Association between single nucleotide polymorphisms of the DNA mismatch repair gene hMSH2 and postmenopausal breast cancer in Polish women

Wstęp

Rak piersi jest najczęstszym nowotworem złośliwym u kobiet. Nowotwór ten jest wynikiem współdziałania różnorodnych czynników – zarówno genetycznych, jak i środowiskowych [1–3].

Zmiany mutacyjne w obrębie genomu (translokacje, delecje i duplikacje) są częste w komórkach rakowych – szczególnie dotyczy to raka piersi [4]. Ich nagromadzenie jest wynikiem błędów w jednym z pięciu mechanizmów naprawy kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA). Należą do nich: szlak naprawy przez bezpośrednią rewersję uszkodzenia, wycinanie zasad azotowych, wycinanie nukleotydów, naprawa błędnie sparowanych zasad azotowych (mismatch repair – MMR), naprawa przez rekombinację.

System naprawy błędnie sparowanych zasad azotowych usuwa głównie błędy powstałe w trakcie replikacji DNA i niewłaściwe pary zasad tworzące się w wyniku rekombinacji DNA oraz spontanicznej lub indukowanej deaminacji, utleniania bądź metylacji zasad azotowych [5].

System ten naprawia więc niektóre błędne sparowania zasad azotowych zmodyfikowanych przez czynniki chemiczne, np. O6-metyloguaniny, adduktów epoksydowej pochodnej benzo[a]pirenu i 8-oksoguaniny. System naprawy błędnie sparowanych zasad azotowych odgrywa ważną rolę w utrzymywaniu stabilności genomu, stąd jego defekty prowadzą do poważnych schorzeń, np. dziedzicznego niepolipowatego raka jelita grubego i innych nowotworów, w tym raka piersi [6, 7].

Główna ścieżka działania MMR rozpoczyna się od rozpoznania miejsca błędnego sparowania przez heterodimer obejmujący białka MSH2 i MSH6 (kompleks MutSα) [8].

Drugą ścieżką systemu MMR jest inicjacja naprawy przez kompleks MutSβ, obejmujący białka MSH2 i MSH3, odpowiedzialny za rozpoznawanie mutacji typu insercja/delecja [8].

System naprawy błędnie sparowanych zasad azotowych jest wysoce konserwatywnym mechanizmem naprawy DNA, który hamuje rekombinację homologiczną [9]. Błędy w systemie MMR prowadzą do wysokiego stopnia niestabilności mikrosatelitarnej. Wraz z utratą heterozygotyczności jest on wykrywany w 83% raków piersi [10, 11], co wskazuje na istotną rolę MMR w rozwoju tego nowotworu.

Główne białko MSH2 uczestniczące w rozpoznawaniu błędnie sparowanych zasad kodowane jest przez gen hMSH2 [12]. Jest to gen polimorficzny [13] i wobec istotnego znaczenia MSH2 w rozwoju nowotworów ważne wydaje się poznanie roli polimorfizmów w rozwoju raka piersi.

Ze względu na postęp w badaniach genetycznych, jaki dokonał się na przestrzeni ostatnich kilku lat, w prezentowanej pracy badano dwa polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (single nucleotide polymorphism – SNP) w obrębie genu hMSH2 – Gly322Asp i Asn127Ser u polskich kobiet chorych na raka piersi przy zastosowaniu techniki reakcji łańcuchowej polimerazy wykorzystującej enzymy restrykcyjne (polimerase chain reaction based restriction fragment length polymorphism – PCR-RFLP).

Materiały i metody

Pacjentki

Krew została uzyskana od 205 kobiet w wieku pomenopauzalnym chorych na raka piersi bez przerzutów (n = 155) i z przerzutami do okolicznych węzłów chłonnych (n = 50) leczonych w Klinice Chirurgii Onkologicznej i Chorób Piersi Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi. Pacjentki były w wieku 48–82 lat (średnia wieku 58 lat). Średni rozmiar guza wynosił 20 mm (17–32 mm). Wszystkie nowotwory były klasyfikowane wg skali Scarf-Bloom-Richardson. Nowotworów I stopnia stwierdzono 48 (23%), II stopnia – 122 (60%), a III stopnia – 35 (17%). Jako grupę kontrolną zastosowano krew osób, u których nie stwierdzono choroby nowotworowej (n = 180). Kwas deoksyrybonukleinowy do badań izolowany był z zastosowaniem zestawu QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta.

Analiza polimorfizmów genu hMSH2

Analiza polimorfizmu hMSH2 Asn127Ser została przeprowadzona metodą PCR-RFLP [14]. Polimorfizm Gly322Asp został określony z zastosowaniem starterów 5’-GTTTTCACTAATGAGCTTGC-3’ i 5’-AGTGGTATAATCATGTGGGT-3’. Reakcja łańcuchowej polimerazy została przeprowadzona w termocyklerze GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems). Mieszanina reakcyjna obejmowała 100 ng DNA, 12,5 pmol starterów, 0,2 mmol/l dNTPs, 2 mmol/l MgCl2 i 1 U polimerazy Taq DNA. Warunki PCR były następujące 95°C przez 60 s, 63°C przez 30 s i 72°C przez 40 s, przez 30 cykli. Produkt o długości 252 pz był trawiony 5 U enzymu restrykcyjnego HinfI w temperaturze 37ºC. Allel dziki Gly charakteryzowało pasmo długości 252 pz, allel zmutowany Asp reprezentowały dwa pasma: 70 i 182 pz.

Analiza statystyczna

Analiza statystyczna rozkładu genotypów oraz alleli w grupie badanej i kontrolnej przeprowadzona została po wcześniejszym potwierdzeniu, że otrzymane układy pozostają w stanie równowagi wg reguły Hardy’ego-Weinberga. Analizowano rozkłady genotypów i alleli oraz oceniono ich zgodność z rozkładem Hardy’ego-Weinberga przy użyciu testu χ2. Różnice pomiędzy rozkładami w poszczególnych grupach oceniano, także stosując test χ2. Wynik uznawano za istotny statystycznie przy poziomie istotności p < 0,05.

Ocenę genotypów i alleli pod względem ich związku z daną cechą, np. ryzykiem wystąpienia raka, przeprowadzano przez zastosowanie analizy ilorazu szans (odds ratio – OR) oraz 95-procentowego przedziału ufności (95 percent confindence interval – 95% CI), które obliczano wg modelu regresji logistycznej. Korzystano z pakietu Statistica v. 7.0 (StatSoft, Tulsa, OK, USA).

Wyniki

W tabeli I przedstawiono rozkład genotypów i częstości alleli Gay i Asp polimorfizmu Gly322Asp genu hMSH2 w grupie chorych na raka piersi i w grupie kontrolnej. Stwierdzono statystycznie znaczące różnice pomiędzy badanymi grupami (p < 0,05). Częstość alleli Gly i Asp w grupie chorych wynosiła 0,65/0,35, natomiast w grupie kontrolnej 0,73/0,27. U pacjentek częstości genotypów Gly/Gly, Gly/Asp i Asp/Asp różniły się znacząco (p < 0,05) od rozkładu przewidywanego przez prawo Hardy’ego-Weinberga. Homozygota Asp/Asp zwiększała około dwukrotnie ryzyko wystąpienia raka piersi [OR 2,60 (95% CI 1,03–6,53); p = 0,043].

Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w rozkładzie genotypów i częstości alleli Asn i Ser polimorfizmu Asn127Ser genu hMSH2 pomiędzy grupą badaną a kontrolną (tab. II). Kobiety chore na raka piersi wykazywały następującą częstość genotypów: Asn/Asn – 64%, Asn/Ser – 29% i Ser/Ser – 7%, podczas gdy grupa kontrolna Asn/Asn – 72%, Asn/Ser – 22% i Ser/Ser – 6%.

Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w rozkładzie genotypów i częstości alleli obu badanych polimorfizmów genu hMSH2 w grupach o różnym stopniu zaawansowania raka piersi wg skali Scarf-Bloom-Richardson (tab. III i IV).

Dyskusja

Wiele czynników środowiskowych, jak promieniowanie radiacyjne, dieta, endogenne i egzogenne estrogeny, mogą być związane z ryzykiem rozwoju raka piersi. Ostatnie badania sugerują, że polimorficzne warianty genów naprawy DNA mogą wpływać na zdolności do rozwoju nowotworów [15].

System naprawy błędnie sparowanych zasad azotowych stoi na straży integralności genomu [16]. Kluczowymi białkami tego systemu są: MLH1, MSH2, MSH6 i PMS2. Kompleks: MutSα rozpoznaje błędne sparowanie zasada–zasada i pętlę powstałą w wyniku mutacji typu insercja/delecja, kompleks MutSβ rozpoznaje tylko drugi typ uszkodzenia [17, 18].

Utrata prawidłowej funkcji MMR powoduje niestabilność mikrosatelitarną (microsatellite instability – MSI) – typ niestabilności genomowej polegającej na zmianach w długości sekwencji mikrosatelitarnych [19]. Sekwencje mikrosatelitarne są to proste, tandemowe powtórzenia składające się z dwu-, trzy- lub czteronukleotydowych sekwencji zwanych motywami. Najczęściej są to jednak dwunukleotydowe motywy powtórzeń.

Wysoki poziom uszkodzeń DNA i wady w MMR mogą predysponować do rozwoju raka [20]. W raku piersi bardzo często dochodzi do defektów w MMR [21]. Niestabilność mikrosatelitarna i utrata heterozygotyczności (loss of heterozygosity – LOH) są wykrywane w ponad 80% raków piersi, co sugeruje potencjalną rolę MMR w rozwoju tego nowotworu [11].

Polimorfizm SNP w genach naprawy DNA może wpływać na ryzyko rozwoju raka w wyniku ich związku z utrzymaniem integralności genomu [22]. Wiele genetycznych zmian w formie SNP stwierdza się w genach MMR, ale ich funkcja nie jest jeszcze poznana. Zmiany w tych genach mogą wywierać różny wpływ na fenotyp nowotworów w zależności od umiejscowienia zmiany.

Istotne genetyczne zmiany występują w genach MMR w raku jelita grubego [23–25], niewiele natomiast wiadomo o ich roli w raku piersi. Analiza SNP w raku piersi wykazała dwa istniejące związki: polimorfizmy MSH3 Ala1045Thr/MSH6 Gly39Glu zmniejszały ryzyko raka, polimorfizmy MSH4 Ala97Thr/MLH3 Leu844Pro zwiększały ryzyko raka piersi [26].

Wykryto kilka wariantów polimorficznych w genie hMSH2 [13], ale dane na temat ich znaczenia w raku piersi są nieliczne.

W Polsce Popławski i wsp. [14] wykazali brak korelacji pomiędzy polimorfizmem A→G w pozycji 127 genu hMSH2 powodującym podstawienie Asn→Ser w kodonie 127 (polimorfizm Asn127Ser), polimorfizmem G→A w pozycji 1032 powodującym podstawienie Gly→Asp w kodonie 322 (polimorfizm Gly322Asp), a progresją raka piersi [14]. Natomiast wykryto silny związek pomiędzy wystąpieniem raka piersi a homozygotą Gly/Gly.

W prezentowanej pracy badano dwa polimorfizmy genu hMSH2 (Gly322Asp i Asn127Ser) i ich związek z rakiem piersi u polskich kobiet. Polimorfizmy wybrane do badań mogą mieć funkcjonalne znaczenie i odpowiadać za defekty w zdolności MMR do naprawy DNA.

W pracy żaden z genotypów polimorfizmu Asn127Ser nie wpływał na ryzyko raka piersi. Nie było statystycznie istotnych różnic w rozkładzie genotypów i częstości alleli pomiędzy pacjentkami i grupą kontrolną. Różnice takie wykryto jednak w przypadku drugiego badanego polimorfizmu Gly322Asp genu hMSH2. Rozkład genotypów Asp/Asp, Asp/Gly i Gly/Gly w grupie chorych różnił się od rozkładu zgodnego z prawem Hardy’ego-Weinberga z przewagą homozygoty Asp/Asp. Homozygota Asp/Asp zwiększała około dwukrotnie ryzyko wystąpienia raka piersi.

Wnioski

Istnieje możliwość, że allel Asp pozostaje w związku z innymi, niewykrytymi jeszcze mutacjami zlokalizowanymi poza regionem kodującym genu hMSH2, które mogą być istotne dla stężenia białka MSH2 tworzącego kompleksy umożliwiające usuwanie błędów w ramach MMR.

Badania sugerują, że polimorfizm Gly322Asp genu hMSH2 może być związany z rakiem piersi u polskich kobiet, jednakże badania obejmujące większą grupę badaną są konieczne do potwierdzenia tego wniosku.

Piśmiennictwo

1. Vargo-Gogola T, Rosen JM. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer 2007; 7: 659-72.

2. Dapic V, Carvalho MA, Monteiro AN. Breast cancer susceptibility and the DNA damage response. Cancer Control 2005; 12: 127-36.

3. Veronesi U, Boyle P, Goldhirsch A, et al. Breast cancer. Lancet 2005; 365: 1727-41.

4. Davidson JM, Gorringe KL, Chin SF, et al. Molecular cytogenetic analysis of breast cancer cell lines. Br J Cancer 2000; 83: 1309-17.

5. Skinner AM, Turker MS. Oxidative mutagenesis, mismatch repair, and aging. Sci Aging Knowledge Environ 2005; 2005: re3.

6. Karran P. Microsatellite instability and DNA mismatch repair in human cancer. Semin Cancer Biol 1996; 7: 15-24.

7. Neri S, Gardini A, Facchini A, et al. Mismatch repair system and aging: microsatellite instability in peripheral blood cells from differently aged participants. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2005; 60: 285-92.

8. Hsieh P, Yamane K. DNA mismatch repair: molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev 2008; 129: 391-407.

9. Li GM. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell Res 2008; 18: 85-98.

10. Kuligina ESh, Grigoriev MY, Suspitsin EN, et al. Microsatellite instability analysis of bilateral breast tumors suggests treatment-related origin of some contralateral malignancies. J Cancer Res Clin Oncol 2007; 133: 57-64.

11. Moinfar F, Beham A, Friedrich G, et al. Macro-environment of breast carcinoma: frequent genetic alterations in the normal appearing skins of patients with breast cancer. Mod Pathol 2008; 21: 639-46.

12. Murata H, Khattar NH, Kang Y, et al. Genetic and epigenetic modification of mismatch repair genes hMSH2 and hMLH1 in sporadic breast cancer with microsatellite instability. Oncogene 2002; 21: 5696-703.

13. Wong EM, Tesoriero AA, Pupo GM, et al. Is MSH2 a breast cancer susceptibility gene? Fam Cancer 2008; 7: 151-5.

14. Poplawski T, Zadrozny M, Kolacinska A, et al. Polymorphisms of the DNA mismatch repair gene HMSH2 in breast cancer occurence and progression. Breast Cancer Res Treat 2005; 94: 199-204.

15. Jiricny J, Nyström-Lahti M. Mismatch repair defects in cancer. Curr Opin Genet Dev 2000; 10: 157-61.

16. Schofield MJ, Hsieh P. DNA mismatch repair: molecular mechanisms and biological function. Annu Rev Microbiol 2003; 57: 579-608.

17. Harfe BD, Minesinger BK, Jinks-Robertson S. Discrete in vivo roles for the MutL homologs Mlh2p and Mlh3p in the removal of frameshift intermediates in budding yeast. Curr Biol 2000; 10: 145-8.

18. Stojic L, Brun R, Jiricny J. Mismatch repair and DNA damage signalling. DNA Repair (Amst) 2004; 3: 1091-101.

19. de la Chapelle A. Genetic predisposition to colorectal cancer. Nat Rev Cancer 2004; 4: 769-80.

20. Moses RE. DNA damage processing defects and disease. Annu Rev Genomics Hum Genet 2001; 2: 41-68.

21. Romanowicz H, Smolarz B, Fiks T i wsp. Znaczenie mechanizmu naprawy DNA błędnie sparowanych zasad azotowych (MMR) w raku piersi. Przegl Menopauz 2010; 2: 95-100.

22. Ford BN, Ruttan CC, Kyle VL, et al. Identification of single nucleotide polymorphisms in human DNA repair genes. Carcinogenesis 2000; 21: 1977-81.

23. Salovaara R, Loukola A, Kristo P, et al. Population-based molecular detection of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. J Clin Oncol 2000; 18: 2193-200.

24. Giardiello FM, Brensinger JD, Petersen GM. AGA technical review on hereditary colorectal cancer and genetic testing. Gastroenterology 2001; 121: 198-213.

25. Hampel H, Frankel WL, Martin E, et al. Screening for the Lynch syndrome (hereditary nonpolyposis colorectal cancer). N Engl J Med 2005; 352: 1851-60.

26. Conde J, Silva SN, Azevedo AP, et al. Association of common variants in mismatch repair genes and breast cancer susceptibility: a multigene study. BMC Cancer 2009; 9: 344.