Torakochirurgia
Evaluation of frozen section usefulness for the diagnosis of pulmonary lesions, pleural and mediastinal diseases, for the detection of metastasis of lung cancer in mediastinal lymph nodes, and for the assessment of surgical margins in lung cancer resection specimens

Wstęp
Badanie śródoperacyjne, zwane również badaniem doraźnym (tzw. intra), jest specyficzną procedurą histopatologiczną, wymagającą zarówno doświadczenia ze strony lekarza patologa oceniającego materiał, jak również zrozumienia przez chirurga wskazań do jego wykonania. Najczęściej jest wykorzystywane do: 1) ustalenia obecności i charakteru zmiany; 2) oceny marginesu chirurgicznej resekcji; 3) oceny wartości diagnostycznej pobranego materiału do dalszych rutynowych procedur, umożliwiających ostateczne rozpoznanie mikroskopowe [1, 2]. W diagnostyce zmian w płucach, opłucnej i śródpiersiu wskazania do wykonania badania śródoperacyjnego są podobne.
W chorobach płuc służy głównie do różnicowania zmian ogniskowych, tzw. „cieni okrągłych”, do potwierdzenia wcześniejszej sugestii nowotworu złośliwego wysuniętej na podstawie biopsji cienkoigłowej, gruboigłowej, gdy diagnoza budzi jakiekolwiek wątpliwości kliniczne, a także do oceny stopnia zaawansowania raka płuca, w oparciu
o badanie węzłów chłonnych śródpiersia oraz wycinków pobranych z podejrzanych ognisk, poza zasadniczym guzem nowotworowym [1].
Diagnostyka śródoperacyjna opłucnej zwykle jest pomocna w odróżnieniu rozrostów nowotworowych od odczynowych i zapalnych oraz w wyjaśnieniu przyczyny gromadzenia się płynu w opłucnej [3]. W chorobach śródpiersia badanie doraźne najczęściej jest wykorzystywane do różnicowania zmian guzowatych, budzących podejrzenie procesu nowotworowego [4].
Nie zawsze badanie śródoperacyjne kończy się rozpoznaniem. Wówczas ostateczna odpowiedź zostaje odroczona do czasu wykonania pełnego badania histologicznego, wymagającego utrwalenia materiału i sporządzenia standardowych preparatów mikroskopowych uzyskanych z tzw. bloczków parafinowych.
Wyniki fałszywie ujemne dla nowotworu zdarzają się wówczas, gdy wycinek został pobrany przez patologa lub operującego chirurga z niewłaściwego miejsca, a zmiany nowotworowe znajdują się w pozostałym materiale nadesłanym do ostatecznej oceny. Przyczyną może być również nieprawidłowa interpretacja mikroskopowa zmian [1, 2].
Natomiast odpowiedź fałszywie dodatnia związana jest z błędnym rozpoznaniem nowotworu złośliwego. Najczęściej spowodowana jest zmianami imitującymi naciek nowotworowy lub wynikającymi ze zgniecenia komórek, ocenianymi w zbyt małym wycinku, a także brakiem doświadczenia patologa wykonującego badanie [1].

Cel pracy
Celem pracy było prześledzenie skuteczności diagnostyki śródoperacyjnej w chorobach płuc, opłucnej i śródpiersia, w ocenie radykalności marginesu chirurgicznego oraz zmian w węzłach chłonnych śródpiersia w oparciu o retrospektywne badanie materiału Zakładu Patologii Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc (IGiChP) w ciągu roku.

Materiał i metody
Analizie poddano badania śródoperacyjne wykonane w Zakładzie Patologii IGiChP w Warszawie w roku 2005.Mbr> Badania obejmowały ocenę makroskopową nadesłanego materiału oraz mikroskopową, na którą składały się preparaty cytologiczne tzw. odbitkowe (imprinty), przeciętnie 2 rozmazy z każdego pobranego wycinka i preparaty mrożone, następnie barwione standardowo hematoksyliną i eozyną. W nielicznych przypadkach badanie opierało się wyłącznie na ocenie makroskopowej zmiany.
Prześledzono liczbę wykonanych badań, z uwzględnieniem rodzaju nadsyłanego materiału, wielkości wycinków, dzieląc je na dotyczące zmian zlokalizowanych w płucach, w opłucnej, śródpiersiu, obejmujące węzły chłonne, margines chirurgiczny.
Wyodrębniono badania tzw. zgodne, w których odpowiedź śródoperacyjna i ostateczna, z bloczków parafinowych wcześniej mrożonego materiału i ewentualnie pozostałego, były takie same; badania odroczone, w których nie można było jednoznacznie ustalić rozpoznania histopatologicznego albo ze względu na brak możliwości oceny, czy zmiana jest przerzutowa czy pierwotna, łagodna czy złośliwa, niemożliwe było ustalenie typu nowotworu, z zaznaczeniem, czy miało to wpływ na dalszy zabieg operacyjny; wreszcie badania fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne dla nowotworu z istotnymi konsekwencjami lub bez konsekwencji dla chorych.

Wyniki
Liczba przebadanych przypadków wynosiła 539, natomiast wykonanych badań śródoperacyjnych 905.
Liczba badań związanych z chorobami płuc, opłucnej
i śródpiersia wynosiła 894. Pozostałe 11 obejmowało diagnostykę zmian w tarczycy, sieci, przełyku, tkankach miękkich okolicy szyi, ściany klatki piersiowej, przepony.
W 88 przypadkach badanie śródoperacyjne wykonywano z kilku zmian lub narządów. Na ogół były to 2 badania obejmujące guz lub wycinek z guza płuca i węzły chłonne (39), wycinki z guza i marginesu chirurgicznego oskrzela (6), wycinki z 2 ogniskowych zmian lub z zasadniczej zmiany
i podejrzanej o przerzut (9), z guza i z opłucnej (5), z węzłów i z marginesu chirurgicznego (9), z węzłów (2), z guza i zmiany skórnej podejrzanej o przerzut (1), z marginesu oskrzela i opłucnej (1). W 7 przypadkach było jeszcze bardziej rozległe, zawierało od 3 do 5 badań pobranych z kilku zmian lub miejsc w różnym czasie trwania zabiegu operacyjnego.

Badania śródoperacyjne zmian w płucach
Liczba diagnozowanych zmian w płucach obejmowała 298 przypadków, w których wykonano 308 badań śródoperacyjnych.
W zdecydowanej większości nadesłany materiał pochodził ze zmian w płucach (257), w tym 2 drobne wycinki o średnicy ok. 0,2 cm z bronchoskopii sztywnej. W 41 przypadkach do badania nadesłano płat lub płuco ze zmianą.
Najwięcej rozpoznano raków niedrobnokomórkowych płuca (145); rakowiaki typowe i atypowe wyodrębniono oddzielnie, stanowiły one 10 przypadków. Na drugim miejscu znalazły się zmiany określone jako nienowotworowe (103), które obejmowały zapalenia, bez precyzyjnego ustalenia etiologii, torbiele, zawał płuca, grzybniak i pylicę. Wśród pozostałych zmian występowały odpryskowiaki (hamartoma) (22), przerzuty nowotworowe (9), rozrosty limfoproliferacyjne (3); chłoniaki z komórek B typu MALT (marginal zone B-cell lymphoma of MALT type), LYG (lymphomatoid granulomatosis) oraz zlokalizowane guzy włókniste (2) (tab. I).
Około połowę odpryskowiaków zdiagnozowano wyłącznie badaniem makroskopowym.
Wśród rozpoznanych przerzutów znalazły się: mięsak mięśniowy gładkokomórkowy (1), rak gruczołowo-torbielowaty (1), rak jasnokomórkowy (2), czerniak (2), rak gruczołowy jelita grubego (2), przerzut raka gruczołowego płuca do węzła podopłucnowego (1). W jednym przypadku,
u chorego z guzem płuca, po wcześniejszym usunięciu krtani z powodu raka, rozpoznano rak płaskonabłonkowy, bez podania odpowiedzi, czy zmiana jest przerzutowa czy pierwotna, co nie miało istotnego wpływu na wykonywany zabieg chirurgiczny.
Zdecydowana większość badań śródoperacyjnych była zgodna z wynikiem ostatecznym (96,8%) (tab. II). W 8 (2,6%) przypadkach badanie odroczono do czasu wykonania preparatów z bloczków parafinowych. Na ogół decyzja ta nie miała wpływu na wykonywany zabieg operacyjny, gdyż oceniany śródoperacyjnie materiał był fragmentem pobranym z całej usuniętej zmiany lub narządu (tab. III). Tylko w jednym badaniu, u chorego po operacji raka pęcherza, rozpoznano rak niedrobnokomórkowy wymagający różnicowania pomiędzy przerzutem carcinoma urotheliale a pierwotnym rakiem płuca. Diagnostyka immunohistochemiczna preparatów z bloczków parafinowych pozwoliła na ostateczne rozpoznanie raka płuca, co w efekcie wymagało usunięcia płata.
W 1 przypadku rozpoznanie śródoperacyjne było fałszywie ujemne i w 1 fałszywie dodatnie. Obydwa miały istotne konsekwencje dla chorych (tab. IV). W badaniu fałszywie ujemnym, w pobranym wycinku stwierdzono martwicę, natomiast w pozostałym materiale zdiagnozowano rak niedrobnokomórkowy płuca. W konsekwencji spowodowało to opóźnienie wykonania rozleglejszego zabiegu operacyjnego.
Badanie fałszywie dodatnie dotyczyło wycinka z miąższu płuca o średnicy ok. 0,9 cm, w którym rozpoznano rak niedrobnokomórkowy płuca. Natomiast w badaniu
z bloczków parafinowych, w korelacji z pozostałym nadesłanym materiałem pochodzącym z usuniętego płata, zweryfikowano rozpoznanie i zmieniono na rozrost gruczolakowaty atypowy pneumocytów oraz rozrost odczynowy
w obrębie włóknienia i zmian zapalnych śródmiąższowych.

Badanie śródoperacyjne marginesu chirurgicznego
Margines chirurgiczny oceniano w 54 przypadkach,
w których wykonano 59 badań doraźnych. Badanie dotyczyło przede wszystkim ściany oskrzela, opłucnej płucnej, ściennej, tkanek śródpiersia, osierdzia, miąższu płuca, ściany klatki piersiowej. W jednym przypadku oceniano margines wpustu żołądka (tab. V). Większość rozpoznań była zgodna z wynikiem ostatecznym (98,3%), 1 badanie wycinków pochodzących ze ściany klatki piersiowej odroczono do czasu wykonania skrawków parafinowych (1,7%). Nie miało ono wpływu na dalsze postępowanie ze względu na niemożność poszerzenia zabiegu operacyjnego. Nie było badań fałszywie ujemnych i fałszywie dodatnich (tab. VI).
Naciek raka stwierdzono w 14 badaniach, natomiast w 1 rozpoznano dysplazję nabłonka oskrzelowego. W pozostałych przypadkach margines był wolny od zmian nowotworowych.

Badania śródoperacyjne wycinków z opłucnej
Liczba przypadków wynosiła 13, zaś wykonanych badań śródoperacyjnych 15. Badania zgodne stanowiły 86,7% (13 przypadków). W 8 badaniach nie stwierdzono rozrostu nowotworowego, w 3 rozpoznano naciek raka niedrobnokomórkowego płuca, w 2 nowotwór złośliwy nabłonkowy, wymagający różnicowania pomiędzy międzybłoniakiem złośliwym a rakiem gruczołowym. Rozpoznanie było wystarczające do dalszego postępowania chirurgicznego. Natomiast w 2 przypadkach (13,3%) odpowiedź była fałszywie ujemna. W obydwu badaniach w nadesłanym materiale nie znaleziono utkania nowotworowego, które stwierdzono w wycinkach dostarczonych do rutynowej diagnostyki z bloczków parafinowych. Negatywna odpowiedź nie wpłynęła na sposób postępowania, bowiem w obu przypadkach obraz kliniczno-radiologiczny stanowił podstawę dalszego postępowania chirurgicznego.
W jednym usunięto guz okolicy przykręgosłupowej wraz z opłucną ścienną, w którym w badaniu histopatologicznym ze skrawków parafinowych rozpoznano naciek leiomyosarcoma. W 2. przypadku wykonano tylko zabieg paliatywny. W przebadanym mikroskopowo materiale stwierdzono utkanie międzybłoniaka złośliwego mięsakowego (tab. VII).

Badanie śródoperacyjne węzłów chłonnych
Liczba przypadków wynosiła 151, natomiast wykonanych badań śródoperacyjnych 493. W zdecydowanej większości oceniano węzły chłonne śródpiersia (488), 4 badania dotyczyły węzłów krezki, sieci, wpustu żołądka, szyi, w 1 materiale nie znaleziono utkania węzła, wycinek odpowiadał skrzepowi krwi.
W 119 przypadkach pojedyncze badanie doraźne zawierało kilka węzłów chłonnych z różnych grup. Średnia liczba węzłów nadesłanych do badania śródoperacyjnego wynosiła ok. 3. Najmniejsza liczba obejmowała 1 węzeł, największa 8 fragmentów.
Z każdego otrzymanego fragmentu węzła wykonywano po 2 preparaty cytologiczne, tzw. „odbitkowe”, z obu powierzchni wycinka oraz preparat mrożony.
Badania zgodne stanowiły 99,8% (492 przypadki). W 436 badaniach nie stwierdzono przerzutów nowotworowych, w 50 rozpoznano przerzuty raka niedrobnokomórkowego, w 5 naciek chłoniaka. W jednym węźle przerzuty stwierdzono wyłącznie w preparatach cytologicznych, natomiast w mrożonych i wykonanych z parafiny zmian nowotworowych nie znaleziono. Również w jednym przypadku przerzuty rozpoznane w badaniu cytologicznym nie zostały uwidocznione w preparatach mrożonych. Natomiast znaleziono je w wycinkach badanych standardowo, po utrwaleniu. Zmiany odpowiadały mikroprzerzutom.
Jedno badanie było fałszywie ujemne (0,1%) i 1 fałszywie dodatnie (0,1%). Badanie fałszywie ujemne nie miało wpływu na dalsze postępowania chirurgiczne, bowiem
w pozostałych węzłach chłonnych stwierdzono przerzuty nowotworowe. W badaniu fałszywie dodatnim w rozmazach cytologicznych odczynowo zmienione histiocyty rozpoznano jako komórki nowotworowe (tab. VIII). Nieprawidłowy wynik nie spowodował istotnej zmiany w postępowaniu chirurgicznym, bowiem u chorego nie podejmowano rozleglejszego zabiegu operacyjnego ze względu na obciążenia chorobami kardiologicznymi i urologicznymi.

Badanie śródoperacyjne zmian w śródpiersiu
Diagnostyka śródoperacyjna zmian w śródpiersiu obejmowała 15 przypadków, na które składało się 19 badań doraźnych. Celem większości była tylko ocena przydatności pobranego materiału do dalszej, rutynowej oceny histopatologicznej. W przebadanym materiale nie było rozpoznań fałszywie ujemnych ani fałszywie dodatnich. W 2 przypadkach badanie odroczono do czasu wykonania preparatów parafinowych, gdyż konieczna była dalsza diagnostyka immunohistochemiczna. W obu przypadkach sugerowano rozrost złośliwy, najprawdopdobniej mięsaka maziówkowego, potwierdzony dalszymi badaniami dodatkowymi (tab. IX).

Pozostałe badania śródoperacyjne
Pozostałe badania śródoperacyjne obejmowały 8 przypadków, w których wykonano 11 badań doraźnych. Materiał pochodził m.in. z tarczycy, sieci, tkanek miękkich okolicy szyi, ze zmiany w ścianie klatki piersiowej, z guza przepony. We wszystkich przypadkach stwierdzono całkowitą zgodność pomiędzy rozpoznaniem śródoperacyjnym i ostatecznym.

Podsumowanie wyników
Całkowita liczba badań śródoperacyjnych wyniosła 905. Badania zgodne z wynikiem ostatecznym stanowiły 888 (98,2%) przypadków, natomiast badania odroczone 11 (1,2%), fałszywie ujemne 4 (0,4%), fałszywie dodatnie 2 (0,2%). Trzy badania miały istotne konsekwencje dla chorych (0,3%). Jedno z badań odroczonych i fałszywie ujemnych spowodowało opóźnienie radykalnego zabiegu chirurgicznego. Wśród badań fałszywie dodatnich 1 miało istotne konsekwencje dla chorego (0,1%). Drugie badanie, mimo nieprawidłowego rozpoznania, nie zmieniło postępowania chirurgicznego, gdyż ze względu na zaawansowanie chorób dodatkowych nie podjęto rozleglejszego zabiegu operacyjnego (tab. X).
W przeprowadzonej analizie stwierdzono wysoką swoistość badania śródoperacyjnego, wynoszącą 99,7% i czułość 98,2%.

Dyskusja
Technika badania śródoperacyjnego ma ponad 100 lat i jest powszechnie stosowana w diagnostyce, przede wszystkim onkologicznej [5]. Żadna interwencja chirurgiczna w procesie leczenia chorób nowotworowych nie powinna być podejmowana bez możliwości wykonania tego typu badania. Pozwala ono nie tylko na ustalenie rozpoznania (w niektórych przypadkach) oraz stopnia zaawansowania choroby, ale również na określenie doszczętności onkologicznej wykonanej resekcji.

Diagnostyka śródoperacyjna ogniskowych zmian w płucu

Badanie śródoperacyjne w chorobach płuc jest szczególnie przydatne w diagnostyce zmian guzkowych, tzw. cieni okrągłych, stwierdzanych badaniem radiologicznym klatki piersiowej [1, 6]. Stosowanie coraz czulszych, dokładniejszych technik obrazowych zdecydowanie zwiększa wykrywalność małych ognisk, jednocentymetrowych i mniejszych – dwu-, a nawet jednomilimetrowych, które wymagają weryfikacji histopatologicznej [6]. Podstawowym celem badania jest różnicowanie pomiędzy nowotworem łagodnym
a złośliwym oraz ze zmianami nienowotworowymi, głównie zapalnymi, infekcyjnymi, węzłami chłonnymi wewnątrzpłucnymi. Czasami, zwłaszcza w rozrostach nowotworowych, konieczna jest także ocena marginesów chirurgicznych doszczętności zabiegu oraz ustosunkowanie się, czy guz jest pierwotny czy przerzutowy [1]. Często bywa to bardzo trudne lub wręcz niemożliwe bez wykonania barwień dodatkowych, a zwłaszcza zastosowania panelu przeciwciał immunohistochemicznych oraz bez pełnych informacji dotyczących przebytej choroby lub chorób onkologicznych pacjenta, rozpoznania histopatologicznego zawierającego określenie typu nowotworu, stopnia zróżnicowania i zaawansowania, radykalności wykonanego zabiegu, stosowanego leczenia uzupełniającego. Najkorzystniejsze jest porównanie preparatów mikroskopowych z wcześniej usuniętej zmiany/zmian z aktualnie operowaną. Nie bez znaczenia jest również doświadczenie patologa wykonującego badanie doraźne [1, 6].
W przebadanym materiale Zakładu Patologii IGiChP prawidłowo rozpoznano 9 przypadków przerzutów nowotworowych do płuca z określeniem typu rozrostu. Wszyscy chorzy wcześniej przebyli zabiegi operacyjne usunięcia pierwotnych nowotworów złośliwych z różnych narządów. Dane o przeszłości onkologicznej pacjentów zostały przekazane wraz z materiałem przesłanym do badania śródoperacyjnego. Natomiast nie było możliwości porównania preparatów mikroskopowych. W jednym przypadku nie udało się udzielić odpowiedzi na pytanie, czy aktualnie operowany rak płaskonabłonkowy płuca jest nowotworem pierwotnym czy przerzutem wcześniej usuniętego raka krtani. Jest to zrozumiałe, gdyż raki płaskonabłonkowe obu narządów wykazują duże podobieństwo histologiczne i właściwie nie ma pewnych kryteriów rozróżnienia.
W 1 przypadku, u chorej po usunięciu piersi z powodu raka, badanie odroczono do czasu wykonania barwień immunohistochemicznych, z sugestią „rak, prawdopodobnie przerzut raka piersi”. Zabieg zakończono, wykonując segmentektomię z limfadenektomią. W badaniu ostatecznym rozpoznano przerzut raka piersi, bez zmian w węzłach chłonnych. Jedno z odroczonych badań dotyczące chorego po wcześniejszej operacji raka pęcherza moczowego miało istotne konsekwencje, spowodowało opóźnienie zabiegu usunięcia płata płuca. Badanie śródoperacyjne nie rozstrzygnęło, czy zmiana jest pierwotna czy jest przerzutem. Ostateczną odpowiedź uzależniono od wyników barwień immunohistochemicznych. Wykonane reakcje pozwoliły na rozpoznanie raka pierwotnego płuca.
Coraz częściej w sytuacjach, gdy istnieje konieczność różnicowania pierwotnego raka płuca z przerzutem, w diagnostyce śródoperacyjnej wykorzystuje się barwienia immunohistochemiczne. Nie zawsze są one możliwe do wykonania, gdyż nie wszystkie przeciwciała reagują z zamrożonym materiałem. Dobrym markerem, w wielu przypadkach pozwalającym na odróżnienie pierwotnego raka płuca, zwłaszcza gruczołowego, od przerzutu raka gruczołowego jest TTF1 (Thyroid Transcription Factor 1). Mankamentem stosowania reakcji immunohistochemicznych są nie tylko większe koszty, ale także dłuższy czas badania, a w związku z tym późniejsza odpowiedź [6, 7].
Istnieje wyraźna korelacja pomiędzy średnicą ogniskowej zmiany w płucu, wielkością wycinka pobranego do badania śródoperacyjnego a właściwą interpretacją mikroskopową. Prawidłowe rozpoznanie dla rozrostów mniejszych niż 1,1 cm wynosi 86,9% cm, zaś dla większych – od 1,1 do 1,5 cm – wzrasta do 94,1% [6]. Proces mrożenia powoduje duże uszkodzenia komórek, często bardziej nasilone
w drobnych wycinkach, a co się z tym wiąże, utrudnia ustalenie właściwej diagnozy. Ponadto w niektórych przypadkach wielkość zmiany jest jednym z arbitralnie przyjętych kryteriów złośliwości. Dotyczy to przede wszystkim różnicowania pomiędzy AAH (atypical adenomatous hyperplasia) a BAC (bronchioloalveolar carcinoma) oraz rozrostem komórek neuroendokrynnych (tumorlet) a rakowiakiem. Ogniska większe od 5 mm uznawane są odpowiednio za rozrost o typie BAC
i rakowiaka [9]. Wycinki mierzące od 5 do 10 mm często stanowią tzw. „szarą strefę”, trudną do jednoznacznego rozpoznania, gdyż nie zawsze można stwierdzić, czy proces nie jest rozleglejszy niż widoczny w materiale nadesłanym do badania doraźnego [6].
Podobne problemy związane są z różnicowaniem pomiędzy BAC a reaktywnym rozrostem nabłonka pneumocytów typu 2, który pojawia się w chorobach śródmiąższowych, zapaleniach śródmiąższowych płuc, włóknieniu miąższu płuc, ostrym rozlanym uszkodzeniu pęcherzyków płucnych (DAD – diffuse alveolar damage) spowodowanym ciężkimi infekcjami, zwłaszcza o podłożu wirusowym, przebytą rtg-terapią, chemioterapią.
W związku z tym ocena śródoperacyjna zmian odczynowych pneumocytów, różnicowanie z AAH i BAC są bardzo trudne lub wręcz niemożliwe. Rozpoznanie wymaga przebadania wielu wycinków pobranych z różnych miejsc, korelacji z danymi klinicznymi i obrazem radiologicznym. W przypadku jakichkolwiek wątpliwości, gdy zmiana jest niejednoznaczna, badanie należy odroczyć do czasu wykonania preparatów z materiału utrwalonego, informując operującego o „rozroście pneumocytów z cechami atypii”. Inną możliwością jest ponowne pobranie materiału do badania doraźnego [1, 6]. Problemy diagnostyczne pojawiają się także w przypadkach zmian objętych dużymi obszarami martwicy, która może powodować znaczne uszkodzenie zachowanych komórek, uniemożliwiając precyzyjną odpowiedź, czy proces ma charakter zapalny czy nowotworowy [1]. W związku z tym właściwsze jest pobranie wycinków z obwodu ogniska, a nie z części centralnej. W guzach zlokalizowanych obwodowo w płucu istotne jest przesłanie materiału z informacją, czy wycinek zawiera fragmenty opłucnej, a najlepiej pobranie go z miejsca niepokrytego opłucną. Ocena opłucnej jest bowiem bardzo ważna dla określenia stopnia zaawansowania raka płuca. Często konieczne jest wykonanie barwienia dodatkowego, pozwalającego prześledzić zachowanie ciągłości błon sprężystych opłucnej (EVG-elastc van Gieson).
Proces mrożenia może spowodować uszkodzenie opłucnej, utrudniając wykrycie nacieku nowotworowego, określenie jego głębokości.
W materiale Zakładu Patologii w jednym przypadku rozpoznano martwicę, nie określając jej charakteru. Natomiast w pozostałym po badaniu materiale stwierdzono fragmenty utkania raka niedrobnokomórkowego, co w efekcie spowodowało opóźnienie usunięcia płata płuca. W tym przypadku badanie fałszywie ujemne dla nowotworu wynikało z pobrania wycinka z centrum zmian martwiczych.
Diagnostyka śródoperacyjna ogniskowych zmian w płucach jest trudna również ze względu na ich dużą różnorodność. Poza rozrostami nowotworowymi pierwotnymi i prze-
rzutowymi, nabłonkowymi (rakami) i nienabłonkowymi (mięsakami, rozrostami limfoproliferacyjnymi), łagodnymi i złośliwymi, występują liczne procesy zapalne, które mogą imitować nowotworowe [10]. Nie zawsze w trakcie badania doraźnego udaje się ustalić rozpoznanie. W wątpliwych przypadkach dąży się przynajmniej do przybliżonej diagnozy z informacją, czy proces wykazuje cechy złośliwości. Często taka odpowiedź bywa wystarczająca dla operatora. We wszystkich wątpliwych przypadkach właściwa współpraca pomiędzy chirurgiem a patologiem może ułatwić podjęcie decyzji o dalszym sposobie postępowania [1, 6].
W materiale Zakładu Patologii zgodne rozpoznania zmian w płucach wynosiły 96,8%. Większość stanowiły raki niedrobnokomórkowe płuca oraz choroby nienowotworowe, głównie zapalne. Wśród guzów łagodnych najczęściej stwierdzany był hamartoma, którego obraz makroskopowy często jest tak charakterystyczny, że nie wymaga wykonywania preparatów mikroskopowych. Całkowitą zgodność rozpoznań stwierdzono również w przypadkach rakowiaków typowych i atypowych, ocenianych wspólnie, gdyż nie zawsze z małego, pojedynczego wycinka można precyzyjnie określić cechy mikroskopowe, a zwłaszcza liczbę figur podziału, stanowiące kryterium złośliwości. W pozostałych przypadkach rozpoznano przerzuty nowotworowe, rozrosty limfoproliferacyjne, rozrosty nowotworowe o niepewnym rokowaniu, a także zlokalizowany guz włóknisty, haemangioma sclerosans. W 2 przypadkach nowotworu złośliwego nie określono jego typu, co nie miało znaczenia dla postępowania chirurgicznego.
Stwierdzono 1 badanie fałszywie ujemne (0,3%) i 1 fałszywie dodatnie (0,3%). Obydwa miały istotne konsekwencje dla chorych. W pierwszym przypadku rozpoznanie wpłynęło na odroczenie radykalnej lobektomii, w drugim spowodowało usunięcie płata wraz z węzłami chłonnymi.

Ocena marginesu chirurgicznego w badaniu śródoperacyjnym zmian w płucach
W diagnostyce zmian płucnych, przede wszystkim raka, najczęściej badanym śródoperacyjnie marginesem jest brzeg chirurgiczny oskrzela. Natomiast w guzach zlokalizowanych obwodowo do oceny mikroskopowej przesyłane są fragmenty tkanek ściany klatki piersiowej lub miąższ płuca [1, 2].
Badanie śródoperacyjne brzegu oskrzelowego wykonuje się przede wszystkim w guzach położonych centralnie, zwłaszcza gdy znajdują się w pobliżu linii cięcia chirurgicznego, w przypadkach gdy margines wydaje się zmieniony oraz w nowotworach wywodzących się z gruczołów ślinowych, które zwykle zajmują duże oskrzela i często szerzą się przez ciągłość. Ocena ta jest niezwykle ważna, gdyż wolny od nacieku nowotworowego margines chirurgiczny zapewnia mniejszą szansę miejscowej wznowy procesu [11].
Optymalna długość marginesu oskrzela wynosi od 1,5 do 2 cm [12, 13]. Dla raków gruczołowych powinien on być dłuższy (co najmniej 2 cm), zaś dla raków płaskonabłonkowych wystarcza ok. 1,5 cm [11, 12]. Niektórzy uznają margines długości 3 cm za bezpieczny, niezależnie od typu histologicznego raka [11]. Dodatni margines chirurgiczny stwierdza się w 1,1% do 17% badanych przypadków resekcji nowotworów płuca. Niektórzy oceniają tę częstość nawet na 30,3% guzów centralnych.
Natomiast fałszywie dodatnie i fałszywie negatywne rozpoznania marginesu resekcji oskrzela stanowią aż 41,7% [1, 11]. Na ogół wynikają one z niewłaściwej oceny mikroskopowej zmian zajmujących oskrzele lub z braku diagnostycznego materiału w wycinkach. Największe trudności sprawia różnicowanie pomiędzy naciekiem nisko zróżnicowanego raka, raka drobnokomórkowego, rakowiaka z przewlekłymi zmianami zapalnymi lub odwrotnie, zwłaszcza gdy zmiany lokalizują się w tkance okołooskrzelowej, oraz odróżnienie metaplazji płaskonabłonkowej nabłonka oskrzelowego od dysplazji i nacieku raka, głównie in situ, nowotworów wywodzących się z gruczołów błony śluzowej oskrzela (raka gruczołowo-torbielowatego, raka śluzowo-naskórkowego) od prawidłowych zrazików gruczołowych oskrzela. Również zmiany po rtg-terapii, które powodują uszkodzenie nabłonka oskrzelowego, mogą sugerować rozrost nowotworowy [1].
Naciek nowotworowy może zajmować tylko błonę śluzową oskrzela, szerzyć się pozaśluzówkowo, obejmując tkankę okołooskrzelową bądź powodować zatory w naczyniach limfatycznych śluzówki oskrzela. Zajęcie błony śluzowej lub tkanek okołooskrzelowych wiąże się z gorszym rokowaniem w porównaniu z rakiem in situ. Również stwierdzenie zatorów nowotworowych w naczyniach limfatycznych marginesu oskrzela jest czynnikiem niekorzystnym rokowniczo [11, 14, 15]. Dlatego w każdym przypadku stwierdzenia nacieku nowotworowego w ścianie oskrzela marginesu chirurgicznego istotne jest dokładne określenie jego lokalizacji.
W materiale przebadanym w Zakładzie Patologii zgodne badania wynosiły 98,3%. Wśród nich 39,7% stanowiło rozpoznanie nacieku raka. W jednym przypadku rozpoznano dysplazję nabłonka, potwierdzoną późniejszym badaniem z bloczków parafinowych. Nie było wyników fałszywie dodatnich i ujemnych. Jedno badanie zostało odroczone, jednak bez wpływu na postępowanie chirurgiczne, ze względu na brak możliwości poszerzenia zabiegu operacyjnego.

Ocena śródoperacyjna wycinków z opłucnej płucnej

Interpretacja skrawków mrożonych pochodzących z opłucnej wymaga odróżnienia nacieku nowotworowego od zmian odczynowych, zapalnych zajmujących opłucną oraz rozrostu międzybłoniaka złośliwego od nacieku lub przerzutów raka. W wielu przypadkach niezbędne jest wykonanie reakcji immunohistochemicznych ze skrawków parafinowych, co wiąże się z koniecznością odroczenia badania śródoperacyjnego [3].
Zdarza się, że łagodne zmiany nowotworowe, zapalne powodują pogrubienie i włóknienie opłucnej, niekiedy
z martwicą, reaktywnym rozrostem międzybłonka, co może imitować złośliwy proces nowotworowy. Z kolei nowotwory opłucnej zarówno pierwotne, jak i przerzutowe mogą wywoływać wtórne zmiany, przypominające proces zapalny, odczynowy. Zbyt powierzchownie pobrane wycinki bywają przyczyną fałszywie ujemnych rozpoznań.
Fielding i wsp., analizując skuteczność badań doraźnych materiału pobranego z opłucnej, stwierdzili, że właściwe rozpoznanie łagodnego rozrostu ustalono w 9 przypadkach na 10 potwierdzonych badaniem ostatecznym, natomiast tylko w 6 przypadkach na 10 zdiagnozowano proces złośliwy. Niewłaściwe rozpoznania wynikały ze zbyt małych lub powierzchownie pobranych wycinków, podczas gdy rozrost nowotworowy znajdował się w pozostałym materiale nadesłanym do ostatecznego badania [3].
W materiale weryfikowanym w Zakładzie Patologii IGiChP większość wyników histopatologicznych była zgodna. Nie stwierdzono badań fałszywie dodatnich, natomiast 2 były fałszywie ujemne, związane ze zbyt powierzchownym chirurgicznym pobraniem wycinków. W obu przypadkach, mimo braku konkluzywnej odpowiedzi, ze względu na obraz kliniczno-radiologiczny przemawiający za zaawansowanym procesem nowotworowym, zdecydowano się na wykonanie zabiegu chirurgicznego. W 1. przypadku usunięto guz okolicy przykręgosłupowej wraz z opłucną ścienną.
W badaniu ze skrawków parafinowych, po wykonaniu reakcji immunohistochemicznych, rozpoznano leiomyosarcoma. W 2. przypadku wykonano tylko zabieg paliatywny. W końcowej ocenie mikroskopowej stwierdzono utkanie międzybłoniaka złośliwego mięsakowego.

Diagnostyka śródoperacyjna węzłów chłonnych śródpiersia

Badanie mikroskopowe węzłów chłonnych śródpiersia u chorych z guzem płuca jest istotne dla określenia stopnia zaawansowania raka płuca. Pomimo rozwoju nowoczesnych technik radiologicznych, spiralnej tomografii komputerowowej, PET, które pozwalają na bardzo dokładną ocenę węzłów chłonnych, ciągle najczulszą metodą pozostaje badanie śródoperacyjne [16, 17]. Powiększenie węzłów chłonnych widoczne w badaniach obrazowych nie zawsze spowodowane jest istnieniem przerzutów. W rakach płaskonabłonkowych, które częściej rozrastają się wewnątrzoskrzelowo, powodując obturację światła oskrzela z następową niedodmą i zapaleniem w obrębie drenowanego miąższu płuca, powiększone węzły często wykazują jedynie zmiany reaktywne, czasami o typie rozrostu histiocytów lub odczynu ziarniniakowego, tzw. sarkoidalnego. Natomiast w rakach gruczołowych płuca, które na ogół lokalizują się obwodowo, węzły chłonne mogą być małe, mimo występowania w nich przerzutów nowotworowych.
Negatywna mediastinoskopia, potwierdzona badaniem śródoperacyjnym, pozwala na jednoczasowe wykonanie torakotomii z usunięciem guza płuca, co zaoszczędza choremu kolejnego znieczulenia i ponownego zabiegu operacyjnego [16, 17].
Najczęstsze problemy w diagnostyce śródoperacyjnej węzłów chłonnych śródpiersia związane są z rozpoznaniem przerzutów raka drobnokomórkowego, nisko zróżnicowanych raków niedrobnokomórkowych, z różnicowaniem zmian przebiegających z rozległą martwicą lub wynikających z przebytej chemio- i radioterapii. Trudności mogą również przysparzać procesy nienowotworowe, zarówno zapalne, jak i odczynowe oraz zmiany związane z mechanicznym uszkodzeniem komórek, zgnieceniem [4]. Problem stwarzają drobne ogniska przerzutowe, tzw. mikroprzerzuty, łatwe do przeoczenia w skrawkach mrożonych. Metodą ułatwiającą ich wykrycie jest cytologia odbitkowa [17, 18]. Umożliwia ona wykonanie rozmazów z kilku powierzchni węzła oraz pozwala na uniknięcie uszkodzenia komórek związanego z mrożeniem. Metoda ta wykazuje bardzo wysoką czułość – 92–99% i swoistość – 100% [17]. W dużym materiale opracowanym przez de Montpréville’a i wsp., obejmującym 202 przypadki, tylko w 2 odpowiedź była fałszywie negatywna. Dotyczyły one chorego po chemioterapii oraz chorego z płynem w opłucnej bez wyraźnej zmiany
w płucu. W obu przypadkach w węzłach chłonnych stwierdzono mikroprzerzuty. Fałszywe rozpoznania nie miały konsekwencji dla dalszego sposobu postępowania chirurgicznego. Natomiast wśród 67 przypadków, w których
w badaniu końcowym nie stwierdzono przerzutów, w 1 śródoperacyjnie rozpoznano zgnieciony naciek raka drobnokomórkowego (badanie fałszywie dodatnie) [4].
W retrospektywnie ocenianym materiale Zakładu Patologii IGiChP zgodność rozpoznań zmian w węzłach chłonnych wynosiła 99,8%. Przerzuty niedrobnokomórkowego raka rozpoznano w 50 przypadkach, w 5 znaleziono naciek chłoniaka. W 2 przypadkach rozpoznanie ustalono wyłącznie w oparciu o badanie cytologiczne. W 1. z nich komórek raka nie znaleziono ani w preparatach mrożonych, ani w wykonanych z bloczków parafinowych, skrawanych seryjnie i dodatkowo barwionych immunohistochemicznie cytokeratyną, która pozwala na wykrycie pojedynczych komórek raka. Natomiast w 2. komórki nowotworowe stwierdzono
w preparatach parafinowych. W obu przypadkach rozpoznano mikroprzerzuty raka niedrobnokomórkowego płuca.
Niezgodne badania stanowiły 0,2%, 1 było fałszywie ujemne i 1 fałszywie dodatnie. Obydwa nie miały istotnych konsekwencji dla chorych. W badaniu fałszywie ujemnym małe skupienie komórek raka wykryto dopiero w preparatach wykonanych z bloczków parafinowych. Być może przyczyną negatywnej odpowiedzi śródoperacyjnej było zbyt drobne ognisko przerzutu, które znajdowało się w głębszych warstwach węzła. W pozostałych węzłach chłonnych, ocenianych badaniem doraźnym, stwierdzono przerzuty raka, zarówno badaniem cytologicznym, jak i mrożonym.
Natomiast badanie fałszywie dodatnie związane było
z niewłaściwą interpretacją odbitek cytologicznych, w których zmienione komórki histiocytarne uznano za nowotworowe.
Nieprawidłowy wynik nie spowodował istotnej zmiany w postępowaniu chirurgicznym, bowiem u pacjenta nie podejmowano rozleglejszego zabiegu operacyjnego ze względu na obciążenia chorobami kardiologicznymi i urologicznymi.

Diagnostyka śródoperacyjna zmian w śródpiersiu
W diagnostyce śródoperacyjnej zmian śródpiersia niezwykle istotne są dokładne dane kliniczne dotyczące nie tylko przebiegu choroby, ale przede wszystkim jej lokalizacji, obrazu radiologicznego, tomografii komputerowej. Informacje te często ułatwiają rozpoznanie śródoperacyjne. Wynika to z faktu, że w różnych obszarach śródpiersia występują odmienne nowotwory i procesy nienowotworowe [4].
W śródpiersiu przednim i górnym zwykle rozwijają się grasiczaki, raki i torbiele grasicy, guzy z komórek rozrodczych, chłoniaki, najczęściej pierwotny śródpiersia, limfoblastyczny z komórek T, anaplastyczne, ziarnica złośliwa oraz rozrosty tarczycy, przytarczyc i rzadsze nowotwory nienabłonkowe, paraganglioma, naczyniaki, tłuszczaki. Mogą również występować zmiany zapalne, o typie mediastintis, z włóknieniem, powiększone węzły chłonne, zmienione przerzutowo lub odczynowo, z ziarniniakami przypominającymi sarkoidalne, z martwicą lub włóknieniem [4, 19].
W śródpiersiu środkowym najczęściej pojawiają się torbiele, przede wszystkim osierdziowa, oskrzelowa oraz rozrosty limfoproliferacyjne, natomiast w śródpiersiu tylnym głównie nowotwory pochodzenia nerwowego, rzadziej torbiele wywodzące się z cewy pokarmowej (typu żołądkowo-jelitowego [19].
Diagnostyka śródoperacyjna zmian w śródpiersiu jest trudna, przede wszystkim ze względu na rzadkie występowanie tych chorób. Rozpoznanie i różnicowanie, zwłaszcza rozrostów nowotworowych nienabłonkowych, rozrostów z układu chłonnego, często wymaga odroczenia badania, wykonania reakcji immunohistochemicznych. W wielu przypadkach wystarczająca jest informacja o przydatności pobranego śródoperacyjnie materiału do dalszej diagnostyki mikroskopowej z sugestią co do charakteru zmiany [4].
W materiale Zakładu Patologii większość wyników śródoperacyjnych określała przydatność wycinków do badań histopatologicznych ze wstępnym rozpoznaniem. Na ogół były to złośliwe rozrosty limfoproliferacyjne oraz kilka przypadków zmian zapalnych. Pozostałe zgodne badania obejmowały ziarnicę złośliwą, raki niedrobnokomórkowe, grasiczaki i łagodne nowotwory nienabłonkowe. W 2 badaniach odroczonych, wymagających wykonania barwień immunohistochemicznych, wstępnie rozpoznano rozrost złośliwy nienabłonkowy (najprawdopodobniej mięsak maziówkowy), potwierdzony późniejszymi badaniami dodatkowymi. Odpowiedź śródoperacyjna zawierająca informację o procesie złośliwym była wystarczająca dla operującego zespołu.

Podsumowanie

Wyniki badań przeprowadzonych przez College of American Pathologists w oparciu o 90 538 badań śródoperacyjnych wykazały zgodne rozpoznania w 98,58% przypadków, a tylko w 1,42% rozbieżność z badaniem ostatecznym. Wynikała ona z niewłaściwej interpretacji mrożonych preparatów (31,8%), wykrycia diagnostycznego materiału
w badaniu ostatecznym materiału śródoperacyjnego, niestwierdzonego w preparatach mrożonych (30%), z obecności materiału diagnostycznego w części nadesłanej do badania ostatecznego, która nie została pobrana do badania doraźnego (31,4%). Wśród rozbieżnych rozpoznań 67,8% było fałszywie negatywnych dla nowotworu, a pozostałe były fałszywie pozytywne [5, 20].
Ferreiro i wsp. wśród 24 880 przypadków obejmujących 97 914 badań śródoperacyjnych, w 97,8% stwierdzili całkowitą zgodność z badaniem ostatecznym. Wśród pozostałych 2,2% nieprawidłowych rozpoznań 1,6% związanych było z pobraniem wycinka z niewłaściwego miejsca, 0,5%
z niewłaściwą interpretacją zmian, zaś w 0,1% rozpoznanie było błędne, odmienne niż w badaniu ostatecznym [21].
W prezentowanej pracy, w której przeanalizowano 539 przypadków, zawierających 905 badań śródoperacyjnych, całkowitą zgodność stwierdzono w 98,2%. Pozostałe 1,8% przypadków obejmowało badania odroczone (1,2%), fałszywie dodatnie, związane z niewłaściwą interpretacją zmiany (0,2%) i fałszywie ujemne, wynikające z pobrania wycinka z nieodpowiedniego miejsca (0,4%). Badania, które miały istotne konsekwencje dla chorych, stanowiły 0,3%. Jedno z nich związane było z pobraniem wycinka z niewłaściwego miejsca (0,1%), kolejne odroczono w związku z koniecznością wykonania barwień immunohistochemicznych (0,1%), następne wynikało z niewłaściwej interpretacji zmiany (0,1%). Badania odmienne niż w rozpoznaniu ostatecznym wynosiły 0,2%. Badania śródoperacyjne cechowała wysoka swoistość, wynosząca 99,7% i czułość 98,2%.
Badanie śródoperacyjne jest trudnym badaniem, w którym nieprawidłowe rozpoznanie może wynikać z pobrania wycinka z niewłaściwego miejsca, z braku diagnostycznego materiału nadesłanego do oceny, z niedostatecznych danych klinicznych i radiologicznych, jak również z błędnej interpretacji mikroskopowej. Niezwykle istotna jest właściwa współpraca pomiędzy chirurgiem a patologiem, zrozumienie wskazań, możliwości, ograniczeń i trudności, jakie wiążą się z badaniem śródoperacyjnym. Odpowiednio pobrany, reprezentatywny materiał, z wyczerpującymi danymi klinicznymi, ułatwia ustalenie rozpoznania mikroskopowego w krótszym czasie, pozwala na uniknięcie błędów diagnostycznych, które mogą mieć dramatyczne konsekwencje dla chorego.

Piśmiennictwo
1. Sienko A, Allen TC, Zander DS, Cagle PT. Frozen section of lung specimens. Arch Pathol Lab Med 2005; 129: 1602-1609.
2. Rosai J. Introduction. In: Rosai J (ed.). Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. Mosby, 2004; 1-24.
3. Fielding D, Hopkins P, Serisier D. Frozen section of pleural biopsies at medical thoracoscopy assists in correctly identifying benign disease. Respirology 2005; 10: 636-642.
4. De Montpréville VT, Dulmet EM, Nashashibi N. Frozen section diagnosis and surgical biopsy of lymph nodes, tumors and pseudotumors of the mediastinum. Eur J Cardiothorac Surg 1997; 13: 190-195.
5. Gal AA, Cagle PT. The 100-year anniversary of the description of the frozen section procedure. JAMA 2005; 294: 3135-3137.
6. Marchevsky AM, Changsri C, Gupta I, Fuller C, Houck W, McKenna RJ Jr. Frozen section diagnoses of small pulmonary nodules: accuracy and clinical implications. Ann Thorac Surg 2004; 78: 1755-1759.
7. Butcher DN, Goldstraw P, Ladas G, Dusmet ME, Sheppard MN, Nicholson AG. Thyroid transcription factor 1 immunohistochemistry as an intraoperative diagnostic tool at frozen section for distinction between primary and secondary lung tumors. Arch Pathol Lab Med 2007; 131: 582-587.
8. Camilleri-Broet S, Alifano M, Morcos M, Comperat E, Magdeleinat P, Marmey B, Molina TJ, Régnard J-F, Audouin J. Peroperative frozen section analysis of TTF-1 antigen expression. J Clin Pathol 2004; 57: 98-100.
9. Travis W, Brambilla E, Muller-Hermelink HK, Harris C (eds). World Health Organization classification of tumours. Tumours of the lung, pleura, thymus and heart. Lyon, 2004.
10. Nashef SA, Kakadellis JG, Hasleton PS, Whittaker JS, Gregory CM, Jones MT. Histological examination of peroperative frozen sections in suspected lung cancer. Thorax 1993; 48: 388-389.
11. Maygarden SJ, Detterbeck FC, Funkhouser WK. Bronchial margins in lung cancer resection specimens: utility of frozen section and gross evaluation. Mod Pathol 2004; 17: 1080-1086.
12. Kara M, Sak SD, Orhan D, Yavuzer S. Changing patterns of lung cancer; (3/4 in.) 1.9 cm; still a safe length for bronchial resection margin? Lung Cancer 2000; 30: 161-168.
13. Kara M, Dizbay Sak S, Orhan D, Kavukçu S. Proximal bronchial extension with special reference to tumor localization in non-small cell lung cancer. Eur J Cardiothorac Surg 2001; 20: 350-355.
14. Soorae AS, Stevenson HM. Survival with residual tumor on the bronchial margin after resection for bronchogenic carcinoma. J Thorac Cardiovasc Surg 1979; 78: 175-180.
15. Snijder RJ, Brutel de la Rivière A, Elbers HJ, van den Bosch JM. Survival in resected stage I lung cancer with residual tumor at the bronchial resection margin. Ann Thorac Surg 1998; 65: 212-216.
16. Gephardt GN, Rice TW. Utility of frozen-section evaluation of lymph nodes in the staging of bronchogenic carcinoma at mediastinoscopy and thoracotomy. J Thorac Cardiovasc Surg 1990; 100: 853-859.
17. Okubo K, Kato T, Hara A, Yoshimi N, Takeda K, Iwao F. Imprint cytology for detecting metastasis of lung cancer in mediastinal lymph nodes. Ann Thorac Surg 2004; 78: 1190-1193.
18. Orki A, Tezel C, Kosar A, Ersev AA, Dudu C, Arman B. Feasibility of imprint cytology for evaluation of mediastinal lymph nodes in lung cancer. Jpn J Clin Oncol 2006; 36: 76-79.
19. Moran CA, Suster S. Recent advances in mediastinal pathology. Sem Diag Pathol 1999; 16: 1-78.
20. Gephardt GN, Zarbo RJ. Interinstitutional comparison of frozen section consultations. A college of American Pathologists Q-Probes study of 90,538 cases in 461 institutions. Arch Pathol Lab Med 1996; 120: 804-809.
21. Ferreiro JA, Myers JL, Bostwick DG. Accuracy of frozen section diagnosis in surgical pathology: review of a 1-year experience with 24,880 cases at Mayo Clinic Rochester. Mayo Clin Proc 1995; 70: 1137-1141.