Torakochirurgia
Measurement of activity of glutathione peroxidase (GPX) and superoxide dismutase (SOD) in diagnosis of diffuse lung diseases

Wstęp

We współczesnej pulmonologii rozsiane zmiany miąższowe płuc (RZMP) stanowią istotny problem zarówno diagnostyczny, jak i leczniczy. Uogólniony wysiew prosowaty towarzyszy wielu chorobom płuc. Według piśmiennictwa istnieje ponad 150 przyczyn zmian rozsianych płuc. Do najczęstszych przyczyn RZMP zaliczamy: sarkoidozę, gruźlicę płuc, samoistne włóknienie płuc, eozynofilowe zapalenie płuc, ziarniniakowatość Langerhansa, pylicę płuc, ziarnicę złośliwą, zaawansowaną postać raka płuca, zmiany przerzutowe, kolagenozy i wiele innych. Schorzenia te wiążą się ze stresem oksydacyjnym, który prowadzi do powstania wolnych rodników tlenowych (WRT), mogących powodować wiele zaburzeń na poziomie komórkowym [1, 2].
Wolne rodniki tlenowe są cząsteczkami nietrwałymi i wysoko reaktywnymi, w związku z tym mogą pełnić rolę reduktorów lub utleniaczy. Najbardziej reaktywne są rodniki hydroksylowe (OH-), prowadzą one do modyfikacji DNA jądrowego i mitochondrialnego. WRT w organizmie pochodzą zarówno ze środowiska zewnętrznego, jak i tworzą się w wyniku reakcji endogennych. Do reakcji endogennych prowadzących do powstania WRT zaliczymy m.in. reakcję redukcji tlenu cząsteczkowego, a do czynników egzogennych: dym papierosowy, metale ciężkie, azbest, promieniowanie jonizujące, leki i wiele innych substancji [3–5].
Antyoksydanty to substancje, które w znaczącym stopniu hamują lub zatrzymują oksydację utlenowanego substratu. Organizm ludzki funkcjonuje sprawnie jedynie wtedy, gdy mechanizmy obronne, jakimi są antyoksydanty, są sprawne. Antyoksydanty działają wielokierunkowo. Na pierwszy plan wysuwa się działanie antyoksydantów prewencyjnych, polegające na zapobieganiu powstawaniu WRT oraz niedopuszczeniu do ich oddziaływania na związki biologiczne. Zaliczamy do nich enzymy antyoksydacyjne (np. peroksydaza glutationowa i dysmutaza ponadtlenkowa) i białka, które łączą się z jonami pierwiastków przejściowych. Peroksydaza glutationowa (GPX) powoduje, iż dochodzi do redukcji nadtlenku wodoru przy jednoczesnym przekształceniu w postać utlenioną zredukowanego glutationu. Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) z kolei jest katalizatorem dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego do nadtlenku wodoru [5, 6].


Cel pracy

Celem pracy było określenie zależności między aktywnością peroksydazy glutationowej i dysmutazy ponadtlenkowej w hemolizacie erytrocytarnym i ekstrakcie z miąższu płuca a etiologią rozsianych zmian miąższowych płuc.


Materiał i metody

Grupę badaną stanowili pacjenci (40 osób) z RZMP zakwalifikowani do wideotorakoskopii (VTS) w celu uzyskania materiału do badania histopatologicznego. Średni wiek badanych wynosił 57,9 lat, kobiety stanowiły 55% (22 osoby), mężczyźni 45% (18 osób). Wywiad rodzinny w kierunku występowania choroby nowotworowej był dodatni u 20 osób. Grupę odniesienia stanowili zdrowi klinicznie ochotnicy (40 osób). Średni wiek badanych wynosił 57,75 lat, kobiety stanowiły 60% (24 osoby), mężczyźni 40% (16 osób). Wywiad rodzinny w kierunku występowania choroby nowotworowej był dodatni u 13 osób. Przeprowadzano oznaczenia aktywności SOD i GPX w hemolizacie erytrocytarnym i ekstrakcie z miąższu płuca (tylko grupa badana). Krew żylną pobierano jednorazowo w ilości 5,4 ml do dwóch probówek 2,7 ml z EDTA, a następnie poddawano obróbce laboratoryjnej. Oceniano również aktywność SOD i GPX we fragmencie miąższu płuca pobranego w trakcie VTS przeznaczonego do badania histopatologicznego. W przypadku potwierdzenia rozrostu nowotworowego wykonywano dodatkowo pulmonektomię lub lobektomię. Z materiału uzyskanego w ten sposób pobierano dodatkowo fragment klinicznie zdrowego miąższu płuca.
Obliczenia wykonano z wykorzystaniem licencjonowanej wersji pakietu statystycznego STATISTICA PL 7.0.


Wyniki

W grupie badanej uzyskano następujące wyniki badania histopatologicznego: rak płuca 22 osoby, sarkoidoza 18 osób.
Analizując grupę odniesienia i badaną ze względu na aktywność SOD w hemolizacie erytrocytarnym, uzyskano następujące wyniki. Wśród osób zdrowych niższe wartości SOD (średnia = 13,936 z odchyleniem standardowym = 4,298) niż w grupie z rakiem płuca (średnia = 30,951 z odchyleniem standardowym = 2,696). W grupie z rakiem płuca w stosunku do osób zdrowych obserwujemy dwukrotny wzrost SOD (o 122,09 %). Zaobserwowano również, iż wśród osób zdrowych niższe wartości SOD (średnia = 13,936 z odchyleniem standardowym = 4,298) niż w grupie z sarkoidozą (średnia
= 21,134 z odchyleniem standardowym = 2,245). W grupie z sarkoidozą w stosunku do osób zdrowych obserwujemy wzrost SOD o 51,65%. Wśród osób z rakiem płuca uzyskujemy wyższe wartości SOD (średnia = 30,951 z odchyleniem standardowym = 2,696) niż w grupie z sarkoidozą (średnia
= 21,134 z odchyleniem standardowym = 2,245). W grupie z rakiem w stosunku do osób z sarkoidozą obserwujemy wzrost SOD o 46,45 %. Powyższe wartości przedstawia rycina 1.
Analizując grupę odniesienia i badaną ze względu na aktywność GPX w hemolizacie erytrocytarnym, uzyskano następujące wyniki. Wśród osób zdrowych wyższe wartości GPX (średnia = 41,232 z odchyleniem standardowym = 3,909) niż w grupie z rakiem płuca (średnia = 26,868 z odchyleniem standardowym = 2,567). W grupie z rakiem płuca w stosunku do osób zdrowych obserwujemy spadek GPX o 34,84%. Wśród osób zdrowych uzyskujemy wyższe wartości GPX (średnia = 41,232 z odchyleniem standardowym = 3,909) niż w grupie z sarkoidozą (średnia = 32,341 z odchyleniem standardowym = 1,221). W grupie z sarkoidozą w stosunku do osób zdrowych obserwujemy spadek GPX o 21,56%. Wśród osób z rakiem płuca uzyskujemy niższe wartości GPX (średnia = 26,868 z odchyleniem standardowym = 2,567) niż w grupie z sarkoidozą (średnia = 32,341 z odchyleniem standardowym = 1,221). W grupie z rakiem w stosunku do osób z sarkoidozą obserwujemy spadek GPX o 16,92%. Powyższe wartości przedstawia rycina 2.
Różnice wykazano również w aktywności SOD w ekstrakcie miąższu płuca. Analizując wartości średnie, stwierdzamy, że w grupie z rakiem występują istotnie wyższe wartości SOD w porównaniu z grupą z sarkoidozą (w grupie z rakiem średnia wartość = 20,482 z odchyleniem 0,980, a w grupie z sarkoidozą średnia wartość = 14,202 z odchyleniem 0,781). W grupie z rakiem w stosunku do grupy z sarkoidozą obserwujemy wzrost SOD o 44,22%. Powyższe wartości przedstawia rycina 3.
W miąższu zdrowym klinicznie uzyskano istotnie niższe wartości SOD niż w tkance chorej. Wartości w tkance chorej są o dwa razy wyższe od wartości kontrolnych.
Grupy z rakiem płuc i z sarkoidozą różnią się również istotnie statystycznie ze względu na wartości GPX w ekstrakcie miąższu płuca. Analizując wartości średnie, stwierdzamy, że w grupie z rakiem uzyskujemy niższe wartości GPX w porównaniu z grupą z sarkoidozą (w grupie z rakiem średnia wartość = 33,659 z odchyleniem 2,745, a w grupie z sarkoidozą średnia wartość = 45,488 z odchyleniem 1,198). W grupie z rakiem w stosunku do grupy z sarkoidozą obserwujemy spadek GPX o 26%. Powyższe wartości przedstawia rycina 4.
W miąższu zdrowym klinicznie uzyskano istotnie wyższe wartości GPX niż w tkance chorej. Wartości w tkance chorej są o 40,17% niższe od wartości kontrolnych.


Dyskusja

Problem diagnostyki zmian rozsianych płuc był przedmiotem licznych prac naukowych. Jednak badania nad wykorzystaniem VTS, aktywności SOD i GPX w celu postawienia właściwego rozpoznania RZMP są jednymi z mniej poznanych zagadnień. Przeglądając piśmiennictwo ogólnoświatowe, nie spotkamy się z wieloma doniesieniami traktującymi łącznie o tych zagadnieniach. RZP ze względu na podobny obraz
kliniczny i radiologiczny stanowią istotny problem w ich różnicowaniu, diagnostyce i leczeniu. Bez ostatecznej weryfikacji histopatologicznej nie jest możliwe postawienie prawidłowego rozpoznania, a co za tym idzie, wdrożenie właściwego
leczenia.
Miąższ płuca chroniony jest przed WRT przez system antyoksydacyjny, między innymi SOD, która eliminuje O2–, a w konsekwencji zapobiega powstaniu kolejnych WRT, a więc wpływa również na proces transformacji nowotworowej [3, 5]. W swojej pracy Ho [6] przedstawia istotny wzrost aktywności SOD w ekstrakcie miąższu płuca pacjentów z rakiem płuca – w stosunku do zdrowej tkanki szacowany jest on na około 200%. Analizy Northern i Western blotting wykazały, że zależność ta zależna jest głównie od MnSOD, której aktywność znacząco wzrasta u pacjentów z rakiem płuca. Grupę badaną stanowiło 16 osób z rakiem płuca, grupę kontrolną 24 osoby, od których pobrano miąższ płuca z innych względów (np. rozedma). Ho tłumaczy wyniki swoich badań, wiążąc je z WRT. W przypadku działania na tkankę płucną zwiększonych ilości WRT aktywność naturalnej pierwszej bariery antyoksydacyjnej -SOD wzrasta. Wiąże się to ze zwiększoną liczbą powstających cząsteczek nadtlenku wodoru, które ze względu na brak wzrostu aktywności GPX nie są redukowane do cząsteczek wody. Prowadzi to do uszkodzeń DNA komórki lub jej śmierci.
Lakari [7] wykazuje wzrost aktywności MnSOD w przewlekłych chorobach miąższu płuca (sarkoidoza) i u osób palących papierosy w porównaniu ze zdrowymi tkankami. Różnice dotyczą przede wszystkim pneumocytów II, makrofagów pęcherzykowych i ziarniniaków. Zaznacza równocześnie, że większość pacjentów z RZMP jest nałogowymi palaczami papierosów. Sugeruje, że wysoka aktywność MnSOD odgrywa istotną rolę w protekcji płuc, w szczególności pneumocytów II przed progresją zmian śródmiąższowych płuc.
W innej pracy Lakari [8] potwierdza wzrost aktywności MnSOD w miąższu płuc i surowicy u pacjentów z sarkoidozą. Zależności te wykazał nie tylko w ziarniniakach, ale również w węzłach chłonnych. Wysoka aktywność MnSOD była też zauważona w próbkach pochodzących z BAL. Odwrotną zależność wykazano przy oznaczaniu CuZnSOD – aktywność była niższa w grupie badanej (sarkoidoza) w porównaniu z grupą kontrolną.
W badanym materiale porównywano aktywność SOD w miąższu płuca. W grupie z rakiem płuc uzyskano wyższe wartości SOD (o 44,22%) w porównaniu z grupą z sarkoidozą. Nie pobierano miąższu zdrowego klinicznie płuca od pacjentów z sarkoidozą. Wartości w tkance z rakiem są o dwa razy wyższe od wartości kontrolnych. W hemolizacie erytrocytarnym w grupie z rakiem płuca w stosunku do osób zdrowych obserwujemy dwukrotny wzrost SOD. W grupie z sarkoidozą w stosunku do osób zdrowych obserwujemy wzrost SOD o 51,65%. Uzyskane wyniki są zgodne z dostępnym
piśmiennictwem.
Kolejnym enzymem antyoksydacyjnym badanym w pracy była aktywność GPX, również w piśmiennictwie znajdujemy liczne doniesienia na ten temat. Badania dotyczące aktywności GPX w hemolizacie erytrocytarnym u pacjentów z rakiem płuc i w grupie kontrolnej przedstawił szczegółowo Zachara [9]. Zaobserwował on istotne statystycznie obniżenie (o około 20%) aktywności GPX w grupie badanej w porównaniu z grupą kontrolną. Badania przeprowadzał również na wycinkach z miąższu płuc: z guzem i klinicznie zdrowej tkance. Uzyskał 49-proc. wzrost aktywności GPX w tkance z rozrostem nowotworowym w porównaniu z tkanką niezmienioną.
Kolejnym badaczem zajmującym się aktywnością GPX w chorobach nowotworowych jest Oberley [10]. Uzyskał on wyniki świadczące o zależności pomiędzy typem nowotworu a wartością GPX. Właściwie we wszystkich rodzajach nowotworów oprócz gruczolaka nerki odnotował istotny spadek aktywności GPX.
Czeczoł [11] przeprowadził badania dotyczące aktywności GPX w tkance guza i surowicy krwi w grupie pacjentów z rakiem żołądka. Krew do badania pobierano dwukrotnie (dobę przed zabiegiem operacyjnym i tydzień po), uzyskując w obu próbkach spadek aktywności GPX w stosunku do grupy kontrolnej. W badaniach z użyciem tkanki guza zaobserwowano wzrost aktywności GPX w porównaniu ze zdrową tkanką.
W przeprowadzonym przez nas badaniu określano aktywność GPX w ekstrakcie z miąższu płuca i hemolizacie erytrocytarnym, uzyskując istotne statystycznie różnice. Uwidoczniono wyższe wartości GPX w hemolizacie erytrocytarnym w grupie odniesienia w porównaniu z grupą z rakiem płuc (o 34,8%) i z sarkoidozą (o 21,5%). W ekstrakcie miąższu płuc zaobserwowano niższe wartości GPX w grupie z rakiem płuc w porównaniu z grupą z sarkoidozą (o 26%). Porównując wartość GPX w ekstrakcie z miąższu płuca zdrowego i z rozrostem nowotworowym, uzyskano wyższe wartości (o 40,1%) w tkance zdrowej.
W piśmiennictwie możemy odnaleźć doniesienia zarówno potwierdzające, jak i zaprzeczające istotnemu spadkowi aktywności GPX w ekstrakcie z miąższu płuca w tkance z guzem w porównaniu ze zdrową tkanką. Wszyscy natomiast potwierdzają spadek aktywności GPX w homogenacie erytrocytarnym, co jest zgodne z naszymi badaniami. Badania na materiale własnym potwierdzają słuszność tezy o potrzebie dalszych badań dotyczących aktywności SOD i GPX. W przyszłości badania te mogą stać się istotne w zastosowaniu oznaczeń ww. enzymów jako markera występowania nowotworów płuc. Badania te w sposób mało inwazyjny dla pacjenta (jednorazowa próbka krwi) dawałyby odpowiedź na pytanie, czy występuje zwiększone ryzyko zachorowania danego pacjenta na raka płuc lub ich wyniki świadczyłyby o toczącym się już procesie nowotworzenia.


Wnioski

Oznaczanie aktywności GPX i SOD w hemolizacie erytrocytarnym jest dobrym dodatkowym badaniem laboratoryjnym pomocnym w określeniu etiologii RZMP mało obciążającym pacjenta.


Praca przedstawiona i wyróżniona podczas IV Kongresu Polskiego Towarzystwa Kardio-Torakochirurgów, Warszawa, 12–14 czerwca 2008 r.

Piśmiennictwo

1. Coultas DB, Zumwalt RE, Black WC, Sobonya RE. The epidemiology of interstitial lung diseases. Am J Respir Crit Care Med 1994; 150: 967-972.
2. Sheffield EA. Pathology of sarcoidosis. Clin Chest Med 1997; 18: 741-754.
3. Gutteridge JM, Halliwell B. Free radicals and antioxidants in the year 2000: a historical look to the future. Ann N Y Acad Sci 2000; 899: 136-147.
4. Halliwell B. Reactive oxygen species in living systems: source, biochemistry, and role in human disease. Am J Med 1991; 91: 14S-22S.
5. Collins AR. Oxidative DNA damage, antioxidants and cancer. Bioessays 1999; 21: 238-246.
6. Chung-man Ho J, Zheng S, Comhair SA, Farver C, Erzurum SC. Differential expression of manganese superoxide dismutase and catalase in lung cancer. Cancer Res 2001; 61: 8578-8585.
7. Lakari E, Paakko P, Pietarinen-Runtti P, Kinnula VL. Manganese superoxide
dismutase and catalase are coordinately expressed in the alveolar region
in chronic interstitial pneumonias and granulomatous diseases of the lung. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: 615-621.
8. Lakari E, Paakko P, Kinnula VL. Manganese superoxide dismutase, but not CuZn superoxide dismutase, is highly expressed in the granulomas of pulmonary sarcoidosis and extrinsic allergic alveolitis. Am J Respir Crit Care Med 1998; 158: 589-596.
9. Zachara BA, Marchaluk-Wisniewska E, Maciag A, Peplinski J, Skokowski J,
Lambrecht W. Decreased selenium concentration and glutathione peroxidase activity in blood and increase of these parameters in malignant tissue of lung cancer patients. Lung 1997; 175: 321-332.
10. Oberley TD. Oxidative damage and cancer. Am J Pathol 2002; 160: 403-408.
11. Czeczoł H, Ścibior D, Skrzycki M, Podsiad M, Porembska Z. Poziom glutationu i aktywność GSH-zależnych enzymów u chorych na raka żołądka – badania wstępne. Gastroenterologia 2005; 12: 107-111.