Diagnostyka molekularna w praktyce: metoda Real-Time PCR w rozpoznawaniu przyczyn infekcji układu pokarmowego
Działy:
Poinformowano nas
Aktualności
Objawy kliniczne infekcji żołądkowo-jelitowych są często podobne, dlatego istotną rolę w identyfikacji czynnika zakażenia odgrywają badania diagnostyczne. Diagnostyka laboratoryjna oferuje zarówno techniki konwencjonalne takie jak badania mikroskopowe, metody hodowlane, serologiczne oraz nowoczesne techniki molekularne.
Szereg dostępnych metod laboratoryjnych często wiąże się z ograniczeniami wynikającymi z czułości metody, specyficzności, czasu realizacji oraz kosztów.
Nieocenione w identyfikacji patogenów układu pokarmowego i w postawieniu właściwego rozpoznania są metody molekularne. Są niezastąpione w przypadku, gdy hodowla drobnoustrojów jest niemożliwa, trudna technicznie lub długotrwała. Metody molekularne pozwalają na wykrywanie materiału genetycznego mikroorganizmów, co ma szczególne znaczenie w przypadku identyfikacji wirusów, wolnorosnących bakterii, szczepów bakterii o podobnych cechach biochemicznych, pasożytów czy innych atypowych drobnoustrojów. Klasyczna reakcja PCR pozwala na powielanie unikalnych fragmentów DNA charakterystycznych dla konkretnych patogenów, czyli ich amplifikacji za pomocą enzymu polimerazy. Powielone fragmenty DNA są uwidaczniane za pomocą specjalnych barwników, a następnie analizowane. Metoda Real-Time PCR (PCR w czasie rzeczywistym), stanowiąca modyfikację klasycznej reakcji PCR z zastosowaniem sond fluorescencyjnych, pozwala na wykrywanie produktu amplifikacji już podczas przebiegu reakcji. Metoda umożliwia ocenę liczby kopii patogenów, co pozwala na monitorowanie przebiegu infekcji i skuteczności leczenia pacjenta. Czas wykonania badania jest stosunkowo krótki i wynosi zazwyczaj kilka godzin. W odniesieniu do metod hodowlanych technika Real-Time PCR wykazuje zarówno wyższą czułość oraz swoistość. Gdy w badanej próbce jest niewielkie miano wirusa lub okres jego wydalania jest krótki, wówczas koncentracja wirusa może szybko spadać. W konsekwencji wirus może być niewykrywalny innymi metodami niż Real-Time PCR. Ze względu na wysoką czułość, analizę można wykonać już na podstawie niewielkiej ilości pobranego materiału. Rewolucję w diagnostyce laboratoryjnej stanowi multipleksowa reakcja Real-Time PCR identyfikująca materiał genetyczny od kilku do kilkudziesięciu patogenów podczas jednej reakcji. Dzięki temu możliwe jest wykrycie koinfekcji (wykrycie większej liczby sprawczych patogenów) i dobranie właściwego leczenia. W przypadku metod klasycznych wykrycie jednego czynnika patogennego często prowadzi do zaprzestania dalszej diagnostyki, co niekoniecznie prowadzi do wyleczenia z infekcji.
Celem badania była ocena struktury zlecanych badań i zidentyfikowanych patogenów na przykładzie doświadczeń własnych. Wśród dostępnych czterech paneli pozwalających na wykrycie materiału genetycznego patogenów stanowiących najczęstszą przyczynę zakażeń układu pokarmowego najczęściej zalecany był panel HELMINTY (płazińce, obleńce, mikrosporydia; GI-H) –113 zleceń (61% zleconych wszystkich paneli). Mniej popularne pod względem zleconych badań były panele diagnostyczne wykrywające jednocześnie BAKTERIE, WIRUSY ORAZ PIERWOTNIAKI (GI-FULL) – 37 zleceń (20%) oraz panel PIERWOTNIAKI (GI-P) 33 zleconych badań (18%). Najrzadziej zlecano panel diagnostyczny BAKTERIE (GI-B) – 1 zlecenie.
Łącznie zlecono 184 badania w kierunku wykrycia i identyfikacji patogenów odpowiedzialnych za infekcje układu pokarmowego. W 145 badaniach nie wykryto żadnego z badanych patogenów, w jednym przypadku uzyskano wynik niediagnostyczny. W 33 badaniach wykryto jeden patogen, natomiast w 5 po 2 patogeny jednocześnie. Łącznie zidentyfikowano 9 rodzajów patogenów w tym 4 bakterie, 3 pierwotniaki oraz 2 helminty. Najczęściej diagnozowanymi patogenami były pierwotniaki, łącznie 27 pozytywnych wyników. W tej grupie Blastocystis hominis zidentyfikowano 14 razy, Dientamoeba fragilis – 12 oraz Giardia lamblia 1 raz. Bakterie zdiagnozowano łącznie w 13 przypadkach i były to: Aeromonas spp. oraz enteropatogenne pałeczki Escherichia coli, posiadające geny eaeA (5 razy), szczep Clostridium difficile, posiadający gen kodujący toksynę B (2 razy) oraz enteroagregacyjne pałeczki Escherichia coli posiadające gen aggR 1 (1 raz). Grupę najrzadziej diagnozowanych patogenów stanowiły helminty. Łącznie zidentyfikowano je w 3 przypadkach, w tym Enterobius vermicularis (2 razy) oraz Enterocytozoon spp./Encephalitozoon spp.
PEŁNA TREŚĆ ARTYKUŁU
---
Autorzy opracowania:
dr. hab. Monika Dmitrzak-Węglarz
Kierownik Laboratorium Diagnostyki Molekularnej genXone SA
mgr Anna Brylak-Błaszków
Diagnosta Laboratoryjny Laboratorium Diagnostyki Molekularnej genXone SA
dr Karol Szeszko
Diagnosta Laboratoryjny Laboratorium Diagnostyki Molekularnej genXone SA
Nieocenione w identyfikacji patogenów układu pokarmowego i w postawieniu właściwego rozpoznania są metody molekularne. Są niezastąpione w przypadku, gdy hodowla drobnoustrojów jest niemożliwa, trudna technicznie lub długotrwała. Metody molekularne pozwalają na wykrywanie materiału genetycznego mikroorganizmów, co ma szczególne znaczenie w przypadku identyfikacji wirusów, wolnorosnących bakterii, szczepów bakterii o podobnych cechach biochemicznych, pasożytów czy innych atypowych drobnoustrojów. Klasyczna reakcja PCR pozwala na powielanie unikalnych fragmentów DNA charakterystycznych dla konkretnych patogenów, czyli ich amplifikacji za pomocą enzymu polimerazy. Powielone fragmenty DNA są uwidaczniane za pomocą specjalnych barwników, a następnie analizowane. Metoda Real-Time PCR (PCR w czasie rzeczywistym), stanowiąca modyfikację klasycznej reakcji PCR z zastosowaniem sond fluorescencyjnych, pozwala na wykrywanie produktu amplifikacji już podczas przebiegu reakcji. Metoda umożliwia ocenę liczby kopii patogenów, co pozwala na monitorowanie przebiegu infekcji i skuteczności leczenia pacjenta. Czas wykonania badania jest stosunkowo krótki i wynosi zazwyczaj kilka godzin. W odniesieniu do metod hodowlanych technika Real-Time PCR wykazuje zarówno wyższą czułość oraz swoistość. Gdy w badanej próbce jest niewielkie miano wirusa lub okres jego wydalania jest krótki, wówczas koncentracja wirusa może szybko spadać. W konsekwencji wirus może być niewykrywalny innymi metodami niż Real-Time PCR. Ze względu na wysoką czułość, analizę można wykonać już na podstawie niewielkiej ilości pobranego materiału. Rewolucję w diagnostyce laboratoryjnej stanowi multipleksowa reakcja Real-Time PCR identyfikująca materiał genetyczny od kilku do kilkudziesięciu patogenów podczas jednej reakcji. Dzięki temu możliwe jest wykrycie koinfekcji (wykrycie większej liczby sprawczych patogenów) i dobranie właściwego leczenia. W przypadku metod klasycznych wykrycie jednego czynnika patogennego często prowadzi do zaprzestania dalszej diagnostyki, co niekoniecznie prowadzi do wyleczenia z infekcji.
Celem badania była ocena struktury zlecanych badań i zidentyfikowanych patogenów na przykładzie doświadczeń własnych. Wśród dostępnych czterech paneli pozwalających na wykrycie materiału genetycznego patogenów stanowiących najczęstszą przyczynę zakażeń układu pokarmowego najczęściej zalecany był panel HELMINTY (płazińce, obleńce, mikrosporydia; GI-H) –113 zleceń (61% zleconych wszystkich paneli). Mniej popularne pod względem zleconych badań były panele diagnostyczne wykrywające jednocześnie BAKTERIE, WIRUSY ORAZ PIERWOTNIAKI (GI-FULL) – 37 zleceń (20%) oraz panel PIERWOTNIAKI (GI-P) 33 zleconych badań (18%). Najrzadziej zlecano panel diagnostyczny BAKTERIE (GI-B) – 1 zlecenie.
Łącznie zlecono 184 badania w kierunku wykrycia i identyfikacji patogenów odpowiedzialnych za infekcje układu pokarmowego. W 145 badaniach nie wykryto żadnego z badanych patogenów, w jednym przypadku uzyskano wynik niediagnostyczny. W 33 badaniach wykryto jeden patogen, natomiast w 5 po 2 patogeny jednocześnie. Łącznie zidentyfikowano 9 rodzajów patogenów w tym 4 bakterie, 3 pierwotniaki oraz 2 helminty. Najczęściej diagnozowanymi patogenami były pierwotniaki, łącznie 27 pozytywnych wyników. W tej grupie Blastocystis hominis zidentyfikowano 14 razy, Dientamoeba fragilis – 12 oraz Giardia lamblia 1 raz. Bakterie zdiagnozowano łącznie w 13 przypadkach i były to: Aeromonas spp. oraz enteropatogenne pałeczki Escherichia coli, posiadające geny eaeA (5 razy), szczep Clostridium difficile, posiadający gen kodujący toksynę B (2 razy) oraz enteroagregacyjne pałeczki Escherichia coli posiadające gen aggR 1 (1 raz). Grupę najrzadziej diagnozowanych patogenów stanowiły helminty. Łącznie zidentyfikowano je w 3 przypadkach, w tym Enterobius vermicularis (2 razy) oraz Enterocytozoon spp./Encephalitozoon spp.
PEŁNA TREŚĆ ARTYKUŁU
---
Autorzy opracowania:
dr. hab. Monika Dmitrzak-Węglarz
Kierownik Laboratorium Diagnostyki Molekularnej genXone SA
mgr Anna Brylak-Błaszków
Diagnosta Laboratoryjny Laboratorium Diagnostyki Molekularnej genXone SA
dr Karol Szeszko
Diagnosta Laboratoryjny Laboratorium Diagnostyki Molekularnej genXone SA
Przegląd Gastroenterologiczny
