subpopulacji,

- ocenę bezwzględnej liczby komórek wybranych subpopulacji (np. u osób zakażonych HIV - CD4/CD8),

- określenie odsetka komórek wykazujących ekspresję powierzchniową lub cytoplazmatyczną badanej determinanty lub kombinacji determinant,

- określenie intensywności fluorescencji, co odpowiada poziomowi ekspresji determinanty.



Cytometrię przepływową wykorzystuje się do badania pojedynczych komórek, jąder komórkowych lub chromosomów przy zastosowaniu metod barwienia, powodujących zachowanie żywotności komórek i integralności błony komórkowej.



Obecność komórek rozrostowych (białaczkowych lub chłoniakowych) stwierdza się na podstawie obecności jednej, przeważającej populacji o nietypowej charakterystyce fizycznej, zaniku populacji komórek występujących w prawidłowym szpiku, węźle, krwi obwodowej. Pojawienie się w szpiku nadmiernej liczby komórek o identycznym fenotypie, często charakterystycznym dla komórek młodych lub z ekspresją nietypowych antygenów jest cechą charakterystyczną komórek rozrostowych. Ekspresję powierzchniową lub cytoplazmatyczną stwierdza się na podstawie porównania intensywności fluorescencji badanej próbki z intensywnością fluorescencji w próbce zawierającej kontrolę izotypową.

Przyjęto, że komórki badane wykazują ekspresję analizowanej determinanty, jeżeli odsetek komórek wykazujących fluorescencję jest wyższy niż kontrola izotypowa i wynosi nie mniej niż 20 proc. [1, 2].

Kontrola izotypowa polega na barwieniu dodatkowej próbki zawierającej komórki zawiesiną fragmentów mysiej immunoglobuliny znakowanej fluorochromem odpowiadającym fluorochromowi przeciwciała monoklonalnego (FITC, RPE, ACP, PerCP, RPE-Cy-5). Powinna być tak dobrana, by klasa mysiej IgG odpowiadała podklasie IgG przeciwciała monoklonalnego. Ilość białka mysiego powinna być taka sama, jak w próbce barwionej przeciwciałem monoklonalnym. Zastosowanie kontroli izotypowej dotyczy każdego kolejnego fluorochromu, jakim wyznakowane są przeciwciała monoklonalne.
W przypadku badania populacji o słabej intensywności prawidłowo dobrana kontrola izotypowa jest krytyczna i umożliwia przeprowadzenie poprawnej analizy.



Cytometria przepływowa pozwala rozpoznawać i monitorować niektóre choroby:

- choroby rozrostowe układu krwiotwórczego, a zwłaszcza białaczki i chłoniaki [3, 4],

- wrodzone i nabyte niedobory immunologiczne [5],

- choroby nowotworowe,

- choroby płuc,

- choroby autoimmunizacyjne,

- przeszczepy narządów [6].



Przy pomocy cytomerii przepływowej można również:

- badać oporność wielolekową [7, 8],

- analizować DNA [9, 10],

- badać apoptozę (programową śmierć komórek) [11-14].



Zestaw przeciwciał monoklonalnych do analizy powinien być tak dobrany, aby pozwalał na ocenę ekspresji powierzchniowych determinant charakterystycznych dla:

- komórek macierzystych,

- prekursorów i różnicujących się limfocytów T,

- dojrzałych limfocytów T,

- prekursorów i różnicujących się limfocytów B,

- dojrzałych limfocytów B,

- prekursorów i różnicujących się komórek linii mieloidalnej,

- komórek linii megakariocytarnej w szpiku prawidłowym,

- populacji komórek blastycznych w szpiku patologicznym i krwi obwodowej zawierającej takie komórki.



Zestawy przeciwciał do rutynowej oceny fenotypu zostały opracowane tak, by przy niewielkiej liczbie przeciwciał uzyskać możliwie precyzyjny opis fenotypu. Mając do dyspozycji przeciwciała znakowane, np. FITC i PE dobiera się je parami, by uzyskać dodatkową informację o równoczesnym występowaniu lub braku równoczesnej ekspresji badanych determinant na powierzchni komórki. Cytometria przepływowa umożliwia stosowanie w jednej próbce kombinacji przeciwciał o różnej swoistości i znakowanych różnymi fluorochromami, pozwalając na uzyskanie informacji o koekspresji antygenów nietypowych dla linii, z której pochodzą komórki nowotworowe [21]. W zależności od jakości cytometru można badać koekspresję nawet czterech antygenów, co nie jest możliwe w żadnej innej metodzie diagnostycznej. Kliniczne znaczenie koekspresji nie jest jednoznaczne. Koekspresja determinant limfoidalnych na komórkach białaczki mieloidalnej poprawia lekowrażliwość, a w konsekwencji rokowanie [15]. W białaczkach ostrych pochodzenia limfoidalnego koekspresja determinant mieloidalnych jest uważana przez większość ośrodków za czynnik o złym znaczeniu rokowniczym [8, 16]. Stosując szerszy panel przeciwciał monoklonalnych, rozbudowany o ocenę ekspresji białek, takich jak regulatory apoptozy (np. CD95 i bcl-2, aneksyna i kaspazy) oraz decydujących o wrażliwości komórki nowotworowej na zastosowane leczenie (glikoproteina P nazywana również antygenem oporności wielolekowej) można wynik badania wzbogacić o dodatkowe informacje, mające znaczenie rokownicze [17]. Dodatkową korzyścią oceny cytometrycznej jest możliwość oznaczenia ploidii w komórkach o określonym fenotypie. Badanie to jest szczególnie przydatne w przypadku, gdy w analizowanym szpiku znajdują się jeszcze komórki prawidłowe. Skojarzone oznaczenie ploidii DNA w komórkach noszących charakterystyczne dla poszczególnych linii błonowe markery umożliwia wykrycie populacji komórek rozrostowych, jeśli mają one zmienioną ilość DNA. Ocena DNA może przyczynić się do wczesnego wykrycia choroby, a obecność aneuploidii DNA może wskazywać na zwiększone ryzyko czynnego procesu nowotworowego [18]. Wartości DNA mogą być również przydatne w rokowaniu i wyborze terapii, a we wczesnym okresie choroby pozwalają wyróżnić grupę nowotworów, które wymagają bardziej agresywnego leczenia.



CHOROBY ROZROSTOWE UKŁADU KRWIOTWÓRCZEGO



Podstawowymi cechami fenotypowymi, wyróżniającymi nowotwory są:

- pojawienie się antygenów wcześniejszych etapów dojrzewania,

- brak antygenów, które powinny być obecne na komórkach dojrzałych,

- pojawienie się antygenów z innych linii różnicowania, np. antygenów linii mieloidalnej na komórkach linii limfoidalnej,

- zmniejszenie ekspresji antygenów lub bardzo silna ekspresja innych antygenów oraz koekspresja antygenów,

- określenie klonalności rozplemu na podstawie rozkładu łańcuchów kappa i lambda w odniesieniu do komórek B,

- obecność antygenów powierzchniowych i cytoplazmatycznych niejednokrotnie pozwalających określić etap różnicowania populacji komórkowych.


Zestaw przeciwciał do diagnostyki białaczek u dorosłych zaproponowany przez PALG (Polish Acute Leukemia Group):

- TdT, CD34, HLA-DR (dodatkowo CD38, CD71) - niezróżnicowanokomórkowe,

- CD13, CD33, CD65, CD117 oraz MPO - białaczki szpikowe (mieloidalne),

- CD19, CD10 oraz cyt. CD22, cyt. CD79a - limfoblastyczne z linii limfocytu B,
w CD2, CD7 oraz cyt. CD3 - limfoblastyczne z linii limfocytu T.



W przypadku niejednoznacznych wyników należy wykorzystać przeciwciała proponowane jako barwienia uzupełniające:

- CD14, CD15, CD41 i/lub CD61, glikoforyna A - białaczki szpikowe (mieloidalne),

- CD20, CD23, CD24, łańcuchy lekkie kappa i lambda, cyt IgM - białaczki z linii limfocytu B,

- CD1a, CD3, CD4, Cd5, CD8, TCRa/b, TCRγ/δ - białaczki linii limfocytu T,

- CD16 - chłoniaki olbrzymiokomórkowe.



Zasadnicze znaczenie dla wczesnej diagnostyki fenotypowej ma ocena odsetka lub wartości bezwzględnych limfocytów T (CD3) oraz ich subpopulacji CD4, CD8, a także limfocytów B (CD19, CD20) i komórek NK (CD16+56+). W pierwszym histogramie muszą być widoczne wszystkie typy komórek.



Coraz szerszy panel otrzymywanych na skalę komercyjną przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko błonom i cytoplazmatycznym białkom umożliwia w wielu przypadkach precyzyjne rozpoznanie. Zbierane z dużej liczby ośrodków informacje o rozpoznawanych fenotypach komórek rozrostowych i przebiegu choroby (zastosowanie terapii, czas uzyskania remisji choroby i przeżycia) były i są ciągle opracowywane statystycznie. Wiedza ta jest podstawą optymalnych schematów służących do diagnozy, leczenia oraz rokowania, szczególnie w chorobach nowotworowych, a zwłaszcza do powstania zmodyfikowanej, opartej na fenotypach i pochodzeniu komórki chłoniaka, klasyfikacji chłoniaków nieziarniczych [19], zaproponowanej w miejsce rozdrobnionej klasyfikacji histopatologicznej [20]. Nowa klasyfikacja wymaga nieco odmiennego zestawu przeciwciał monoklonalnych, w porównaniu do zestawu rytynowo używanego w fenotypowej klasyfikacji białaczek.



KLASYFIKACJA FENOTYPOWA OSTRYCH BIAŁACZEK


W tab. 2. przedstawiono podstawowy zestaw przeciwciał monoklonalnych stosowany do rozpoznawania fenotypów komórek rozrostowych w ostrych białaczkach.



KLASYFIKACJA FENOTYPOWA CHŁONIAKÓW
NIEZIARNICZYCH


W tab. 3. i 4. przedstawiono fenotypy komórek chłoniaków w poszczególnych grupach klasyfikacyjnych nowego, zmodyfikowanego podziału chłoniaków i białaczek [19].

Cytometria przepływowa, jako metodologia XXI w., jest bardzo nowoczesną i dokładną metodą analizy pod względem biochemicznych i fizycznych właściwości komórek. W ciągu kilku sekund można z niezwykłą dokładnością i powtarzalnością wykryć subpopulacje rzadko występujące i nietypowe. Pozwala szerzej spojrzeć na mechanizmy aktywacji i funkcje komórek odpornościowych. Zastąpienie w ocenie stanu czynnościowego układu immunologicznego żmudnych metod manualnych technikami cytometrycznymi pozwala na w pełni miarodajne badanie kilku parametrów jednocześnie i stwarza możliwości standaryzacji. Obecnie cytometria przepływowa ma zastosowanie w codziennej rutynowej diagnostyce w chorobach układu krwiotwórczego, gdzie zmiany fenotypu są szczególnie wyraźne, będąc odbiciem różnicowania i dojrzewania licznych suppopulacji. Należy jednak zawsze pamiętać, by każde badanie było analizowane indywidualnie i korelowane z innymi badaniami morfologicznymi wykonanymi na tym samym materiale (histopatologicznymi, cytogenetycznymi) z uwzględnieniem wieku pacjenta, zmian odczynowych chorób autoimmunizacyjnych.



PIŚMIENNICTWO

1. Bradstock K, Matthews J, Benson E, et al. Prognostic value of immunophenotyping in acute myeloid leukemia. Bood 1994; 84: 1220-5.
2. Boldt DH, Kopecky KJ, Head D, et al. Expression of myeloid antigens by blast cells in acute lymphoblastic leukemia of adults. The Southwest Oncology Group Experience. Leukemia 1994; 8: 2118-26.
3. Jennings CD, Foon KA. Flow cytometry: Recent advances in diagnosis and monitoring of leukemia. Cancer Invest 1997; 15: 384.
4. Tbakhi A, Edinger M, Myles J, Pohlman B, Tubbs RR. Flow cytometric immunophenotyping of non-Hodgkin's lymphomas and related disorders. Cytometry 1996; 25: 113.
5. Żeromski J, Dworacki G. Ocena immunofenotypu komórek limfoidalnych przy pomocy cytometrii przepływowej - uwagi praktyczne i zastosowania kliniczne. Central European J of Immunolgy 1996; 21: 99-106.
6. Pojda Z, Strużyna J. Cytometria przepływowa w badaniach komórek krwiotwórczych. Central European J of Immunology 1996; 21: 114-8.
7. Carey JL, Hanson CA. Flow cytometric analysis of leukemia and lymphoma. In: Flow Cytometry and Clinical diagnosis. Eds.: Keren DF, Hanson CA, Hurtubise PE. American Society of Clinical Pathologists 1994; 197-308.
8. Huh YO, Andreeff M. Flow cytometry. Clinical and research applications in hematological malignancies. Hematol Oncol Clin North Amer 1994; 8: 703-23.
9. Macartney JC, Camplejohn RS. DNA flow cytometry of non-Hodgkin’s lymphomas. Eur J Cancer 1990; 26: 635.
10. Niezabitowski A, Lackowska B. Przydatność kliniczna oceny DNA przy użyciu cytometrii przepływowej w nowotworach ludzkich. Central European J of Immunology 1996; 21: 147-55.
11. Darzynkiewicz Z. Apoptosis in antitumor strategies: Modulation of cell cyckle and differentiation. J Cell Biochem 1995; 58: 151-59.
12. Fisher DE. Apoptosis in cancer therapy: crossing the threshold. Cell 1994; 78: 539-42.
13. Hickmann JA. Apoptosis induced by anticancer drugs. Cancer Metast Rev 1992; 11: 121-39.
14. Kerr JFR, Winterford CM, Harmon V. Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer 1994; 73: 2013-26.
15. Vidriales MB, Orfao A, Gonzales M, et al. Expression of NK and lymphoid-associated antigens in blast cells of acute myeloblastic leukemia. Leukemia 1993; 7: 2026-9.
16. Drexler HG, Thiel E, Ludwig W-D. Review of incidence and clinical relevance of myeloid antigen - positive acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 1991; 5: 637-45.
17. Wąsik M. Przydatność i zasady oceny fenotypu komórek w diagnozowaniu ostrych białaczek. Diagn Lab 2001; 37: 221-52.
18. Niezabitowski A, Lackowska B, Gruchała AG, et al. Flow cytometric DNA analysis of cells obtained with fine needle aspiration biopsy of the breast. Gen Diagn Pathol 1996; 142: 33-39.
19. Harris NL, Jaffe ES, Stein H, et al. A revisited European - American classification of lymfoid neoplasms: A proposal from the Inernational Lymphoma Sudy Group. Bood 1994; 84: 1361-92.
20. National Cancer Institute sponsored study of classification of non-Hodgkin’s lymphoma. Cancer 1982; 49: 2112-35.
21. Pituch-Noworolska A. Zastosowanie cytometrii przepływowej do diagnostyki białaczek i chłoniaków nieziarniczych. Central European J of Immunology 1996; 21: 138-46.



ADRES DO KORESPONDENCJI

dr med. Aldona Kaczmarek

Zakład Diagnostyki i Immunologii
Nowotworów

Wielkopolskie Centrum Onkologii

ul. Garbary 15

61-866 Poznań