The significance of T129C and G2677T polymorphism of the MDR1 gene in ovarian cancer patients

Wstęp
Rak jajnika jest wykrywany w Polsce u ponad 3 tys. kobiet rocznie. Ponad 2/3 z nich umiera w ciągu 5 kolejnych lat [1]. Brak jest wiarygodnych metod diagnostycznych umożliwiających wczesne rozpoznawanie tego nowotworu, a pierwsze niecharakterystyczne objawy są często ignorowane przez pacjentki. W związku z tym rak jajnika rozpoznawany jest późno, w zaawansowanych stadiach choroby. Czynnikami ryzyka zachorowania na raka jajnika są: wiek, płodność, dieta, przebyte choroby ginekologiczne (endometrioza, torbiele jajnika, zapalenie miednicy mniejszej) oraz czynniki genetyczne [2, 3]. Mimo rosnącej wiedzy na temat raka jajnika nie udało się dotąd opracować skutecznego testu przesiewowego dla tego nowotworu. Konieczna wydaje się identyfikacja nowych czynników ryzyka w populacji kobiet, a analiza niektórych genów polimorficznych wydaje się szczególnie interesująca. Glikoproteina P (P-gp) o masie cząsteczkowej 170 kD stanowi integralne białko błon komórkowych należące do rodziny zależnych od ATP-aktywnych transporterów transbłonowych [ang. ATP binding cassette (ABC) transporter family]. Glikoproteina P jest produktem genu MDR1 (zwanego także ABCB1) zlokalizowanego w pozycji 21 na długim ramieniu chromosomu 7 (7q21) [4]. Mechanizm działania P-gp opiera się na działaniu ATP-zależnej pompy transportującej na zewnątrz komórek liczne ksenobiotyki, w tym leki, a także substraty endogenne do żółci, kału i moczu. Wypompowywanie substratów wiąże się w tym przypadku ze zmniejszeniem wchłaniania jelitowego, wzmożeniem wydzielania żółci i zwiększonej sekrecji w kanalikach nerkowych. W łożysku przyczynia się do zablokowania transferu ksenobiotyków o budowie hydrofobowej, co ogranicza przenikanie leków do płodu [5–9]. Znaczenie P-gp we wchłanianiu leków z przewodu pokarmowego oraz ich eliminacji wraz z moczem jest bezdyskusyjne [10, 11]. Osoby z obniżoną ekspresją P-gp w komórkach mogą być potencjalnie narażone na większe stężenie związków toksycznych, a co za tym idzie – bardziej podatne na zachorowanie na choroby rozrostowe. W zdrowych nerkach Siegsmund i wsp. wykazali związek między zmniejszoną ekspresją P-gp a występowaniem allelu 3435T genu MDR1. Jeszcze silniejszą zależność wykazano dla chorych na raka nerki, u których częstość występowania genotypu TT była znacznie wyższa niż u ludzi zdrowych [10]. W wielu pracach poruszono temat wrażliwości na zachorowanie na dany typ nowotworu w zależności od posiadanego genotypu. W badaniu 62 chorych na raka jelita grubego Potocnik i wsp. wykazali większą częstość występowania allelu T u pacjentów z rakiem okrężnicy w porównaniu z grupą kontrolną (0,54 vs 0,46; p<0,05) [12]. Nakajima i wsp. [13] wykazali wyższą częstość występowania allelu T u chorych w porównaniu z grupą kontrolną dla raka jajnika. Celem tego badania była ocena częstości występowania genotypów i alleli innych znanych polimorfizmów genu MDR1 – T129C i G2677T w grupie pacjentek populacji kaukaskiej leczonych z powodu raka jajnika.
Materiał i metody
W badaniach zastosowano próbki tkanek uzyskanych od 56 pacjentek rasy kaukaskiej w wieku 37–79 lat (średnia 54 lata), u których rozpoznano raka jajnika. Chore zostały poddane operacji w Klinice Chirurgii Ginekologicznej w latach 1997–2005. Wszystkie guzy zostały ocenione zgodnie z kryteriami FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics). Pełną charakterystykę badanej grupy przedstawiono w tab. I. Grupę kontrolną stanowiły próbki tkanek zdrowych jajników uzyskanych u dobranych wiekowo pacjentek w wieku 47–71 lat (średnia 52 lata) po zabiegu panhisterektomii z powodu rozpoznania macicy mięśniakowatej, u których po usunięciu macicy z przydatkami w badaniu histopatologicznym potwierdzono prawidłową strukturę jajników (n=58). Po analizie preparatów histopatologicznych wybrano najbardziej reprezentatywne miejsca do celowanego pobrania materiału z bloczków parafinowych, w których znajdowały się utrwalone tkanki. Materiał utrwalony w parafinie cięto na skrawki o grubości 5 mm, a następnie wytrząsano 5-krotnie ksylenem. Uzyskany osad przemywano 3-krotnie 96-procentowym etanolem. Po usunięciu etanolu materiał poddawano działaniu buforów lizujących wg instrukcji zestawu QIAmp Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Polimorfizm T129C genu MDR1 był określany poprzez reakcję PCR ze starterami allospecyficznymi – starter T129 5’ TGA TTG GCT GGG CAG GAA CAG 3’ i starter C129 5’ AAT CTT GGA AGA AGA TAC TCC 3’. Polimorfizm G2677T był określany za pomocą następujących starterów: G2677 5’ TAC CCA TCA TTG CAA TAG CAG3’ i T2677 5’ TTT AGT TTG ACT CAC CTT TCT AG 3’. Reakcję PCR przeprowadzono wg schematu – wstępna denaturacja w temp. 94°C przez 10 min, następnie właściwe 35 cykli – denaturacja w temp. 94°C przez 30 s, hybrydyzacja ze starterami w temp. 55°C (T129C) lub 54°C (G2677T) przez 30 s i wydłużanie łańcuchów DNA w temp. 72°C przez 30 s. Końcowe wydłużanie łańcuchów DNA przeprowadzono w temp. 72°C przez 10 min. Temperatura pokrywy wynosiła 105°C. Procedura PCR przeprowadzona była w termocyklerze Biometria UNO-Thermoblock. Mieszanina reakcyjna o objętości 25 ml zawierała próbkę genomowego DNA (2 mmol), startery (0,1 mmol), polimerazę Taq (1 U), 2,5 mM deoksynukleotydotrifosforanów (dNTP), bufor Taq, 2,5 mM MgCl2, 17,5 mM H2O. Amplifikowane fragmenty DNA rozdzielane były w 5-procentowym żelu poliakrylamidowym. Po barwieniu srebrem próbki wykazujące odpowiednią długość amplifikowanego fragmentu DNA były kwalifikowane do trawienia enzymem restrykcyjnym MspAII (T129C) lub Xba1 (G2677T). Trawienie w temp. 37°C prowadzono w cieplarce przez 24 godz. Produkty trawienia poddawano elektroforezie po wybarwieniu srebrem i odczytywano wynik – genotyp badanej pacjentki. Każda próbka przypisywana była do jednego z trzech genotypów – TT, TC lub CC. Dla polimorfizmu T129C na ścieżce elektroforetycznej dwa paski na wysokości 54 i 124 bp (par zasad) dotyczyły homozygot dla dzikiego allelu T, dwa paski na wysokości 92 i 124 bp dla homozygot zmutowanego allelu C, a trzy paski 54,92 i 124 bp dla heterozygot TC. Dla polimorfizmu G2677T każda próbka przypisywana była do jednego z trzech genotypów – GG, GT lub TT. Na ścieżce elektroforetycznej jeden pasek na wysokości 83 bp dotyczył homozygot dla dzikiego allelu G, jeden pasek na wysokości 107 bp dla homozygot zmutowanego allelu T, a dwa paski (83 i 107 bp) dla heterozygot GT. Typowy obraz wyniku reakcji analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (PCR-RFLP) przeprowadzonej z fragmentami genu MDR-1 (polimorfizm T129C i G2677T), analizowanej przez elektroforezę w 5-procentowym żelu poliakryloamidowym przedstawiono na ryc. 1. i 2.

Wynik uzyskany dla każdego z genotypów był porównywany z liczbą oczekiwaną na podstawie prawa Hardy’ego-Weinberga z zastosowaniem testu c2 przy użyciu programu Statistics for Windows software (Statesoft Co, USA, version 6,0). Istotność różnic pomiędzy częstościami alleli i genotypów dla poszczególnych grup oceniono za pomocą testu c2. Za poziom istotności przyjęto wartość p<0,05.

Wyniki
Rozkład genotypów dla polimorfizmu G2677T u pacjentek z rakiem jajnika względem zdrowych kobiet wynosił odpowiednio 10,7 vs 53,45% dla GG, 41,07 vs 27,59% dla GT i 48,21 vs 18,97% dla TT. Dla polimorfizmu T129C częstość genotypów TT, TC i CC u chorych na raka jajnika wynosił 46,1, 30,8 i 23,1%, natomiast w grupie kontrolnej odpowiednio 37,9, 50 i 12,1%. Wykazano różnice istotne statystycznie w częstości alleli między chorymi na raka jajnika i zdrowymi kobietami dla polimorfizmu G2677T (p<0,001), nie stwierdzono zaś różnic istotnych statystycznie między grupą badaną a kontrolną dla polimorfizmu T129C. Rozkład alleli i genotypów przedstawiono szczegółowo w tab. II.

Dyskusja
W genie MDR1 zidentyfikowano liczne polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNPs) i potwierdzono, że przynajmniej kilka z nich może wpływać na funkcję P-gp. Polimorfizm G2677T/A w egzonie 21 wydaje się szczególnie interesujący. Poprzez zamianę G®T i G®A obserwuje się zamianę aminokwasów w pozycji 893 (zamiana G®T skutkuje w przejściu Ala®Ser, a zamiana G®A prowadzi do zamiany Ala®Thr). Alanina jest strukturalnie neutralnym aminokwasem, który nie prowadzi do zmiany kształtu szkieletu polipeptydowego. Jest jednakże możliwe, że zamiana Thr lub Ser w Ala wpływa na zmianę konfiguracji miejsca wiązania i struktury drugorzędowej białka [9]. G2677T/A wydaje się szczególnie interesujący, biorąc pod uwagę poziom i częstość ekspresji P-gp w łożysku [9]. Badania przeprowadzone w małej grupie pacjentek japońskich wskazują na wpływ polimorfizmu G2677T/A na farmakokinetykę paklitakselu, znanego substratu P-gp [14]. Autorzy niniejszej pracy postanowili kontynuować badania na ten temat w grupie 56 pacjentek populacji łódzkiej. Biorąc pod uwagę sporadycznie obserwowaną mutację G®A w populacji kaukaskiej [15], w tym badaniu oceniono jedynie polimorfizm G®T.
Innym polimorfizmem wpływającym na zmianę ekspresji P-gp jest T129C. Tanebe i wsp. stwierdzili znamiennie istotny związek między obecnością polimorfizmu T129C a ekspresją P-gp w łożysku (p=0,002). Nosiciele allelu C wykazywali znamiennie statystycznie niższy poziom P-gp w porównaniu z nosicielami allelu T [9]. Biorąc pod uwagę znaczenie P-gp w przezbłonowym transporcie leków, w kilku pracach zbadano związek między występowaniem polimorfizmu T129C a skutecznością cytostatyków. Yamaguchi i wsp. wykazali, że chore na raka jajnika ze zmutowanym allelem C charakteryzowały się niższą biodostępnością pola pod krzywą (ang. area under curve – AUC) dla paklitakselu niż nosicielki allelu dzikiego T. Na tej podstawie wysnuto wniosek, że zmutowane allele genu MDR1 mogą mieć związek z wyższą aktywnością transportową przezbłonową białka P-gp, skutkującą w zwiększonym klirensie paklitakselu, poprzez zwiększone wydzielanie żółci bądź zmniejszone wchłanianie zwrotne w jelitach [14]. Dotychczas w żadnej pracy nie oceniano związku między występowaniem tego polimorfizmu a zapadalnością na nowotwory. W niniejszej pracy rozkład genotypów polimorfizmu G2677T u pacjentek z rakiem jajnika w porównaniu z grupą kontrolną różnił się w sposób istotny statystycznie (p<0,01; c2=0,00004). Wyniki prezentowanej pracy sugerują, że polimorfizm G2677T genu MDR1 może być częściowo związany ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka jajnika. W badaniu oceniono częstość genotypów w próbie pacjentek z rakiem jajnika i grupie kontrolnej zdrowych kobiet populacji kaukaskiej. W grupie kontrolnej częstość rozkładu genotypów wykazała przewagę allelu G (67%). Częstość występowania allelu G2677 była nieco wyższa niż w innych badaniach, ale autorzy sądzą, że różnice te mogą wynikać z niedostatecznie dużej grupy pacjentek, które wzięły udział w badaniu [16, 17]. Być może różnice te wynikają ze specyfiki populacji łódzkiej, w której uzyskuje się często odmienne wyniki względem populacji polskiej. Ma to związek z wielokulturową przeszłością Łodzi, miasta zamieszkałego przed II wojną światową przez Polaków, Żydów, Niemców i Rosjan. Dlatego rozkład alleli w populacji łódzkiej może różnić się od populacji polskiej, a także populacji kaukaskiej. W tab. III ukazano rozkład alleli dla polimorfizmu T129C i G2677T genu MDR1 u pacjentów z różnymi typami nowotworów. Uwzględniono w niej w szczególności guzy lite, choć dane literaturowe wskazują na większą wiedzę na temat wpływu polimorfizmu MDR1 w chorobach limfoproliferacyjnych. W niektórych chorobach hematologicznych, takich jak ostra białaczka limfoblastyczna dorosłych (ang. adult acute lymphoblastic leukemia – ALL) czy ostra białaczka szpikowa (ang. acute myeloid leukemia – AML), fenotyp oporności wielolekowej był związany ze zwiększoną ekspresją P-gp [18, 19]. Badania nad polimorfizmami w egzonie 21 genu MDR1 wykazały, że allel T2677 nie jest czynnikiem predysponującym do chorób limfoproliferacyjnych, ale wpływa na skuteczność chemioterapii. Pacjenci z tym haplotypem charakteryzują się większym ryzykiem lekooporności [20].

Kilka badań przeprowadzonych w ostatnich latach dotyczy polimorfizmu genu MDR1 w populacji kaukaskiej chorych z nowotworami litymi. Todorova i wsp. nie wykazali związku między rozkładem alleli dla grupy badanej (chorzy na raka jelita grubego) i kontrolnej w odniesieniu do polimorfizmu G2677T. Rozkład alleli wynosił 2677T – 43,5% wśród badanych i 41% w grupie kontrolnej (p>0,05). Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że polimorfizm G2677T nie stanowi czynnika ryzyka dla raka jelita grubego w populacji bułgarskiej i że wrodzona mutacja w tym miejscu genomu nie bierze udziału w procesie kancerogenezy w raku okrężnicy [21]. W innym badaniu wykazało jednakże większą częstość występowania allelu T u osób z rakiem okrężnicy w porównaniu z grupą kontrolną (0,54 vs 0,46; p<0,05) [22]. W niniejszej pracy również wykazano wyższą częstość występowania allelu T u chorych w porównaniu z grupą kontrolną (69 vs 33%). Podobną tendencję dla raka jajnika zaobserwowali Nakajima i wsp. [13], a Potocnik i wsp. otrzymali zbliżone wyniki dla tego polimorfizmu u pacjentów z rakiem okrężnicy [12]. W badaniach dotyczących polimorfizmu G2677T w kontekście skuteczności chemioterapii zastosowanej w raku jajnika wykazano odmienny rozkład genotypów z przewagą allelu G [23]. Podobny rozkład uzyskali Marsh i wsp. w badaniu z randomizacją – SRTOC, jednak wyniki w tej pracy budzą kontrowersje z uwagi na wieloetniczne pochodzenie pacjentek zakwalifikowanych do udziału w badaniu [24].
Wnioski
1. Nie stwierdzono znaczenia polimorfizmu T129C w rozwoju raka jajnika.
2. Wyniki prezentowanej pracy sugerują, że polimorfizm G2677T może być związany z występowaniem i rozwojem raka jajnika, jednakże do potwierdzenia tego stwierdzenia konieczne są badania z udziałem większych grup klinicznych.
Praca powstała dzięki grantowi G20 Prezydenta Miasta Łodzi.
Piśmiennictwo
1. Wojciechowska U, Didkowska J, Tarkowski W, et al. Malignant tumors in Poland in 2002. Report: Marie Curie Cancer Institute, Warszawa 2003. 2. Heaps JM, Nieberg RK, Berek JS. Malignant neoplasia arising in endometriosis. Obstet Gynecol 1990; 75: 1023-28. 3. Risch HA, Howe GR. Pelvic inflammatory disease and the risk of epithelial ovarian cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1995; 4: 447. 4. Chen CJ, Clark D, Ueda K, et al. Genomic organization of the human multidrug resistance (MDR1) gene and origin of P-glycoprotein. J Biol Chem 1990; 265: 506-14. 5. Fojo AT, Ueda K, Salmon DJ, et al. Expression of a multidrug-resistance gene in human tumors and tissues. Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: 265-69. 6. Thiebaut F, Tsuruo T, Hamada H, et al. Cellular localisation of the multi-drug resistance gene product P-glycoprotein in normal human tissues. Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: 7735-38. 7. Sugawara I, Akiyama S, Scheper RJ, Itoyama S. Lung resistance protein (LRP) expression in human normal tissues in comparison with that of MDR1 and MRP. Cancer Lett 1997; 112: 23. 8. Cordon-Cardo C, O'Brien JP, Boccia J. Expression of the multidrug resistance gene product (P-glycoprotein) in human normal and tumor tissues. J Histochem Cytochem 1990; 38: 1277-87. 9. Tanabe M, Ieiri I, Nagata N, et al. Expression of P-glycoprotein in Human Placenta: Relation to genetic Polymorphism of the Multidrug Resistance (MDR)-1 gene. J Pharmacol Exp Ther 2001; 297: 1137-43. 10. Siegsmund M, Brinkmann U, Scháffeler E, et al. Association of the P-glycoprotein transporter MDR1 C3435T polymorphism with the susceptibility to renal epithelial tumors. J Am Soc Nephrol 2002; 13: 11. Hoffmeyer S, Burk O, von Richter O, et al. Functional polymorphisms of the human multidrug-resistance gene: multiple sequence variations and correlation of one allele with P-glycoprotein expression and activity in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 3473-78. 12. Potocnik U, Ravnik-Glavac M, Glavac D. Functional MDR1 polymorphisms (G2677T and C3435T) and TCF4 mutations in colorectal tumors with high microsatellite instability. Cell Mol Biol Lett 2002; 7: 92-95. 13. Nakajima M, Fujiki Y, Kyo S, et al. Pharmacokinetics of paclitaxel in ovarian cancer patients and genetic polymorphisms of CYP2C8, CYP3A4, and MDR1. J Clin Pharmacol 2005; 45: 674-82. 14. Yamaguchi H, Hishinuma T, Endo N, et al. Genetic variation in ABCB1 influences paclitaxel pharmacokinetics in Japanese patients with ovarian cancer. Int J Gyneocol Cancer 2006; 16: 979-85. 15. Ieiri I, Takane H, Otsubo K. The MDR1 (ABCB1) gene polymorphism and its clinical implications. Clin Pharmacokinet 2004; 43: 553-73. 16. Furuno T, Landi MT, Ceroni M. Expression polymorphism of the blood-brain barrier component P-glycoprotein (MDR1) in relation to Parkinson's disease. Pharmacogenetics 2002; 12: 529-34. 17. Cascorbi I, Gerloff T, Johne A. Frequency of single nucleotide polymorphisms in the p-glycoprotein drug transporter MDR1 gene in white subjects. Clin Pharmacol Ther 2001; 69: 169-74. 18. Illmer T, Schuler US, Thiede C, et al. MDR1 gene polymorphisms affect therapy outcome in acute myeloid leucemia patients. Cancer Res 2002; 62: 4955-62. 19. Tafuri A, Gregorj C, Petrucci MT. MDR1 protein expression is an independent predictor of complete remission in newly diagnosed adult acute lymphoblastic leukemia. Blood 2002; 100: 974-81. 20. Goreva OB, Grishanova AY, Mukhin OV, et al. Possible prediction of the efficiency of chemotherapy in patients with lymphoproliferative diseases based on MDR1 gene G2677T and C3435T polymorphisms. Bull Exp Bio Med 2003; 136: 183-85. 21. Todorova PD, Nedeva P, Maslyankov S, et al. No association between MDR1 (ABCB1) 2677G>T and 3435C>T polymorphism and sporadic colorectal cancer among Bulgarian patients. J Cancer Res Clin Oncol 2008; 134: 317-22. 22. Potocnik U, Ferkolj I, Glavac D, Dean M. Polyorphisms in multidrug resistance 1 (MDR1) gene are assosiated with refractory Crohn disease and ulceraive colitis. Genes Immun 2004; 5: 530-39. 23. Gréen H, Söderkvist P, Rosenberg P, et al. MDR1 single nucleotide polymorphisms in ovarian cancer tissue: G2677T/A correlates with response to paclitaxel chemotherapy. Clin Cancer Res 2006; 12: 854-59. 24. Marsh S, Jim P, King CR, et al. Pharmacogenetic assessment of toxicity and outcome after platinum plus taxane chemotherapy in ovarian cancer: the Scottish Randomised Trial in Ovarian Cancer. J Clin Oncol 2007; 25: 4528-35.