The correlation between genomic DNA total methylation and codon 12 K-ras gene point mutations in primary endometrial cancers

Metylacja dezoksycytozyny (dC) jest epigenetyczną i jedyną znaną dotychczas fizjologiczną modyfikacją DNA [12]. Polega ona na przyłączeniu reszty metylowej (CH₃-) do pierścienia pirymidynowego dC w pozycji 5 [11]. Reakcję powyższą katalizują specyficzne enzymy zwane metylotransferazami 5-cytozyny DNA [4, 8]. Zmiany metylacji DNA, zarówno w kierunku hipometylacji, jak i hipermetylacji są uznawane za jedne z najwcześniejszych zjawisk w onkogenezie [1]. Hipometylacja może powodować zwiększoną tendencję do mutacji i tym samym ułatwiać progresję procesu nowotworowego [3].

Ostatnio ustalono, że aktywność metylotransferazy DNA jest regulowana przez układ produktów protoonkogenów jądra komórkowego ras i jun (ang. Ras-Jun signaling pathway) [7, 9, 10]. Rodzina genów ras składa się z trzech genów H-ras, N-ras i K-ras [2]. Nabywają one własności onkogennych poprzez mutacje punktowe w regionach określanych jako gorące miejsca (ang. hot spots), występujących najczęściej w kodonach 12, 13, 59 i 61. Mutacje genu K-ras wykrywa się najczęściej w nowotworach typu gruczolakoraków w trzustce, okrężnicy, płucach i endometrium [2].

W dotychczas opublikowanych pracach brak jest danych na temat relacji pomiędzy mutacjami w genach rodziny ras a zakresem globalnej metylacji DNA.

Celem pracy było ustalenie ewentualnego związku pomiędzy mutacjami w kodonie 12 genu K-ras a zakresem metylacji totalnego genomowego DNA w rakach endometrium.


Materiał i metody


Próbki raka endometrium uzyskano od 44 pacjentek operowanych w II Katedrze i Klinice Ginekologii Akademii Medycznej w Lublinie. Średni wiek operowanych wyniósł 60,1±9,5 lat (zakres od 38–81 lat). Histologicznie prawidłowe tkanki endometrium z fazy proliferacyjnej i fazy sekrecyjnej, służące jako kontrola uzyskano od 25 pacjentek operowanych z powodu innego niż patologia błony śluzowej macicy. Pacjentki z tej grupy wykazywały prawidłowy cykl miesięczny.

Próbki DNA w ilości 1 mg poddawano trawieniu do 3’ monofosfonukleozydów za pomocą nukleazy mikrokokowej (2 μg) i fosfodiesterazy śledzionowej (1 μg) (Sigma-Aldrich) w buforze zawierającym 20 mM bursztynianu sodu pH 6 z dodatkiem 10 mM CaCl2. Po trawieniu roztwór dopełniano wodą destylowaną do 60 μl i z tej próbki pobierano do znakowania 10 μl roztworu co odpowiada 0,17 μg DNA. Próbki liofilizowano, a następnie dodawano 5 μl buforu bicyna – HCl pH 9,25 zawierającego 2 μCi γ-³²P-ATP, (Amersham, USA), 400 pM nieznakowanego ATP i 2 U kinazy polinukleotydowej (pK) (Sigma-Aldrich). Znakowanie przeprowadzono w łaźni wodnej w temp. 37˚C przez 30 min. Do każdej z probówek zawierającej mieszaninę 3’, 5’ dwufosforanów nukleozydów znakowanych ³²P na końcu 5’, dodawano 4 mU apyrazy (Sigma-Aldrich) w celu strawienia nadmiaru ATP. Reakcję powyższą przeprowadzano w temperaturze pokojowej w czasie 20 min. Uzyskane w reakcji znakowania dwufosforany dezoksynukleotydów poddawano defosforylacji w pozycji 3’ przy udziale 0,1 μg nukleazy P₁ (Boehringer, Niemcy) w temp. 37˚C w 5 μl buforu zawierającego 0,5 M octan amonu (CH₃COONH₄) pH 4,5.

Próbki hydrolizatu w objętości 5 μl nanoszono punktowo na płytki celulozowe o wymiarach 20 x 20 cm (Merck, Darmstadt, Niemcy) i poddawano 2-kierunkowej chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Rozdział chromatograficzny w pierwszym kierunku przeprowadzano stosując rozpuszczalnik o następującym składzie: kwas izomasłowy:H₂O:NH₄OH (66:17:1– v/v/v). Czas rozdziału w pierwszym kierunku monitorowano obserwując migrację solwentu – rozdział kończono w momencie osiągnięcia przez solwent górnej krawędzi płytki. Średni czas rozdziału wynosił 12–14 godz. Po wysuszeniu płytek w temperaturze pokojowej (ok. 6–8 godz.) przystępowano do rozdziału w drugim kierunku, stosując solwent o następującym składzie: 0,1M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ pH 6,8: siarczan amonu: propanol – 1 (100:60:1,5 – v/w/v). Po zakończeniu rozdziału chromatograficznego płytki umieszczano w cieplarce i suszono w temp. 52˚C co najmniej przez 2 godz. Pomiary ilościowe radioaktywności znakowanych plamek zawierających metylo-5-dezoksycytydynę (pm⁵dC) i dezoksycytydynę (pdC) przeprowadzano 2-krotnie przy pomocy analizatora (bio-imaging) (BAS 2000, Fuji, Japonia) w trybie ilościowym. Zawartość m⁵dC obliczano ze wzoru (m⁵dC/m⁵dC + dC) x 100%.

Analizę mutacji kodonu 12 w genie K-ras analizowano metodą polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych i reakcji łańcuchowej polimerazy (RFLP-PCR) zgodnie z metodą opisaną przez Jiang i wsp. [6]. W skrócie używając specyficznych primerów amplifikowano 157-nukleotydowe fragmenty pierwszego exonu genu K-ras, które poddawano enzymatycznemu trawieniu endonukleazą restrykcyjną BstNI. W rozdziale elektroforetycznym na 10% żelu poliakrylamidowym w przypadku braku mutacji (typ dziki) uzyskiwano 3 fragmenty (odpowiednio o długości 114pz, 29pz i 14pz). W przypadku obecności mutacji w rozdziale elektroforetycznym występowały jedynie 2 prążki o długości 143pz i 14pz. Jako kontrolę pozytywną używano DNA ze zmutowanych komórek raka endometrium, uzyskanych z hodowli komórkowej, zaś jako kontrola negatywna służył DNA uzyskany z łożyska człowieka.


Analiza statystyczna


Analizę statystyczną wykonywano przy pomocy pakietu Statistica 5, stosując test t-Studenta. Wyniki przedstawiono jako średnie ±odchylenie standardowe. Istotność różnic oceniano w oparciu o p <0,05.


Wyniki


Totalna metylacja genomowego DNA w rakach endometrium wynosiła 3,43%±0,47% i była znamiennie statystycznie wyższa niż w prawidłowym endometrium fazy proliferacyjnej (2,94%±0,40%, p=0,003) ale niższa w relacji do endometrium z fazy sekrecyjnej (3,75%±0,47%, p=0,03). Mutacje punktowe kodonu 12 genu K-ras stwierdzono w 25% analizowanych raków. Metylacja genomowego DNA była znamiennie niższa w nowotworach wykazujących mutację kodonu 12 genu K-ras w relacji do zakresu DNA guzów nie wykazujących tej mutacji (3,19%±0,31% versus 3,51%±0,48%, p=0,047). Zakres metylacji DNA w prawidłowym endometrium fazy prolifreacyjnej, w relacji do zakresu metylacji DNA raków endometrium wykazujących mutacje w zakresie kodonu 12 genu K-ras nie wykazywał istotnych statystycznie różnic. Istotna różnica występowała natomiast w przypadku endometrium fazy sekrecyjnej w relacji do raków endometrium z mutacją genu K-ras, gdzie stwierdzono istotnie niższy zakres metylacji w DNA tkanki guza (p=0,0024). W przypadku nowotworów bez mutacji metylacja DNA guza była znamiennie wyższa w relacji do endometrium fazy proliferacyjnej (p=0,0012) i bardzo zbliżona do zakresu metylacji DNA w endometrium fazy sekrecyjnej.


Dyskusja


Przeprowadzone przez nas badania pokazały, że zakres metylacji genomowego DNA w pierwotnych rakach endometrium mieści się najczęściej w granicach metylacji prawidłowego endometrium kobiet w okresie rozrodczym. Jedynie 6 guzów nowotworowych wykazywało wartości metylacji DNA poniżej wartości uzyskiwanych dla prawidłowego endometrium. Wyniki przeprowadzonych przez nas badań wskazują na fakt, że w przypadku raków endometrium nie obserwuje się hipometylacji jako czynnika promującego onkogenezę. Stwierdzono nawet, że w przypadku raków endometrium, hipermetylacja jest częstszym zjawiskiem molekularnym niż hipometylacja.

W naszych badaniach po raz pierwszy stwierdzono, że istnieje korelacja pomiędzy obecnością mutacji w kodonie 12 genu K-ras a zakresem metylacji DNA. Mutacja genu K-ras uznana za wczesny etap uszkodzenia molekularnego w onkogenezie jest silnie skorelowana z hipometylacją DNA. Uzyskane przez nas rezultaty wskazują na hipometylację DNA jako mechanizm ułatwiający (promujący?) powstawanie mutacji. W zestawieniu z faktem gorszego rokowania dla pacjentek w przypadku obecności mutacji w genie K-ras [5] wydaje się wysoce prawdopodobne, że ocena metylacji DNA może stanowić komplementarny marker prognostyczny raków endometrium. W badanej przez nas grupie, u pacjentek, u których stwierdzono najniższy poziom metylacji DNA i mutację genu K-ras wystąpiła wznowa nowotworu i umarły one w pierwszym roku po operacji. Pozostałe kobiety, wykazujące poziomy metylacji DNA z operowanych guzów z zakresie wartości średnich, mimo stwierdzenia mutacji w genie K-ras nie wykazują wznowy procesu nowotworowego; niektóre z nich nawet 5 lat po operacji.

Prezentowane badania w nowotworach złośliwych endometrium są też potwierdzeniem opinii grupy Szyfa [7, 9, 10], że metylacja DNA może być regulowana przez geny rodziny ras. W opinii wspomnianego zespołu zmiany metylacji DNA mogą być wywoływane przez modulację aktywności promotora DNMT1, albo przez wzbudzanie globalnej demetylacji, której mechanizm jest dotychczas niejasny. Transaktywacja genu metylotransferazy spowodowana jest zależną od białka ras fosforylacją protoonkogenu jądrowego c-Jun, który oddziałując następnie na miejsca AP-1 zlokalizowane w promotorze metylotransferazy 5-cytozyny DNA wywołuje wzrost transkrypcji genu. Szyf i wsp. [10] stwierdzili ponadto, że frakcje jądrowe komórek embrionalnych myszy (P19) transfekowanych protoonkogenem v-Ha-Ras wywołują demetylację dwuniciowych konstruktów DNA zbudowanych z oligonukleotydów m⁵dCpdG.

W świetle wyników przeprowadzonych badań wydaje się racjonalne uznać fakt, że w rakach endometrium z mutacją genu K-ras istnieje korelacja pomiędzy drogą przenoszenia sygnałów proliferacyjnych typu ras a zakresem metylacji DNA. W przypadku raków nie wykazujących obecności mutacji genu K-ras powinny być brane pod uwagę inne mechanizmy regulujące zakres metylacji DNA.

Praca powstała w ramach realizacji grantów Akademii Medycznej w Lublinie (DS 121/01 – W.B., PW 149/01 – K.P.) oraz Ligue National Contre le Cancer, Comitee du Haut Rhin, France – G.K., K.P., W.B.


Piśmiennictwo:

1. Belinsky SA, Nikula KJ, Baylin SB, Issa J-PJ. Increased cytosine DNA-methyltransferase activity is target-cell-specific and an early event in lung cancer. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 4045-0.
2. Bos JL. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res 1989; 49: 4682-9.
3. Chen RZ, Pettersson U, Beard C, et al. DNA hypomethylation leads to elevated mutation rates. Nature 1998; 395: 89-93.
4. Hsu DW, Lin MJ, Lee TL, et al. Two major forms of DNA (cytosine-5) methylotransferase in human somatic cells. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 9751-6.
5. Ito K, Watanabe K, Nasim S, et al. K-ras point mutations in endometrial carcinoma: effect on outcome is dependent on age of patient. Gynecol Oncol 1996; 63: 238-46.
6. Jiang W, Kahn SM, Guillem JG, et al. Rapid detection of ras oncogenes in human tumors: applications to colon, esophageal, and gastric cancer. Oncogene 1989; 4: 923-8.
7. MacLeod AR, Rouleau J, Szyf M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. J Biol Chem 1995; 270: 11327-37.
8. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell 1999; 99: 247-57.
9. Rouleau J, MacLeod AR, Szyf M. Regulation of the DNA methyltransferase by the Ras-AP-1 signaling pathway. J Biol Chem 1995; 270: 1595-601.
10. Szyf M, Theberge J, Bozovic V. Ras induces a general DNA demethylation activity in mouse embryonal P19 cells. J Biol Chem 1995; 270: 12690-6.
11. Wu JC, Santi DV. Kinetic and catalytic mechanism of HhaI methyl-transferase. J Biol Chem 1987; 262: 778-86.
12. Zingg JM, Jones PA. Genetic and epigenetic aspects of DNA methylation on genome expression, evolution, mutation and carcinogenesis. Carcinogenesis 1997; 18: 869-82.


Adres do korespondencji

II Katedra i Klinika Ginekologii Akademii Medycznej
20-954 Lublin
ul. Jaczewskiego 8
wbaranowski@yahoo.com