Concentrations of growth factors in serum in women with primary ductal breast cancer

Wstęp

W ostatnich latach coraz więcej uwagi poświęca się roli czynników wzrostowych w etiopatogenezie różnych chorób [1, 2]. Do dotychczasowej uznanej regulacji neurohormonalnej i immunologicznej ustroju dołączyły się nowe elementy związane z działaniem autokrynnym i parakrynnym czynników wzrostowych [3, 4]. Wpłynęło to istotnie na poglądy dotyczące wielu procesów ustrojowych. Czynniki wzrostowe są wytwarzane przez różne tkanki, stymulują podziały komórek oraz mają właściwości troficzne.
Nieprawidłowa ekspresja aktywności tych substancji może prowadzić do głębokiej dysregulacji wzrostu i przyczynić się do powstawania nowotworów [5, 6].
Ekspresja czynników wzrostowych jest regulowana przez hormony i inne cytokiny [4, 7].

Materiał i metody

Badany materiał obejmował 60 kobiet zdrowych (grupa I, kontrolna) i 65 kobiet z pierwotnym rakiem przewodowym gruczołu piersiowego (grupa II, badana). Średni wiek kobiet z grupy I wynosił 49,56 ±6,36 roku, a wskaźnik masy ciała (body mass index – BMI) 23,16 ±2,98. Średni wiek kobiet z grupy badanej wynosił 54,6 ±10,89 roku, a wskaźnik masy ciała (BMI) 27,47 ±10,9. Grupy nie różniły się statystycznie pod względem wieku i BMI. Średnia rozrodczość w grupie I wynosiła 2,1, a w grupie II 1,7 (NS). U kobiet z grupy kontrolnej badaniem mammograficznym i ultrasonograficznym nie stwierdzono zmian patologicznych w gruczołach piersiowych. Badanie czynników wzrostowych w surowicy kobiet z grupy badanej przeprowadzono w chwili ustalenia rozpoznania histopatologicznego przed zastosowaniem zasadniczego postępowania leczniczego.
Przed zabiegiem operacyjnym w godzinach rannych pobierano krew z żyły odłokciowej celem oznaczenia czynników wzrostowych w osoczu. U kobiet miesiączkujących krew do badań biochemicznych pobierano w 18.–20. dniu cyklu, w godzinach rannych. Stężenia czynników wzrostowych: nabłonkowego (epidermal growth factor – EGF), transformującego β (transforming growth factor β – TGF-b), fibroblastów typu 2 (fibroblast growth factor 2 – FGF-2), płytkopochodnego (platelet-derived growth factor – PDGF) oraz insulinopodobnego typu 1 (insulin-like growth factor 1 – IGF-1) w surowicy oznaczano metodą ELISA, używając gotowych zestawów firmy R&D Systems. Wycinki do badania histopatologicznego u kobiet z grupy II pobierano w czasie zabiegu operacyjnego.
Receptory estrogenowe jądrowe oznaczono metodą immunohistochemiczną przy użyciu zestawu LSAB – firmy Dako. Badania morfologiczne tkanek wykonywano w Zakładzie Patomorfologii i Genetyki Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie.
Uzyskane wyniki analizowano statystycznie za pomocą programu komputerowego Statistica PL, version 5 (StatSoft) z zastosowaniem testu t-Studenta.
Za poziom znamienności przyjęto p < 0,05. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Etyki Lekarskiej PAM w Szczecinie Nr BN 001/7/2000.

Wyniki

Uzyskane wyniki zestawiono w postaci 5 tabel w zależności od rodzaju przeprowadzonych analiz statystycznych. W tabeli 1. przedstawiono wyniki badań klinicznych i histopatologicznych kobiet z pierwotnym rakiem przewodowym gruczołów piersiowych. Oceny badań klinicznych i histopatologicznych dokonano w zależności od wielkości guza nowotworowego, stopnia złośliwości histologicznej, inwazyjności stanu regionalnych węzłów chłonnych i obecności receptorów estrogenowych w rakach przewodowych gruczołu piersiowego. Wyniki badań stężenia czynników wzrostowych w surowicy zestawiono w tabeli 2. Wynika z niej, że w porównaniu z wartościami grupy kontrolnej u kobiet z rakiem przewodowym gruczołu piersiowego, stężenia EGF (p < 0,001) i IGF-1 (p < 0,001) są wysoce znamiennie wyższe. Natomiast stężenia TGF-b, FGF-2 i PDGF są wyższe ze znamiennością graniczną (p < 0,05). Stężenia czynników wzrostowych w surowicy w zależności od stopnia histologicznej złośliwości przedstawiono w tabeli 3. Wynika z niej, że w porównaniu z wartościami I° złośliwości, stężenia EGF (p < 0,01) oraz IGF-1 (p < 0,01) w II° i III° złośliwości były znamiennie większe. Stężenia TGF-b (p < 0,05) i PDGF (p < 0,01) w II° i III° złośliwości były znamiennie niższe w stosunku do I°. Stężenia FGF-2 w surowicy nie wykazują znamiennej różnicy w zależności od stopnia złośliwości.
Z tabeli 4. wynika, że wartości stężeń EGF (p < 0,01) i IGF-1 (p < 0,05) w surowicy wykazują znamienny wzrost w zależności od wielkości zmiany nowotworowej. Stężenia TGF-b wykazują znamiennie niższe wartości w dużych zmianach nowotworowych (p < 0,01). Stężenia FGF-2 i PDGF w surowicy nie wykazują zależności od wielkości guza nowotworowego. W tabeli 5. przedstawiono stężenia czynników wzrostowych w zależności od liczby zajętych węzłów chłonnych. Wynika z niej, że stężenia EGF (p < 0,05), IGF-1 (p < 0,01) i PDGF (p < 0,05) w surowicy znamiennie zwiększają się z liczbą zajętych węzłów chłonnych. Z kolei stężenie TGF-b (p < 0,01) ulega znamiennemu zmniejszeniu wraz ze wzrostem liczby zajętych węzłów chłonnych. Stężenie FGF-2 w surowicy nie wykazuje znamienności ze wzrostem liczby zajętych węzłów chłonnych.

Dyskusja

W świetle badań Eberta i wsp. [8] oraz Torrisi i wsp. [9] szczególną rolę we wzroście, różnicowaniu i powstawaniu niezłośliwych i złośliwych zmian w gruczole piersiowym odgrywają czynniki wzrostowe. Jednym z najbardziej znanych czynników wzrostu jest EGF. Badania Milewicza i wsp. [10] wykazały, że istnieje związek między sekrecją GH a wydzielaniem IGF-1.
W ulegających transformacji komórkach rośnie produkcja własnych czynników wzrostowych. Zdaniem Eberta i wsp. [8] komórki nowotworowe w przeciwieństwie do prawidłowych wykazują zmniejszoną zależność od egzogennych czynników wzrostowych. Związane jest to częściowo ze zdolnością do produkcji przez komórki nowotworowe własnych czynników wzrostowych. Powyższe czynniki mogą autonomicznie oddziaływać na podziały i różnicowanie komórek nowotworowych, gdy komórki te mają odpowiednie dla nich receptory.
Czynniki wzrostowe, takie jak EGF, TGF-b czy FGF-2 mogą stymulować wzrost komórek „pnia” (stem) w gruczole piersiowym oraz ich różnicowanie w kierunku komórek mioepitelialnych i nabłonkowych. To one, łącznie z insulinopodobnymi czynnikami wzrostowymi (insulin-like growth factors), produkowanymi głównie przez wątrobę w warunkach fizjologicznych, odpowiadają za rozwój gruczołów piersiowych i przemiany zachodzące w nich w ciągu całego życia kobiety.
Stężenie EGF jest uzależnione od typu komórek i rodzaju tkanek, w których jest syntetyzowany i wydzielany do krwi [11]. Nabłonkowy czynnik wzrostu jest odpowiedzialny za wzrost prawidłowego i nowotworowego nabłonka gruczołów piersiowych. Działa na komórki gruczołu piersiowego bezpośrednio poprzez własne receptory znajdujące się w gruczole piersiowym i pośrednio przy udziale receptorów steroidowych i prolaktynowych. Zdolność do sekrecji EGF w badaniach in vitro wykazują zarówno komórki nabłonkowe, jak i mioepitelialne gruczołu piersiowego.
Jak wynika z badań własnych autorów niniejszej pracy, najbardziej przydatne w diagnostyce i ocenie zaawansowania raka gruczołu piersiowego jest oznaczanie stężeń EGF i IGF-1 w surowicy (tab. 2.–5.). Oznaczanie stężeń TGF-b, FGF-2 i PDGF odgrywa mniejszą rolę (tab. 2.). Wyniki badań własnych częściowo korelują z wynikami badań Eberta wsp. [8]. Autorzy ci przypisują duże znaczenie EGF i jego receptorom w regulacji wzrostu prawidłowych i nowotworowych komórek nabłonkowych gruczołu piersiowego [8]. Na podstawie badań in vivo sugeruje się autokrynne i parakrynne działanie EGF w gruczole piersiowym. Nabłonkowy czynnik wzrostowy jest uważany za jeden z głównych czynników odpowiedzialnych za proliferację nabłonka i tkanki łącznej gruczołu piersiowego. Należy podkreślić, że EGF ma własne receptory docelowe w komórkach nabłonka i tkanki śródmiąższowej gruczołu piersiowego i swoiście pobudza wzrost tych komórek.
Stwierdzone w przeprowadzonych badaniach znaczne zwiększenie stężenia EGF u kobiet z pierwotnym rakiem przewodowym gruczołu piersiowego może przemawiać za jego wzmożoną syntezą w tkankach gruczołu piersiowego (tab. 2.–5.).
U kobiet z rakiem gruczołu piersiowego stwierdza się znamiennie większe stężenia EGF w surowicy w porównaniu ze zdrowymi kobietami. Również doniesienia Torrisi i wsp. [9] są zgodne z wynikami badań autorów niniejszej pracy.
W dostępnym piśmiennictwie autorzy nie znaleźli informacji dotyczących zależności miedzy stopniem złośliwości histologicznej a stężeniem czynników wzrostowych w surowicy. Z badań własnych (tab. 3.) wynika, że im bardziej jest niezróżnicowany nowotwór, tym większy obserwuje się wzrost stężenia czynników wzrostowych, szczególnie EGF, IGF-1 i PDGF.
Fibroblastyczny czynnik wzrostowy typu 2 jest mitogenem dla wielu typów komórek. Wykazano stymulujący wpływ tego czynnika w stosunku do komórek raka gruczołu piersiowego [13]. Wiąże się on ze swym receptorem – kinazą tyrozynową (tyrosine kinase – TK). Zwiększeniu stężenia EGF w surowicy towarzyszy znamienne zwiększenie stężeń TGF-b, FGF-2 oraz PDGF i IGF-1 (tab. 2.).
Jak wynika z badań własnych, wraz ze wzrostem masy guza obserwuje się znamiennie istotne zmniejszenie stężenia TGF-b, natomiast pozostałe czynniki wzrostowe zachowują się w sposób zróżnicowany (tab. 3.). Zmniejszenie stężenia TGF-b w surowicy prowadzi do wzmożonej proliferacji komórek i postępu choroby nowotworowej [12]. Fizjologiczna rola TGF-b w gruczole piersiowym i w rzeczywistości w większości tkanek jest słabo poznana. Transformujący czynnik wzrostu β hamuje proliferację komórek, indukuje apoptozę i wpływa na morfogenezę za pośrednictwem pozakomórkowej macierzy (extracellular matrix) i procesów przemodelowania (remodeling). Działaniu TGF-b towarzyszą złożone mechanizmy regulacji transkrypcji, translacji i aktywacji. Zdefiniowanie przestrzennych i czasowych wzorów utajonej aktywacji TGF-b jest istotne do zrozumienia specyficznej roli, jaką odgrywa TGF-b w rozwoju, proliferacji i morfogenezie gruczołu piersiowego [12]. Spośród wszystkich czynników wzrostowych wpływ PDGF na rozwój nowotworów gruczołu piersiowego jest najmniej poznany.
Wraz z zaawansowaniem procesu nowotworowego w gruczole piersiowym, czego kryterium jest m.in. liczba zajętych węzłów chłonnych (tab. 5.), autorzy zaobserwowali znamienne zwiększenie stężeń EGF i IGF-1. Odmiennie natomiast zachowuje się stężenie TGF-b, które wykazuje znamiennie niższe wartości (tab. 5.). Obserwowane zmiany wiążą się z funkcją poszczególnych czynników wzrostowych, z których jedne indukują proliferację komórek, a inne ją hamują [13].
Insulinopodobne czynnniki wzrostowe 1 i 2 (IGF-1, IGF-2) podtrzymują proliferację komórek, wprowadzają je do cyklu programowego podziałów komórkowych oraz stymulują ich wzrost. Receptory IGF-1 (insulin-like growth factors receptors 1, IGF-1Rs) regulują wielkość i strukturę komórek. Receptory działają za pośrednictwem białka IRS-1 i odgrywają rolę w transformacji i apoptozie komórek. Receptor IGF-1 jest receptorem kinazy tyrozynowej w 70% homologicznym z receptorem insulinowym [14–16].
Receptor IGF-1 jest głównie receptorem mitogenezy, transformacji i protekcji komórek przed apoptozą (działanie antyapoptotyczne). Obniżenie aktywności (down regulation of the IGF-1R) prowadzi do masywnej apoptozy komórek nowotworowych. Wspomniany receptor podtrzymuje proliferację komórek, która jest przede wszystkim cechą charakterystyczną komórek nowotworowych [17–19].
Pilichowska i wsp. [20] wykazali za pomocą badań immunohistochemicznych, że ekspresję IGF-1 stwierdza się we wszystkich przypadkach raka gruczołu piersiowego. W raku gruczołu piersiowego IGF-1 jest mocno wyrażone zarówno w guzie, jak i w podścielisku i może działać jako stymulator wzrostu w sposób endokrynny, parakrynny i autokrynny.
Podsumowując, znamienne zwiększanie stężenia czynników wzrostowych w surowicy u kobiet z pierwotnym, przewodowym rakiem gruczołu piersiowego może przemawiać za miejscową ich syntezą w tkance nowotworowej. Stopień złośliwości, wielkość zmiany nowotworowej i liczba zajętych węzłów chłonnych wywiera głównie wpływ na zwiększenie stężenia EGF, TGF-b i IGF-1.

Piśmiennictwo

1. Campbell BK. The modulation of gonadotrophic hormone action on the ovary by paracrine and autocrine factors. Anat Histol Embriol 1999; 28: 247-51.
2. Chodosh LA, D’Cruz CM, Gardner HP, et al. Mammary gland development, reproductive history, and breast cancer risk. Cancer Res 1999; 59 (7 suppl.): 1765-71.
3. Shekhtar AB, Serov VV, Donald JC, Armstrong B, Cheng N, Nolin AD, Robert D. Inflammation, adaptive regeneration and dysregulation (Intracellular interaction analysis). Archiv Patologii 1991: 53: 7-14.
4. Horey RC. Establishing a framework for the functional mammary gland from endocrinology to morphology. J Mammary Gland Biol Neoplasia 2002; 7: 17-18.
5. Pezzani I, Reis FM, Di Leonardo S, Luisi S, Santuz M, Driul L, Cobellis L, Petraglia F. Influence of non-gonadotrophic hormones on gonadal function. Molecular Cell Endocrinol 2000; 161: 37-42.
6. Robinson GW, Karpf AB, Kratochwil K. Regulation of mammary gland development by tissue interaction. J Mammary Gland Biol Neoplasia 1999; 4: 9-19.
7. Hansen RK, Bissell MJ. Tissue architecture and breast cancer: the role of extracellular matrix and steroid hormones. Endocr Relat Cancer 2000; 7: 95-113.
8. Ebert AD, Wechsekverger C, Brandt R. Bedeutung der EGF-verwandten Peptide und ihrer Rezeptoren beim Mammakarzinom. Geburtsh Frauenheilk 1995; 59: 499-506.
9. Torrisi R, Zanardi S, Pensa F, Valenti G, De Franchio V, Nocolo G, Barreca A, Minuto F, et al. Epidermal growth factor content of breast cyst fluids from women with breast cancer and proliferative disease of the breast. Cancer Res Breast Treat 1995; 33: 219-22.
10. Milewicz T, Kołodziejczyk J, Basta A, Kurek S, Sztafko K, Krysiek J, Gregoraszczuk EC. Growth hormone induced local insulin-like growth factors I (IGF-I) secretion by human breast cancer explants. Pol J Gynaecol Investig 2001; 4: 61-5.
11. Hamado J, Nakate D, Nakae D, Kobayashi Y, Akai H, Koniski Y, Okada F, Shibata T. Increased oxidative DNA damage in mammary tumor cells by continuous epidermal growth factor stimulation. J Natl Cancer Inst 2001; 93: 214-9.
12. Rose-Hellekant TA, Sandgren EP. Transforming growth factor alpha- and c-myc-induced mammary carcinogenesis in transgenic mice. Oncogene 2000; 19: 1092-6.
13. Granato AM, Nanni O, Falcini F, Folli S, Mosconi G, De Paola F, Medei L, Amadori D. Basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor serum levels in breast cancer patients and healthy women: useful as diagnostic tools? Breast Cancer Res 2004; 6: R38-45.
14. Mundhenke C, Maass N, Jonat W, Fried A. FGF-2 Interaktionen in Mamakarzinomen und gesundem Brustdrüsengewebe. Geburtsh Frauenheilk 2000; 62: 962-6.
15. Weksmański B, Dutkiewicz J, Kowalski T. Changes in insulin-like growth factor, 17â-E2 and progesterone in postmenopausal women with benign and malignant ovarian tumors. Med Sci Monit 2001; 7: 19-25.
16. Bourhis XL, Toillon RA, Boilly B, Hondermarck H, Autocrine and paracrine growth inhibitors of breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat 2000; 60: 251-8.
17. PeSuga K, Imai K, Eguchi S, Higashi Y, Nakachi K. Molecular significance of excess body weight in postmenopausal breast cancer patients, in relation to expression of insulin-like growth factor I receptor and insulin-like growth factor II genes. Jpn J Cancer Res 2001; 92: 127-134.
18. Wiseman BS, Werb Z. Stromal effects on mammary gland development and breast cancer. Science 2002; 296: 1046-9.
19. Briand P, Lundholt BK, Skouv J, Lykersfeldt AE, Growth response of breast epithelial cells to estrogen. Mol Cell Endocrinol 1999; 153: 1-9.
20. Pilichowska M, Kiura N, Fujiwara H, Naguta H. Immunohistochemical study of TGF-alpha, TGF-beta 1, EGFR, and IGF-1 expression in human breast carcinoma. Mod Pathol 1997; 10: 969-75.

Adres do korespondencji
prof. dr hab. med. Stanisław Stanosz
Samodzielna Pracownia Menopauzy i Andropauzy
Pomorska Akademia Medyczna w Szczecinie
ul. Unii Lubelskiej 1
71-252 Szczecin
tel. 48 91 484 58 70
e-mail: stanosz@poczta.onet.pl