Gene therapy of locally advanced vulvar cancer with psFLT construct

Wstęp
Rak sromu należy do rzadko występujących nowotworów. W Polsce notuje się ok. 400 przypadków rocznie [1].
Szczyt zachorowań przypada na 6. i 7. dekadę życia, choć w ostatnich latach obserwuje się wzrost zachorowań u młodszych kobiet, co może być spowodowane częstszymi infekcjami wirusowymi, zwłaszcza wirusem HPV (human papilloma virus) [2–4].
Podstawową metodą leczenia inwazyjnego raka sromu jest chirurgia. Opracowane w latach 40. XX wieku radykalne, blokowe wycięcie sromu oraz regionalnych węzłów chłonnych, a także zmodyfikowana radykalna operacja dokonywana techniką trzech cięć potwierdziły wysoką skuteczność w przypadkach nowotworu we wczesnym stadium zaawansowania miejscowego (T1, T2), bez przerzutów do regionalnych węzłów chłonnych. Osiągany w wyniku takiego postępowania odsetek 5-letnich przeżyć bezobjawowych przekracza 70%.
Wyniki leczenia przypadków miejscowo zaawansowanych w stopniach T3 i T4, a także u chorych z przerzutami do węzłów chłonnych są znacznie gorsze. Zaledwie 20–40% chorych przeżywa 5 lat bez cech nawrotu nowotworu [5].
Szczególnie złe rokowanie dotyczy chorych z guzem naciekającym narządy sąsiednie lub masywnymi, nieoperacyjnymi przerzutami do węzłów chłonnych pachwinowych. Wyniki chirurgii egzenteracyjnej w powyższych przypadkach nie są zachęcające, głównie z powodu wysokiego odsetka wznów i niskiego poziomu akceptacji jakości życia chorych po takich operacjach. Stan ten spowodował wzrost zainteresowania radioterapią w leczeniu tego typu przypadków raka sromu [6].
Doświadczenia kliniczne zebrane w latach 90. XX wieku potwierdziły wysoką skuteczność chemioradioterapii nowotworów, w tym raka szyjki macicy i raka sromu. Leczenie takie stosowane jest zarówno jako neoadiuwant, którego zadaniem jest uzyskanie regresji nowotworu w stopniu pozwalającym na przeprowadzenie radykalnej operacji, jak i jako leczenie samodzielne [7]. Współczesne doniesienia dotyczące wyników chemioradioterapii z zastosowaniem mitomycyny C i 5-fluorouracylu potwierdzają wysoką skuteczność terapeutyczną takiego postępowania. Problemem klinicznym pozostaje toksyczność leczenia. U ok. 50–60% napromienianych obserwuje się odczyny wczesne o średnim i dużym stopniu nasilenia, a śmiertelność wynosi 1–3%. Do najistotniejszych czynników wpływających na wystąpienie odczynu popromiennego zalicza się wielkość pola wlotowego i objętość napromienianych tkanek. W przypadku znacznego zaawansowania nowotworu, szerzącego się na skórę krocza, uda lub pośladka przeprowadzenie bezpiecznego napromieniania może być bardzo trudne lub wręcz niemożliwe [8].
Jednym z nowatorskich sposobów postępowania w zaawansowanym miejscowo raku sromu pierwotnie niekwalifikującym się do leczenia operacyjnego i radioterapii jest próba zastosowania inhibitorów angiogenezy.
Wcześniejsze doświadczenia kliniczne z ich zastosowaniem do leczenia zarówno pierwotnych, jak i nawrotowych nowotworów w różnych lokalizacjach dają podstawę do dalszych badań nad zastosowaniem tego typu terapii [9].

Wektor ekspresyjny psFLT
Interesującą strategią eksperymentalnej terapii nowotworów jest antyangiogenna terapia genowa. Opiera się ona na założeniu, że powstawanie sieci naczyń krwionośnych w masie nowotworu jest czynnikiem bezpośrednio determinującym jego rozwój i warunkującym jednocześnie tworzenie przerzutów nowotworowych. Kilka strategii antyangiogennych znajduje się w trakcie badań eksperymentalnych. Zaliczyć tu można np. próby wykorzystania proteolitycznych fragmentów białek budulcowych (angiostatyna, endostatyna), przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw angiogennym czynnikom wzrostowym czy rozpuszczalnych fragmentów receptorów dla czynników wzrostowych, np. dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (vascular endothelial growth factor – VEGF) [10–15].
Konstrukt psFLT jest plazmidowym wektorem ekspresyjnym kodującym czynnik o charakterze antyangiogennym. Zawiera on fragment genu receptora FLT dla VEGF, kodujący rozpuszczalną formę tego receptora (sFLT). Fragment genu sFLT został wklonowany do komercyjnego wektora pSEC (Invitrogen). Charakterystyczne sekwencje pustego wektora pSEC to: promotor wirusowy CMV, sekwencja sygnałowa Ig, epitop myc oraz sekwencje oporności na ampicylinę oraz fleomycynę. W wyniku klonowania uzyskano konstrukt genowy ze swoistą kasetą ekspresyjną.
Opracowanie terapii antyangiogennej lub postępowania prowadzącego do zmniejszenia stężenia VEGF/VPF może przyczynić się do poprawienia skuteczności terapii nowotworów litych i co za tym idzie, rokowania dla chorych. Próbą takiego postępowania jest podanie konstruktu psFLT w okolicę guza u chorych na raka sromu, który poprzez VEGF i blokowanie natywnych receptorów dla VEGF zahamuje neoangiogenezę, powodując regresję guza.

Materiał i metody
Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Bioetyczną Centrum Onkologii – Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie w Warszawie. Jest to badanie kliniczne I/II fazy, do którego zakwalifikowano 21 chorych z histopatologicznie potwierdzonym płaskonabłonkowym rakiem sromu w stopniach klinicznego zaawansowania od I B do IV A. Wiek pacjentek wynosił 54–86 lat (średnio 69,9 roku).
W 16 przypadkach terapia genowa była leczeniem pierwotnym, a pozostałych było to leczenie wznowy po uprzednim leczeniu chirurgicznym bądź radioterapii.
Plazmid psFLT-1 podawany był bezpośrednio doguzowo. Podawano 800 g roztworu psFLT-1 w soli fizjologicznej (0,4 mg/ml), wykonując 6–10 doguzowych iniekcji (wstrzyknięcia co 1–2 cm). Ostrzykiwanie guza było powtarzane po 2 tyg. Efekt terapeutyczny (zmianę powierzchni guza) oceniano po 3–6 tyg. od pierwszego podania. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu testu ANOVA z testem NIR post-hoc. Wyniki uznawano za statystycznie istotne przy p < 0,05.

Wyniki
Odpowiedź na leczenie – zmianę powierzchni guza uzyskano u 16 chorych. Tolerancja leczenia była bardzo dobra. W żadnym przypadku nie zanotowano działań niepożądanych. Po podaniu konstruktu u 13 pacjentek przeprowadzono leczenie operacyjne (w tym u 5 pacjentek z następową radiochemioterapią), a u 4 pacjentek wyłącznie radiochemioterapię. Cztery pacjentki zrezygnowały z dalszego leczenia. U 12 chorych po leczeniu genowym, po którym wykonano chirurgiczne usunięcie zmiany, zaobserwowano w badaniu histopatologicznego brzeżną martwicę, która wynosiła nawet do 40% masy guza. Ocenę powierzchni guza zamieszczono w tabeli 1. Odpowiedź na leczenie określano, porównując powierzchnię guza po podaniu dawek konstruktu z powierzchnią przed leczeniem i wyrażano w procentach.
Stwierdzono znamienne statystycznie różnice w powierz-chni guza po podaniu 1 dawki konstruktu psFlt, utrzymujące się po drugim podaniu (p < 0,05).

Dyskusja
Zaawansowany rak sromu stanowi poważny problem terapeutyczny. Często miejscowe zaawansowanie guza uniemożliwia radykalne jego wycięcie, a naciekanie okolicy zwieracza odbytu naraża chore na okaleczające zabiegi chirurgiczne, na które albo nie wyrażają one zgody, albo nie kwalifikują się do tego typu rozległych zabiegów chirurgicznych ze względu na upośledzony stan ogólny.
Projektując przedstawione badanie kliniczne, wykorzystano informacje, opublikowane wyniki badań przeprowadzone in vitro oraz na zwierzętach laboratoryjnych, które wskazują, że ekspresyjny wektor plazmidowy psFLT-1 ulega ekspresji zarówno w komórkach hodowlanych, jak i guzach nowotworowych. W badaniach wykazano, że w transfekowanych komórkach powstaje wydzielane na zewnątrz rekombinowane białko sFLT-1; obserwowano przy tym hamowanie angiogenezy oraz hamowanie wzrostu guzów nowotworowych i wydłużenie czasu życia zwierząt [16–18].
Wydaje się, że w tych przypadkach zastosowanie konstruktu psFLT przynosi realne korzyści chorym poprzez ograniczenie nacieku nowotworowego, poprawiając komfort ich życia. Innym aspektem tego leczenia jest zastosowanie terapii antyangiogennej u chorych we wcześniejszych stopniach zaawansowania klinicznego, które są kwalifikowane do leczenia chirurgicznego. Zmniejszenie ukrwienia guza, jak również jego wymiarów, ogranicza śródoperacyjną utratę krwi oraz zmniejsza pole operacyjne. Ma to niebagatelne znaczenie w skróceniu procesu gojenia rany pooperacyjnej, a co za tym idzie – umożliwia wcześniejsze leczenie uzupełniające, np. radioterapię.
Praca powstała ze środków grantu KBN „Terapia genowa raka sromu 2P05E 071 26”, kierownik grantu: dr med. Krzysztof Gawrychowski.

Piśmiennictwo
1. Wojciechowska U, Didkowska J, Tarnowski W, Zatoński W. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2004 roku. Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie, Warszawa 2006; 96.
2. Sasco AJ, Genre I. Current epidemiology of vulvar cancer. Contracept Fertil Sex 1998; 26: 858-64.
3. Macnab JC, Walkinshaw SA, Cordiner JW, Clements JB. Human papillomavirus in clinically and histologically normal tissue of patients with genital cancer. N Engl J Med 1986; 315: 1052-8.
4. Gryboś M, Murawski M. Epidemiologia i etiopatogeneza raka sromu. W: Ginekologia onkologiczna. Markowska J (red.). Urban & Partner, Wrocław 2006: 247-54.
5. Emerich J, Sznurowski J. Leczenie chirurgiczne raka sromu. W: Ginekologia onkologiczna. Markowska J (red.). Urban & Partner, Wrocław 2006: 414-41.
6. Boronow RC. Combined therapy as an alternative to exenteration for locally advanced vulvo-vaginal cancer; rationale and results. Cancer 1982; 49: 1085-91.
7. Moore DH, Thomas GM, Montana GS, Saxer A, Gallup DG, Olt G. Preoperative chemoradiation for advanced vulvar cancer; a phase II study of the gynecologic oncology group. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1998; 42: 79-85.
8. Mulayim N, Foster Silver D, Schwartz PE, Higgins S. Chemoradiation with 5-fluorouracil and mitomycin C In the treatment of vulvar squamous cell carcinoma. Gynecol Oncol 2004; 93: 659-66.
9. Małecki M, Janik P. Naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF) i jego potencjalne aplikacje terapeutyczne w zmianach naczyniowych i nowotworowych. Pol Przeg Chirurg 1999; 71: 1291-97.
10. Ment LR, Stewart WB, Fronc R, Seashore C, Mahooti S, Scaramuz-zino D, Madri JA. Vascular endothelial growth factor mediates reactive angiogenesis in the postnatal developing brain. Brain Res Dev Brain Res 1997; 100: 52-61.
11. Folkman J. Angiogenesis and angiogenesis inhibition: an overview. Regulation of angiogeneis. Birkhauser Verlag, Basel 1997; 1-8.
12. Angiolillo AN, Sgadari C, Taub DD, et al. Human interferon-inducible protein 10 is a potent inhibitor of angiogenesis in vivo. J Exp Med 1995; 182: 155-62.
13. Fotsis T, Zhang Y, Pepper MS, Adlercreutz H, Montesano R, Nawroth PP, Schweigerer L. The endogenous oestrogen metabolite 2-methoxyoestradiol inhibits angiogenesis and suppresses tumour growth. Nature 1994; 368: 237-9.
14. Gately S, Twardowski P, Stack M, et al. Human prostate carcinoma cells express enzymatic activity that converts human plasminogen to the angiogenesis inhibitor, angiostatin. Cancer Res 1996; 56: 4887-90.
15. Battegay EJ. Angiogenesis: mechanistic insights, neovascular diseases, and therapeutic prospects. J Mol Med 1995; 73: 333-46.
16. Malecki M, Jastrzębski Z, Przybyszewska M, Proczka R, Janik P. Antiangiogenic gene therapy: application of soluble FLT-1 receptor. Adv Clin Exp Med 2004; 13: 227-33.
17. Malecki M, Trembacz H, Szaniawska B, Przybyszewska M, Janik P. Vascular endothelial growth factor and soluble FLT-1 receptor interactions and biological implications. Oncology Reports 2005; 14: 1565-9.
18. Małecki M, Gromek K, Przybyszewska M, Janik P. Plazmidowy wektor ekspresyjny kodujący receptor sFLT-1 (psFLT-1) ogranicza angiogenezę i wzrost guzów L1. Współcz Onkol 2006; 10: 145-51.