Odwracalność włóknienia u chorych na przewlekłe wirusowe zapalenie wątroby typu C. Cechy morfologiczne i ich ewolucja
Autor: Mariusz Bryl
Data: 22.08.2017
Źródło: Hepatologia 2017/ MB
Proces włóknienia jest odpowiedzią organizmu na przewlekłe uszkodzenia wątroby wywołane przez różne czynniki, np. wirusy hepatotropowe, czynniki toksyczne, zaburzenia metaboliczne i procesy autoimmunologiczne. Do niedawna uważano, że proces włóknienia w przewlekłym zapaleniu wątroby typu C (PZW typu C) jest nieodwracalny. Włączenie do leczenia preparatów interferonu z rybawiryną, a obecnie leków przeciwwirusowych nie tylko zwiększyło znacznie odsetek pacjentów, u których zahamowano patologiczną przebudowę miąższu wątroby, lecz także pozwoliło na uaktywnienie procesów regeneracji i regresji włóknienia. W poniższym artykule przedstawiono obecny stan wiedzy na temat mechanizmów związanych z procesem regresji włóknienia wątroby i cechy morfologiczne, jakie mu towarzyszą. Omówiono ewolucję pojawiania się cech morfologicznych zespołu reparacyjnego wątroby w zależności od wartości ekspresji transformującego czynnika wzrostu w bioptatach wątroby u pacjentów z PZW typu C.
WSTĘP
Włóknienie wątroby jest procesem związanym z zaburzeniem dynamicznej równowagi pomiędzy syntezą a degradacją prawidłowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (extracellular matrix – ECM) [1, 2]. Skutkiem tego jest odkładanie się kolagenu w miejscach martwicy i tworzenie się blizn łącznotkankowych (tzw. gojenie per secundam), w przeciwieństwie do pełnej regeneracji hepatocytów i naprawy macierzy pozakomórkowej, które prowadzą do całkowitej regeneracji wątroby bez pozostawienia śladu (gojenie per primam). W prawidłowej wątrobie znajduje się 2–3 γ kolagenu na 100 γ wysuszonej i pozbawionej tłuszczu tkanki. Zwiększenie ilości kolagenu powyżej tej wartości określa się jako patologiczne włóknienie [3].
Proces włóknienia jest odpowiedzią organizmu na przewlekłe uszkodzenie wątroby wywołane przez różne czynniki, np. wirusy hepatotropowe, czynniki toksyczne, zaburzenia metaboliczne i procesy autoimmunologiczne [4]. Każda przewlekła choroba wątroby może powodować włóknienie, którego końcowym stadium jest marskość i trwała niewydolność wątroby [5].
Na rycinie 1 przedstawiono schematycznie czynniki mające wpływ na ewolucję procesu włóknienia wątroby.
PATOGENEZA WŁÓKNIENIA
Włóknienie wątroby jako skutek procesów zapalno-martwiczych nie jest procesem ciągłym, ale ma okresy przyspieszenia, zwolnienia, a nawet braku postępu. W patogenezie włóknienia wątroby bierze udział wiele typów komórek [komórki gwiaździste (hepatic stellate cells – HSCs), komórki Kupffera, hepatocyty, komórki nabłonka przewodów żółciowych i komórki śródbłonka naczyń zatokowych] oraz składniki macierzy pozakomórkowej (kolagen, glikoproteiny i proteoglikany) [6–11]. W procesie powstawania przęseł włóknistych odkładają się i gromadzą wczesne depozyty molekularne macierzy pozakomórkowej w przestrzeniach Dissego, powstaje rozplem śródbłonka naczyniowego, co prowadzi do kapilaryzacji zatok i zaburzenia funkcji wątroby. Molekularne mechanizmy włóknienia wątroby nie są w pełni poznane. Rozwój tkanki łącznej w wątrobie charakteryzuje proliferacja niektórych komórek i gromadzenie się składników macierzy pozakomórkowej, co wymaga udziału wielu mediatorów, w tym cytokin, czynników wzrostowych, do których należą: płytkowy czynnik wzrostu (platelet derived growth factor – PDGF), nabłonkowy czynnik wzrostu (epidermal growth factor – EGF), czynnik wzrostu fibroblastów (fibroblast growth factor – FGF), insulinopodobny czynnik wzrostu (insulin-like growth factor – IGF), transformujący czynnik wzrostu (transforming growth factor – TGF-) oraz interleukiny 1, 4, 6 (IL-1, IL-4, IL-6) [11, 12]. Czynnikiem inicjującym proces włóknienia jest niedotlenienie, które uruchamia neoangiogenezę i proliferację komórek śródbłonka oraz indukuje aktywację i ewolucję HSCs do komórek o fenotypie miofibroblastów. Te aktywne i proliferujące komórki wydzielają TGF-1. Transformujący czynnik wzrostu 1 jest również syntetyzowany przez komórki Kupffera i komórki śródbłonka naczyń zatokowych, które dodatkowo pobudzają HSCs i syntezę macierzy zewnątrzkomórkowej [13]. Pobudzone HSCs odpowiadają także za zwiększoną produkcję aktyny mięśni gładkich, która stymuluje wytwarzanie kolagenu. Innym czynnikiem wpływającym na aktywność HSCs jest wydzielana przez komórki Kupffera metaloproteinaza macierzy pozakomórkowej 9 (matrix metaloproteinase 9 – MMP-9), która powoduje syntezę kolagenu poprzez indukcję TGF- [14, 15]. Kolejnym czynnikiem aktywującym przemianę HSCs do aktywnej postaci miofibroblastów jest aktywny proces zapalny, objawiający się naciekami zapalnymi złożonymi z limfocytów i neutrofilów, które wydzielają na drodze parakrynnej i autokrynnej cytokiny powodujące włóknienie. Transformujący czynnik wzrostu 1 pobudza komórki mezenchymalne do syntezy innych substancji macierzy komórkowej, takich jak prokolagen I i III, fibronektyna oraz laminina. Należy także pamiętać o niektórych adipokinach, które są także czynnikami aktywującymi HSCs, a tym samym stymulującymi włóknienie wątroby. Leptyna, której stężenie wzrasta w przewlekłych chorobach wątroby, jest dotychczas najlepiej poznaną adipokiną. Ekspresja receptorów dla tej adipokiny na HSCs wzrasta wraz ze stopniem ich aktywacji [16]. Leptyna syntetyzowana jest głównie przez adipocyty, a jej poziom jest proporcjonalny do masy tkanki tłuszczowej i znacznie wzrasta u pacjentów z otyłością brzuszną, insulinoopornością i cukrzycą. Wydzielane przez komórki Kupffera reaktywne cząsteczki tlenu (reactive oxygen species – ROS) to następny czynnik stymulujący aktywność HSCs i syntezę kolagenu [17]. Dodatkowo dochodzi do zmniejszenia syntezy tlenku azotu przez HSCs i komórki Kupffera, który ma działanie przeciwne do stymulującego działania ROS. Czynnikiem odpowiedzialnym za końcowy efekt procesu włóknienia wątroby i stabilizację włókien tkanki łącznej, a także nowo powstałych naczyń krwionośnych wątroby jest TGF-1. Opisywana jest zależność pomiędzy stężeniem TGF-1 w tkance wątroby i stężeniem tej cytokiny w surowicy. Stwierdzono również zależność pomiędzy stężeniem TGF-1 w surowicy i w tkance wątroby a stopniem zaawansowania włóknienia i zasięgiem stłuszczenia [18–21].
DEGRADACJA MACIERZY ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
Istnieją dwa rodzaje degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej w wątrobie: pierwsza to rozerwanie macierzy o małej gęstości w prawidłowej wątrobie (patologiczna degradacja macierzy), natomiast druga – degradacja nadmiaru tkanki włóknistej, która pomaga w odbudowie prawidłowej architektoniki uszkodzonej wątroby (rekonstruktywna degradacja macierzy). W określanej jako patologiczna degradacja macierzy komórkowej wczesnej degradacji macierzy prawidłowego śródbłonka biorą udział MMP-2 (żelatyna za A) i MMP-9 (żelatynaza B). Powodują one degradację kolagenu IV. Stromielizyna 1 przyczynia się do degradacji proteoglikanów i glikoprotein. MMP-1 jest przypuszczalnie główną proteazą, która degraduje kolagen typu 1 (główny kolagen występujący we włóknieniu wątroby).
ODWRACALNOŚĆ WŁÓKNIENIA POPRZEZ APOPTOZĘ AKTYWNYCH KOMÓREK GWIAŹDZISTYCH
Są dwie możliwości zahamowania aktywności HSCs, które wynikają z obserwacji doświadczalnych w ostrym uszkodzeniu wątroby, gdzie podczas odbudowy zniszczonych tkanek obserwuje się zmniejszenie liczby HSCs. Jedną z nich jest odwracalność (zablokowanie) aktywacji tych komórek, a drugą – ich apoptoza [22]. W modelu doświadczalnym u szczurów stwierdzono nasiloną apoptozę HSCs po użyciu gliotoksyny, która jest toksyną wydzielaną przez niektóre grzyby [23].
ROLA BIOPSJI WĄTROBY W OCENIE AKTYWNOŚCI I ZASIĘGU WŁÓKNIENIA
Biopsja wątroby, czyli ocena histopatologiczna, była do niedawna złotym standardem niezbędnym do oceny zaawansowania włóknienia i jego dystrybucji przed kwalifikacją do leczenia w przebiegu przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu B i C (PZW typu B i C). Za pomocą skali ilościowej można oceniać w bioptatach wątroby stopień aktywności zapalnej (grading) oraz zasięg włóknienia i przebudowę architektoniki narządu (staging) wg różnych skal półilościowych [24–26]. Inną metodą jest oznaczanie procentowej powierzchni kolagenu w bioptatach za pomocą analizy cyfrowej obrazu z zastosowaniem metod morfometrycznych [27, 28]. Obecne standardy nie nakazują obligatoryjnej oceny procesu włóknienia w czasie leczenia na podstawie analizy histopatologicznej. Jednak biopsja wątroby okazuje się najlepszą formą zarówno dokładnego monitorowania, jak i oceny dynamiki włóknienia w PZW typu C [29, 30]. Niestety nie istnieje system i klasyfikacja histopatologiczna oceniająca ilościowo zaawansowanie cech morfologicznych regresji włóknienia.
OBSERWACJE KLINICZNE DOTYCZĄCE ODWRACALNOŚCI WŁÓKNIENIA
Przez wiele lat uważano, że włóknienie wątroby i jej marskość jest procesem nieodwracalnym, i szczególną uwagę poświęcano zahamowaniu patologicznej przebudowy miąższu wątroby. Obecnie wykazano zarówno na modelach zwierzęcych, jak i u ludzi, że marskość wątroby jest odwracalna w niektórych przypadkach, po usunięciu przyczyny, która ją wywołała [31–33]. W wielu doniesieniach potwierdzono istnienie regresji włóknienia pod wpływem skutecznego leczenia przeciwwirusowego [34, 35]. Włóknienie musi być zastąpione przez proces regeneracji nowo formujących się hepatocytów, co prowadzi do odtworzenia normalnej architektoniki zrazikowej wątroby. Istnieją trzy warunki zaistnienia zjawiska regresji włóknienia. Pierwszym warunkiem jest trawienie włókien kolagenowych, które zostaje uruchomione poprzez wydzielanie i aktywność MMPs. Drugi warunek regresji włóknienia to powstanie regeneracji miąższu po zatrzymaniu procesu zapalnego jako wczesnej odpowiedzi na leczenie. Wiek pacjenta, zasięg martwicy oraz liczba cykli regeneracyjnych określają potencjał regeneracyjny. W dokonanej marskości zanikowej potencjał regeneracyjny maleje, a odwracalność włóknienia jest niemożliwa. Trzecim bardzo ważnym i restrykcyjnym warunkiem jest przemiana budowy guzkowej w struktury prawidłowych zrazików [36]. Nowe przestrzenie wrotne powstają po zaniknięciu włóknienia, jednak ten proces jest niemożliwy u chorych z zakrzepicą w krążeniu wrotnym lub centralnym [37]. Zaskakującymi wynikami były doniesienia pojedynczych autorów, w których stwierdzono, że poprawa histopatologiczna dotycząca zmniejszenia zasięgu włóknienia dotyczyła nie tylko pacjentów z trwałą odpowiedzią na leczenie i eliminacją HCV, lecz także chorych, u których mimo intensywnej terapii przeciwwirusowej nie uzyskano zadowalających wyników i zahamowania replikacji wirusa [18, 34, 38].
W ostatnich latach opublikowano niewiele badań dotyczących odwracalności włóknienia wątroby w PZW typu C. Być może jest to spowodowane faktem, że obecnie biopsja wątroby nie jest już złotym standardem w ocenie zasięgu włóknienia i analizę morfologiczną zastąpiły nieinwazyjne metody, takie jak elastografia. Nieinwazyjne metody wyeliminowały czynniki ryzyka wystąpienia powikłań po biopsji, są bardziej użyteczne w długotrwałej obserwacji przebiegu włóknienia u pacjentów z PZW typu C [39, 40]. W metaanalizie obejmującej 6 doniesień z udziałem 137 pacjentów z marskością wątroby po skutecznej terapii pegylowanym interferonem i rybawiryną regresję włóknienia stwierdzono u 73 (53%) pacjentów, chociaż zakres procentowany występowania regresji włóknienia wynosił 24–83%. Regresja włóknienia była definiowana jako zmniejszenie zasięgu poniżej F3 w skali METAVIR lub Ishaka. Autorzy stwierdzili trzykrotny wzrost szansy na wystąpienie zjawiska cofania się marskości u chorych z trwałą odpowiedzią na leczenie (sustained virologic response – SVR). Regresja włóknienia jest mniej prawdopodobna u chorych z zaawansowanymi klinicznie objawami marskości lub w marskości dokonanej [41, 42].
MORFOLOGICZNE CECHY REGRESJI WŁÓKNIENIA
Cechy morfologiczne regresji włóknienia zostały opisane przez Wanlessa i wsp. nazwane zespołem reparacyjnym wątroby [3]. W skład tych cech wchodzą: delikatne perforowane przęsła włókniste, izolowane grube włókna kolagenowe, delikatne okołowrotne kolce włókniste tworzące układy promieniste, resztki niepełnych przestrzeni wrotnych, resztki żył wątrobowych z wypadającymi hepatocytami, przęsła poprzedzielane przez hepatocy, małe guzki regeneracyjne, osamotnione żyły. Delikatne perforowane przęsła włókniste to przęsła niekompletne o liniowym, najczęściej zagiętym kształcie. Izolowane grube włókna kolagenowe to grube wiązki kolagenu położone w zrazikach bez łączności z przestrzeniami wrotnymi. Okołowrotne układy promieniste są tworzone przez włókna o promienistym przebiegu wychodzące poza przestrzenie wrotne, lecz bez kontaktu z innymi przestrzeniami wrotnymi i żyłami centralnymi w zrazikach. Resztkowe utkanie żył z wypadającymi hepatocytami to żyły mające w swoim świetle pojedyncze hepatocyty. Przęsła włókniste poprzedzielane hepatocytami są przęsłami włóknistymi zawierającymi grupy dwóch lub więcej hepatocytów znajdujących się poza przestrzenią wrotną rozdzielających włókna kolagenowe. Małe guzki regeneracyjne stanowią skupiska hepatocytów zawierające nie więcej niż 10 komórek, zmieszane z drobnymi regenerującymi przewodzikami żółciowymi. Osamotnione nieprawidłowe żyły to żyły położone w zrazikach blisko przestrzeni wrotnych. Resztki przestrzeni wrotnych to przestrzenie zawierające kilka elementów, takich jak tętniczka, której nie towarzyszą przewody żółciowe lub przewody bez towarzyszącej tętniczki. W tych przestrzeniach nie ma żyły wrotnej. W resztkowej przestrzeni wrotnej mniej jest kolagenu strukturalnego w porównaniu z prawidłową przestrzenią wrotną w zdrowej wątrobie.
Istnieje niewiele badań analizujących wpływ różnych czynników na cechy morfologiczne zespołu reparacyjnego. W badaniu Radłowskiego oceniano wpływ czynników epidemiologicznych, takich jak płeć, wiek, wskaźnik masy ciała (body mass index – BMI), czas trwania choroby, na występowanie morfologicznych cech regresji włóknienia w PZW typu C [43]. W badaniu wzięło udział 70 pacjentów (40 mężczyzn i 30 kobiet) z PZW typu C, u których po zakończeniu leczenia interferonem i rybawiryną w czasie 6–12 miesięcy wykonano kontrolną biopsję wątroby. Oceniono morfologiczne cechy regresji włóknienia w zależności od wartości indeksu regresji włóknienia oraz wykonano analizę związku ekspresji TGF-1 w zrazikach i przestrzeniach wrotnych z cechami morfologicznymi regresji włóknienia.
Poszukiwanie parametrów świadczących o procesie regresji włóknienia wątroby obejmowało ocenę jakościową oraz półilościową występowania następujących cech: zanikające perforowane przęsła kolagenowe, izolowane grube wiązki kolagenu, okołowrotne układy promieniste włókien kolagenu, nieprawidłowe osamotnione żyły w zrazikach, kolce włókniste okołowrotne bez łączności z przestrzeniami wrotnymi i żyłami centralnymi. Kolejnym zagadnieniem było wprowadzenie pojęcia współczynnika regresji włóknienia jako zmiany wartości punktowych zasięgu włóknienia uzyskanej po zakończeniu leczenia.
U chorych, u których wystąpiła regresja włóknienia, obserwowano zmniejszenie wartości ekspresji TGF-1 w czasie zanikania włóknienia. U chorych w początkowej fazie regresji (redukcja wartości współczynnika o 1 pkt) najwyższe wartości obserwowano w przestrzeniach wrotnych, natomiast u chorych w późniejszej fazie regresji (zmniejszenie współczynnika o 2 pkt) najwyższe wartości ekspresji TGF-1 występowały w zrazikach. Analiza wartości indeksu ekspresji TGF-1 w zależności od częstości występowania poszczególnych cech morfologicznych regresji włóknienia wykazała, że ekspresja TGF-1 w przestrzeniach wrotnych korelowała dodatnio z częstością występowania układów promienistych włókien kolagenowych. W związku z tym układy promieniste okołowrotne są wczesną cechą zanikania włókien kolagenowych. Dodatkowo regresja włóknienia wątroby była związana ze zmniejszeniem BMI w trakcie leczenia. U mężczyzn stwierdzono mniejszy współczynnik regresji włóknienia, co przejawiało się statystycznie istotnie rzadszym występowaniem układów promienistych włókien kolagenowych. Starszy wiek (50–70 lat) korelował z mniejszymi wartościami współczynnika regresji włóknienia i częstym występowaniem samotnych żył jako jednej z cech regresji włóknienia. Zmniejszenie aktywności aminotransferazy alaninowej (AlAT) w trakcie leczenia korelowało pozytywnie z częstym występowaniem nieprawidłowych samotnych żył. Płeć, wiek, czas trwania choroby i wartości aktywności AlAT przed leczeniem nie były czynnikami, które miały wpływ na występowanie zjawiska regresji włóknienia.
Poglądy naukowców dotyczące odwracalności włóknienia ewoluowały wraz z postępem w leczeniu PZW typu C. Początkowo uważano, że występowanie regresji włóknienia wątroby nie jest możliwe. Następnie uznano zakażenie w starszym wieku (po 40. roku życia), czas trwania choroby, wiek, płeć męską, nadwagę i otyłość za czynniki, które mają niekorzystny wpływ na odwracalność procesu włóknienia. Powyższe czynniki można określić jako „czynniki własne” chorego wpływające znacznie na dynamikę włóknienia. Istotne znaczenie dla uzyskania jak najlepszych wyników leczenia ma utrata masy ciała w trakcie leczenia [26, 44]. Piche i wsp. przypisują bardzo dużą rolę zmniejszeniu wartości BMI, co wiąże się z redukcją stężenia leptyny w surowicy, a to bezpośrednio może się przekładać na zwiększenie efektywności procesu regresji włóknienia [45].
Podsumowując – najwcześniejszą cechą morfologiczną dokonującej się regresji włóknienia jest obecność w bioptatach układów promienistych włókien kolagenowych wokół przestrzeni wrotnych i obecność grubych osamotnionych wiązek kolagenu. Występowanie tych dwóch cech koreluje z dużymi wartościami indeksu ekspresji TGF-1. Indeks ekspresji TGF-1 zależy od fazy regresji włóknienia ocenianej na podstawie indeksu punktowego. Jest on wysoki we wczesnej fazie regresji włóknienia i maleje w miarę zanikania włóknienia w przestrzeniach wrotnych, a następnie w zrazikach. Nie można wykluczyć, że poziom TGF-1 zmniejsza się wraz z pojawianiem się regresji włóknienia, ponieważ u pacjentów, którzy zareagowali na leczenie przeciwwirusowe, stwierdzono zmniejszenie wartości poziomu tej cytokiny w surowicy [46]. W dostępnym piśmiennictwie dotychczas nie ma innych badań analizujących cechy morfologiczne, jakie mogą się pojawić w czasie regresji włóknienia u chorych z PZW typu C.
Procesowi remodelowania macierzy pozakomórkowej towarzyszy kolonizacja obszarów włóknistych przez nowe hepatocyty. Guzki regeneracyjne po zaniku przęseł włóknistych, które je otaczały, tworzą kompleksy makroguzków, w których znajdują się liczne hiperplastyczne hepatocyty, położone w pobliżu resztek przęseł kolagenowych. W tych kompleksach regeneracyjnych powstają nowe jednostki mikrokrążenia z udziałem głównie tętniczek. Szerokie przęsła włókniste są kompletną barierą dla normalnego funkcjonowania miąższu wątroby. Delikatne przęsła włókniste pozwalają na komunikowanie się pomiędzy sąsiednimi populacjami hepatocytów. Te populacje hepatocytów mogą przekraczać barierę tkanki włóknistej, jeżeli przęsło zostanie zdegradowane przez enzymy proteolityczne. Istnieje pewne continuum histologicznej budowy wątroby od marskości drobnoguzkowej, mieszanej do wielkoguzkowej, którą Wanless nazwał konglomeratem regeneracyjnym, aż po niekompletną przęsłową marskość, która czasami jest wczesnym stadium odwracalności marskości. Często rozpoznawana przez patomorfologów niekompletna przęsłowa marskość jest wynikiem regresji włóknienia i powinna być oceniana jako zanikająca marskość. Istotne dla zrozumienia procesu regresji włóknienia jest ustalenie, ile miejsc włóknienia miąższu wątroby może powrócić do normalnej budowy. Potencjalnym czynnikiem mającym wpływ na odwracalność włóknienia jest czas trwania marskości, ponieważ długi okres rozwoju włókien kolagenowych wpływa na mniejszą ich wrażliwość na degradację przez MMPs. Duża masa włókien tworzących blizny także wiąże się z ich mniejszą wrażliwością na działanie enzymów degradujących kolagen. Celem leczenia chorych z zaawansowanym stadium włóknienia lub marskością powinno być zwalczanie pierwotnej choroby wątroby lub dążenie do zmniejszenia gromadzenia się włókien kolagenowych tworzących bliznowate obszary w miąższu wątroby.
RACJONALNE I POTENCJALNE KIERUNKI LECZENIA PROWADZĄCEGO DO REGRESJI WŁÓKNIENIA
Wczesne rozpoznanie przyczyny i leczenie pierwotnej choroby zapobiegające dalszemu uszkodzeniu wątroby.
Utrzymywanie odpowiedniej masy ciała i unikanie czynników mogących przyspieszać progresję włóknienia.
Zmniejszenie nacieków zapalnych i odpowiedzi własnej immunologicznej na działanie aktywowanych HSCs.
Bezpośrednie oddziaływanie na zmniejszenie pobudzenia HSCs.
Neutralizowanie proproliferacyjnej, prowłóknieniowej i prozapalnej reaktywności HSCs.
Stymulowanie apoptozy komórek gwiaździstych.
Wzrost degradacji macierzy blizny łącznotkankowej poprzez stymulowanie komórek produkujących proteazy macierzy pozakomórkowej oraz obniżenie aktywności jej inhibitorów.
Konieczne są dalsze badania analizujące występowanie poszczególnych cech morfologicznych pojawiających się na kolejnych etapach cofania się włóknienia. Funkcjonujący powszechnie schemat myślenia oceniającego fibroplazję kolagenową jedynie jako proces postępujący jest przestarzały. Należy odejść od definicji pojęcia marskości jako procesu nieodwracalnego, ponieważ istnieją potwierdzone fakty świadczące o odwracalności tego zjawiska. Badania naukowe z zastosowaniem powtarzanych biopsji wątroby mogą prowadzić do opracowania skali oceny morfologicznej regresji włóknienia opartej na cechach zdefiniowanego i cytowanego wcześniej zespołu reparacyjnego wątroby.
Andrzej Gabriel1, Paweł Radłowski2, Michał Kukla3
Katedra i Zakład Histologii i Embriologii w Zabrzu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Włóknienie wątroby jest procesem związanym z zaburzeniem dynamicznej równowagi pomiędzy syntezą a degradacją prawidłowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (extracellular matrix – ECM) [1, 2]. Skutkiem tego jest odkładanie się kolagenu w miejscach martwicy i tworzenie się blizn łącznotkankowych (tzw. gojenie per secundam), w przeciwieństwie do pełnej regeneracji hepatocytów i naprawy macierzy pozakomórkowej, które prowadzą do całkowitej regeneracji wątroby bez pozostawienia śladu (gojenie per primam). W prawidłowej wątrobie znajduje się 2–3 γ kolagenu na 100 γ wysuszonej i pozbawionej tłuszczu tkanki. Zwiększenie ilości kolagenu powyżej tej wartości określa się jako patologiczne włóknienie [3].
Proces włóknienia jest odpowiedzią organizmu na przewlekłe uszkodzenie wątroby wywołane przez różne czynniki, np. wirusy hepatotropowe, czynniki toksyczne, zaburzenia metaboliczne i procesy autoimmunologiczne [4]. Każda przewlekła choroba wątroby może powodować włóknienie, którego końcowym stadium jest marskość i trwała niewydolność wątroby [5].
Na rycinie 1 przedstawiono schematycznie czynniki mające wpływ na ewolucję procesu włóknienia wątroby.
PATOGENEZA WŁÓKNIENIA
Włóknienie wątroby jako skutek procesów zapalno-martwiczych nie jest procesem ciągłym, ale ma okresy przyspieszenia, zwolnienia, a nawet braku postępu. W patogenezie włóknienia wątroby bierze udział wiele typów komórek [komórki gwiaździste (hepatic stellate cells – HSCs), komórki Kupffera, hepatocyty, komórki nabłonka przewodów żółciowych i komórki śródbłonka naczyń zatokowych] oraz składniki macierzy pozakomórkowej (kolagen, glikoproteiny i proteoglikany) [6–11]. W procesie powstawania przęseł włóknistych odkładają się i gromadzą wczesne depozyty molekularne macierzy pozakomórkowej w przestrzeniach Dissego, powstaje rozplem śródbłonka naczyniowego, co prowadzi do kapilaryzacji zatok i zaburzenia funkcji wątroby. Molekularne mechanizmy włóknienia wątroby nie są w pełni poznane. Rozwój tkanki łącznej w wątrobie charakteryzuje proliferacja niektórych komórek i gromadzenie się składników macierzy pozakomórkowej, co wymaga udziału wielu mediatorów, w tym cytokin, czynników wzrostowych, do których należą: płytkowy czynnik wzrostu (platelet derived growth factor – PDGF), nabłonkowy czynnik wzrostu (epidermal growth factor – EGF), czynnik wzrostu fibroblastów (fibroblast growth factor – FGF), insulinopodobny czynnik wzrostu (insulin-like growth factor – IGF), transformujący czynnik wzrostu (transforming growth factor – TGF-) oraz interleukiny 1, 4, 6 (IL-1, IL-4, IL-6) [11, 12]. Czynnikiem inicjującym proces włóknienia jest niedotlenienie, które uruchamia neoangiogenezę i proliferację komórek śródbłonka oraz indukuje aktywację i ewolucję HSCs do komórek o fenotypie miofibroblastów. Te aktywne i proliferujące komórki wydzielają TGF-1. Transformujący czynnik wzrostu 1 jest również syntetyzowany przez komórki Kupffera i komórki śródbłonka naczyń zatokowych, które dodatkowo pobudzają HSCs i syntezę macierzy zewnątrzkomórkowej [13]. Pobudzone HSCs odpowiadają także za zwiększoną produkcję aktyny mięśni gładkich, która stymuluje wytwarzanie kolagenu. Innym czynnikiem wpływającym na aktywność HSCs jest wydzielana przez komórki Kupffera metaloproteinaza macierzy pozakomórkowej 9 (matrix metaloproteinase 9 – MMP-9), która powoduje syntezę kolagenu poprzez indukcję TGF- [14, 15]. Kolejnym czynnikiem aktywującym przemianę HSCs do aktywnej postaci miofibroblastów jest aktywny proces zapalny, objawiający się naciekami zapalnymi złożonymi z limfocytów i neutrofilów, które wydzielają na drodze parakrynnej i autokrynnej cytokiny powodujące włóknienie. Transformujący czynnik wzrostu 1 pobudza komórki mezenchymalne do syntezy innych substancji macierzy komórkowej, takich jak prokolagen I i III, fibronektyna oraz laminina. Należy także pamiętać o niektórych adipokinach, które są także czynnikami aktywującymi HSCs, a tym samym stymulującymi włóknienie wątroby. Leptyna, której stężenie wzrasta w przewlekłych chorobach wątroby, jest dotychczas najlepiej poznaną adipokiną. Ekspresja receptorów dla tej adipokiny na HSCs wzrasta wraz ze stopniem ich aktywacji [16]. Leptyna syntetyzowana jest głównie przez adipocyty, a jej poziom jest proporcjonalny do masy tkanki tłuszczowej i znacznie wzrasta u pacjentów z otyłością brzuszną, insulinoopornością i cukrzycą. Wydzielane przez komórki Kupffera reaktywne cząsteczki tlenu (reactive oxygen species – ROS) to następny czynnik stymulujący aktywność HSCs i syntezę kolagenu [17]. Dodatkowo dochodzi do zmniejszenia syntezy tlenku azotu przez HSCs i komórki Kupffera, który ma działanie przeciwne do stymulującego działania ROS. Czynnikiem odpowiedzialnym za końcowy efekt procesu włóknienia wątroby i stabilizację włókien tkanki łącznej, a także nowo powstałych naczyń krwionośnych wątroby jest TGF-1. Opisywana jest zależność pomiędzy stężeniem TGF-1 w tkance wątroby i stężeniem tej cytokiny w surowicy. Stwierdzono również zależność pomiędzy stężeniem TGF-1 w surowicy i w tkance wątroby a stopniem zaawansowania włóknienia i zasięgiem stłuszczenia [18–21].
DEGRADACJA MACIERZY ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ
Istnieją dwa rodzaje degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej w wątrobie: pierwsza to rozerwanie macierzy o małej gęstości w prawidłowej wątrobie (patologiczna degradacja macierzy), natomiast druga – degradacja nadmiaru tkanki włóknistej, która pomaga w odbudowie prawidłowej architektoniki uszkodzonej wątroby (rekonstruktywna degradacja macierzy). W określanej jako patologiczna degradacja macierzy komórkowej wczesnej degradacji macierzy prawidłowego śródbłonka biorą udział MMP-2 (żelatyna za A) i MMP-9 (żelatynaza B). Powodują one degradację kolagenu IV. Stromielizyna 1 przyczynia się do degradacji proteoglikanów i glikoprotein. MMP-1 jest przypuszczalnie główną proteazą, która degraduje kolagen typu 1 (główny kolagen występujący we włóknieniu wątroby).
ODWRACALNOŚĆ WŁÓKNIENIA POPRZEZ APOPTOZĘ AKTYWNYCH KOMÓREK GWIAŹDZISTYCH
Są dwie możliwości zahamowania aktywności HSCs, które wynikają z obserwacji doświadczalnych w ostrym uszkodzeniu wątroby, gdzie podczas odbudowy zniszczonych tkanek obserwuje się zmniejszenie liczby HSCs. Jedną z nich jest odwracalność (zablokowanie) aktywacji tych komórek, a drugą – ich apoptoza [22]. W modelu doświadczalnym u szczurów stwierdzono nasiloną apoptozę HSCs po użyciu gliotoksyny, która jest toksyną wydzielaną przez niektóre grzyby [23].
ROLA BIOPSJI WĄTROBY W OCENIE AKTYWNOŚCI I ZASIĘGU WŁÓKNIENIA
Biopsja wątroby, czyli ocena histopatologiczna, była do niedawna złotym standardem niezbędnym do oceny zaawansowania włóknienia i jego dystrybucji przed kwalifikacją do leczenia w przebiegu przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu B i C (PZW typu B i C). Za pomocą skali ilościowej można oceniać w bioptatach wątroby stopień aktywności zapalnej (grading) oraz zasięg włóknienia i przebudowę architektoniki narządu (staging) wg różnych skal półilościowych [24–26]. Inną metodą jest oznaczanie procentowej powierzchni kolagenu w bioptatach za pomocą analizy cyfrowej obrazu z zastosowaniem metod morfometrycznych [27, 28]. Obecne standardy nie nakazują obligatoryjnej oceny procesu włóknienia w czasie leczenia na podstawie analizy histopatologicznej. Jednak biopsja wątroby okazuje się najlepszą formą zarówno dokładnego monitorowania, jak i oceny dynamiki włóknienia w PZW typu C [29, 30]. Niestety nie istnieje system i klasyfikacja histopatologiczna oceniająca ilościowo zaawansowanie cech morfologicznych regresji włóknienia.
OBSERWACJE KLINICZNE DOTYCZĄCE ODWRACALNOŚCI WŁÓKNIENIA
Przez wiele lat uważano, że włóknienie wątroby i jej marskość jest procesem nieodwracalnym, i szczególną uwagę poświęcano zahamowaniu patologicznej przebudowy miąższu wątroby. Obecnie wykazano zarówno na modelach zwierzęcych, jak i u ludzi, że marskość wątroby jest odwracalna w niektórych przypadkach, po usunięciu przyczyny, która ją wywołała [31–33]. W wielu doniesieniach potwierdzono istnienie regresji włóknienia pod wpływem skutecznego leczenia przeciwwirusowego [34, 35]. Włóknienie musi być zastąpione przez proces regeneracji nowo formujących się hepatocytów, co prowadzi do odtworzenia normalnej architektoniki zrazikowej wątroby. Istnieją trzy warunki zaistnienia zjawiska regresji włóknienia. Pierwszym warunkiem jest trawienie włókien kolagenowych, które zostaje uruchomione poprzez wydzielanie i aktywność MMPs. Drugi warunek regresji włóknienia to powstanie regeneracji miąższu po zatrzymaniu procesu zapalnego jako wczesnej odpowiedzi na leczenie. Wiek pacjenta, zasięg martwicy oraz liczba cykli regeneracyjnych określają potencjał regeneracyjny. W dokonanej marskości zanikowej potencjał regeneracyjny maleje, a odwracalność włóknienia jest niemożliwa. Trzecim bardzo ważnym i restrykcyjnym warunkiem jest przemiana budowy guzkowej w struktury prawidłowych zrazików [36]. Nowe przestrzenie wrotne powstają po zaniknięciu włóknienia, jednak ten proces jest niemożliwy u chorych z zakrzepicą w krążeniu wrotnym lub centralnym [37]. Zaskakującymi wynikami były doniesienia pojedynczych autorów, w których stwierdzono, że poprawa histopatologiczna dotycząca zmniejszenia zasięgu włóknienia dotyczyła nie tylko pacjentów z trwałą odpowiedzią na leczenie i eliminacją HCV, lecz także chorych, u których mimo intensywnej terapii przeciwwirusowej nie uzyskano zadowalających wyników i zahamowania replikacji wirusa [18, 34, 38].
W ostatnich latach opublikowano niewiele badań dotyczących odwracalności włóknienia wątroby w PZW typu C. Być może jest to spowodowane faktem, że obecnie biopsja wątroby nie jest już złotym standardem w ocenie zasięgu włóknienia i analizę morfologiczną zastąpiły nieinwazyjne metody, takie jak elastografia. Nieinwazyjne metody wyeliminowały czynniki ryzyka wystąpienia powikłań po biopsji, są bardziej użyteczne w długotrwałej obserwacji przebiegu włóknienia u pacjentów z PZW typu C [39, 40]. W metaanalizie obejmującej 6 doniesień z udziałem 137 pacjentów z marskością wątroby po skutecznej terapii pegylowanym interferonem i rybawiryną regresję włóknienia stwierdzono u 73 (53%) pacjentów, chociaż zakres procentowany występowania regresji włóknienia wynosił 24–83%. Regresja włóknienia była definiowana jako zmniejszenie zasięgu poniżej F3 w skali METAVIR lub Ishaka. Autorzy stwierdzili trzykrotny wzrost szansy na wystąpienie zjawiska cofania się marskości u chorych z trwałą odpowiedzią na leczenie (sustained virologic response – SVR). Regresja włóknienia jest mniej prawdopodobna u chorych z zaawansowanymi klinicznie objawami marskości lub w marskości dokonanej [41, 42].
MORFOLOGICZNE CECHY REGRESJI WŁÓKNIENIA
Cechy morfologiczne regresji włóknienia zostały opisane przez Wanlessa i wsp. nazwane zespołem reparacyjnym wątroby [3]. W skład tych cech wchodzą: delikatne perforowane przęsła włókniste, izolowane grube włókna kolagenowe, delikatne okołowrotne kolce włókniste tworzące układy promieniste, resztki niepełnych przestrzeni wrotnych, resztki żył wątrobowych z wypadającymi hepatocytami, przęsła poprzedzielane przez hepatocy, małe guzki regeneracyjne, osamotnione żyły. Delikatne perforowane przęsła włókniste to przęsła niekompletne o liniowym, najczęściej zagiętym kształcie. Izolowane grube włókna kolagenowe to grube wiązki kolagenu położone w zrazikach bez łączności z przestrzeniami wrotnymi. Okołowrotne układy promieniste są tworzone przez włókna o promienistym przebiegu wychodzące poza przestrzenie wrotne, lecz bez kontaktu z innymi przestrzeniami wrotnymi i żyłami centralnymi w zrazikach. Resztkowe utkanie żył z wypadającymi hepatocytami to żyły mające w swoim świetle pojedyncze hepatocyty. Przęsła włókniste poprzedzielane hepatocytami są przęsłami włóknistymi zawierającymi grupy dwóch lub więcej hepatocytów znajdujących się poza przestrzenią wrotną rozdzielających włókna kolagenowe. Małe guzki regeneracyjne stanowią skupiska hepatocytów zawierające nie więcej niż 10 komórek, zmieszane z drobnymi regenerującymi przewodzikami żółciowymi. Osamotnione nieprawidłowe żyły to żyły położone w zrazikach blisko przestrzeni wrotnych. Resztki przestrzeni wrotnych to przestrzenie zawierające kilka elementów, takich jak tętniczka, której nie towarzyszą przewody żółciowe lub przewody bez towarzyszącej tętniczki. W tych przestrzeniach nie ma żyły wrotnej. W resztkowej przestrzeni wrotnej mniej jest kolagenu strukturalnego w porównaniu z prawidłową przestrzenią wrotną w zdrowej wątrobie.
Istnieje niewiele badań analizujących wpływ różnych czynników na cechy morfologiczne zespołu reparacyjnego. W badaniu Radłowskiego oceniano wpływ czynników epidemiologicznych, takich jak płeć, wiek, wskaźnik masy ciała (body mass index – BMI), czas trwania choroby, na występowanie morfologicznych cech regresji włóknienia w PZW typu C [43]. W badaniu wzięło udział 70 pacjentów (40 mężczyzn i 30 kobiet) z PZW typu C, u których po zakończeniu leczenia interferonem i rybawiryną w czasie 6–12 miesięcy wykonano kontrolną biopsję wątroby. Oceniono morfologiczne cechy regresji włóknienia w zależności od wartości indeksu regresji włóknienia oraz wykonano analizę związku ekspresji TGF-1 w zrazikach i przestrzeniach wrotnych z cechami morfologicznymi regresji włóknienia.
Poszukiwanie parametrów świadczących o procesie regresji włóknienia wątroby obejmowało ocenę jakościową oraz półilościową występowania następujących cech: zanikające perforowane przęsła kolagenowe, izolowane grube wiązki kolagenu, okołowrotne układy promieniste włókien kolagenu, nieprawidłowe osamotnione żyły w zrazikach, kolce włókniste okołowrotne bez łączności z przestrzeniami wrotnymi i żyłami centralnymi. Kolejnym zagadnieniem było wprowadzenie pojęcia współczynnika regresji włóknienia jako zmiany wartości punktowych zasięgu włóknienia uzyskanej po zakończeniu leczenia.
U chorych, u których wystąpiła regresja włóknienia, obserwowano zmniejszenie wartości ekspresji TGF-1 w czasie zanikania włóknienia. U chorych w początkowej fazie regresji (redukcja wartości współczynnika o 1 pkt) najwyższe wartości obserwowano w przestrzeniach wrotnych, natomiast u chorych w późniejszej fazie regresji (zmniejszenie współczynnika o 2 pkt) najwyższe wartości ekspresji TGF-1 występowały w zrazikach. Analiza wartości indeksu ekspresji TGF-1 w zależności od częstości występowania poszczególnych cech morfologicznych regresji włóknienia wykazała, że ekspresja TGF-1 w przestrzeniach wrotnych korelowała dodatnio z częstością występowania układów promienistych włókien kolagenowych. W związku z tym układy promieniste okołowrotne są wczesną cechą zanikania włókien kolagenowych. Dodatkowo regresja włóknienia wątroby była związana ze zmniejszeniem BMI w trakcie leczenia. U mężczyzn stwierdzono mniejszy współczynnik regresji włóknienia, co przejawiało się statystycznie istotnie rzadszym występowaniem układów promienistych włókien kolagenowych. Starszy wiek (50–70 lat) korelował z mniejszymi wartościami współczynnika regresji włóknienia i częstym występowaniem samotnych żył jako jednej z cech regresji włóknienia. Zmniejszenie aktywności aminotransferazy alaninowej (AlAT) w trakcie leczenia korelowało pozytywnie z częstym występowaniem nieprawidłowych samotnych żył. Płeć, wiek, czas trwania choroby i wartości aktywności AlAT przed leczeniem nie były czynnikami, które miały wpływ na występowanie zjawiska regresji włóknienia.
Poglądy naukowców dotyczące odwracalności włóknienia ewoluowały wraz z postępem w leczeniu PZW typu C. Początkowo uważano, że występowanie regresji włóknienia wątroby nie jest możliwe. Następnie uznano zakażenie w starszym wieku (po 40. roku życia), czas trwania choroby, wiek, płeć męską, nadwagę i otyłość za czynniki, które mają niekorzystny wpływ na odwracalność procesu włóknienia. Powyższe czynniki można określić jako „czynniki własne” chorego wpływające znacznie na dynamikę włóknienia. Istotne znaczenie dla uzyskania jak najlepszych wyników leczenia ma utrata masy ciała w trakcie leczenia [26, 44]. Piche i wsp. przypisują bardzo dużą rolę zmniejszeniu wartości BMI, co wiąże się z redukcją stężenia leptyny w surowicy, a to bezpośrednio może się przekładać na zwiększenie efektywności procesu regresji włóknienia [45].
Podsumowując – najwcześniejszą cechą morfologiczną dokonującej się regresji włóknienia jest obecność w bioptatach układów promienistych włókien kolagenowych wokół przestrzeni wrotnych i obecność grubych osamotnionych wiązek kolagenu. Występowanie tych dwóch cech koreluje z dużymi wartościami indeksu ekspresji TGF-1. Indeks ekspresji TGF-1 zależy od fazy regresji włóknienia ocenianej na podstawie indeksu punktowego. Jest on wysoki we wczesnej fazie regresji włóknienia i maleje w miarę zanikania włóknienia w przestrzeniach wrotnych, a następnie w zrazikach. Nie można wykluczyć, że poziom TGF-1 zmniejsza się wraz z pojawianiem się regresji włóknienia, ponieważ u pacjentów, którzy zareagowali na leczenie przeciwwirusowe, stwierdzono zmniejszenie wartości poziomu tej cytokiny w surowicy [46]. W dostępnym piśmiennictwie dotychczas nie ma innych badań analizujących cechy morfologiczne, jakie mogą się pojawić w czasie regresji włóknienia u chorych z PZW typu C.
Procesowi remodelowania macierzy pozakomórkowej towarzyszy kolonizacja obszarów włóknistych przez nowe hepatocyty. Guzki regeneracyjne po zaniku przęseł włóknistych, które je otaczały, tworzą kompleksy makroguzków, w których znajdują się liczne hiperplastyczne hepatocyty, położone w pobliżu resztek przęseł kolagenowych. W tych kompleksach regeneracyjnych powstają nowe jednostki mikrokrążenia z udziałem głównie tętniczek. Szerokie przęsła włókniste są kompletną barierą dla normalnego funkcjonowania miąższu wątroby. Delikatne przęsła włókniste pozwalają na komunikowanie się pomiędzy sąsiednimi populacjami hepatocytów. Te populacje hepatocytów mogą przekraczać barierę tkanki włóknistej, jeżeli przęsło zostanie zdegradowane przez enzymy proteolityczne. Istnieje pewne continuum histologicznej budowy wątroby od marskości drobnoguzkowej, mieszanej do wielkoguzkowej, którą Wanless nazwał konglomeratem regeneracyjnym, aż po niekompletną przęsłową marskość, która czasami jest wczesnym stadium odwracalności marskości. Często rozpoznawana przez patomorfologów niekompletna przęsłowa marskość jest wynikiem regresji włóknienia i powinna być oceniana jako zanikająca marskość. Istotne dla zrozumienia procesu regresji włóknienia jest ustalenie, ile miejsc włóknienia miąższu wątroby może powrócić do normalnej budowy. Potencjalnym czynnikiem mającym wpływ na odwracalność włóknienia jest czas trwania marskości, ponieważ długi okres rozwoju włókien kolagenowych wpływa na mniejszą ich wrażliwość na degradację przez MMPs. Duża masa włókien tworzących blizny także wiąże się z ich mniejszą wrażliwością na działanie enzymów degradujących kolagen. Celem leczenia chorych z zaawansowanym stadium włóknienia lub marskością powinno być zwalczanie pierwotnej choroby wątroby lub dążenie do zmniejszenia gromadzenia się włókien kolagenowych tworzących bliznowate obszary w miąższu wątroby.
RACJONALNE I POTENCJALNE KIERUNKI LECZENIA PROWADZĄCEGO DO REGRESJI WŁÓKNIENIA
Wczesne rozpoznanie przyczyny i leczenie pierwotnej choroby zapobiegające dalszemu uszkodzeniu wątroby.
Utrzymywanie odpowiedniej masy ciała i unikanie czynników mogących przyspieszać progresję włóknienia.
Zmniejszenie nacieków zapalnych i odpowiedzi własnej immunologicznej na działanie aktywowanych HSCs.
Bezpośrednie oddziaływanie na zmniejszenie pobudzenia HSCs.
Neutralizowanie proproliferacyjnej, prowłóknieniowej i prozapalnej reaktywności HSCs.
Stymulowanie apoptozy komórek gwiaździstych.
Wzrost degradacji macierzy blizny łącznotkankowej poprzez stymulowanie komórek produkujących proteazy macierzy pozakomórkowej oraz obniżenie aktywności jej inhibitorów.
Konieczne są dalsze badania analizujące występowanie poszczególnych cech morfologicznych pojawiających się na kolejnych etapach cofania się włóknienia. Funkcjonujący powszechnie schemat myślenia oceniającego fibroplazję kolagenową jedynie jako proces postępujący jest przestarzały. Należy odejść od definicji pojęcia marskości jako procesu nieodwracalnego, ponieważ istnieją potwierdzone fakty świadczące o odwracalności tego zjawiska. Badania naukowe z zastosowaniem powtarzanych biopsji wątroby mogą prowadzić do opracowania skali oceny morfologicznej regresji włóknienia opartej na cechach zdefiniowanego i cytowanego wcześniej zespołu reparacyjnego wątroby.
Andrzej Gabriel1, Paweł Radłowski2, Michał Kukla3
Katedra i Zakład Histologii i Embriologii w Zabrzu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Przegląd Gastroenterologiczny
